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响应面法优化提取黑籽南瓜黄酮类化合物及其抗炎活性的研究

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食品科技 2022年第5期47卷 238-245页

作者：尉松瑶高冷高晓晨李航孙尧杨佳园王兴玥赵丽华长春工业大学化学与生命科学学院吉林长春130012 长春中医药大学吉林省人参科学研究院吉林长春130117 长春金荷药业有限公司吉林长春130600

以黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia Bouché)作为原材料,采用超声波辅助法提取黑籽南瓜黄酮类化合物,利用响应面法优化提取工艺,高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS/MS)对黑籽南瓜黄酮类化合物进行成分分析并评价其抗炎活性。结果表明,当... 详细信息

以黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia Bouché)作为原材料,采用超声波辅助法提取黑籽南瓜黄酮类化合物,利用响应面法优化提取工艺,高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS/MS)对黑籽南瓜黄酮类化合物进行成分分析并评价其抗炎活性。结果表明,当料液比1:20 g/mL、乙醇体积分数70%、超声时间50 min、超声功率250 W时,黑籽南瓜黄酮类化合物的提取率最高,为3.531%;HPLC-MS/MS结果表明,黑籽南瓜黄酮类化合物主要有6种,分别为金丝桃苷、芦丁、大波斯菊苷(芹菜素-7-O-葡萄糖苷)、槲皮素、木犀草素-7-O-葡萄糖甙、甲基条叶蓟素(3-甲氧基蓟黄素),通过对各峰面积积分可知槲皮素含量最高,占黄酮类化合物总含量的45%;黑籽南瓜黄酮类化合物能够有效抑制脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)产生炎症因子一氧化氮(NO)和前列腺素E_(2)(PGE_(2)),证明其具有抗炎活性。

关键词：黑籽南瓜黄酮类化合物响应面法高效液相色谱-质谱联用抗炎活性

两种类型黑籽南瓜响应枯萎病菌浸染的转录组学研究

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两种类型黑籽南瓜响应枯萎病菌浸染的转录组学研究

作者：李海玉云南农业大学

学位级别：硕士

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia Bouche)是一年生或多年生瓜类作物,对瓜类枯萎病具有较强的抗病能力,作为嫁接砧木能有效控制瓜类枯萎病的发生和危害。中国是世界瓜类的主要生产国,而枯萎病是影响瓜类产量和品质主要病害之一。通常发生... 详细信息

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia Bouche)是一年生或多年生瓜类作物,对瓜类枯萎病具有较强的抗病能力,作为嫁接砧木能有效控制瓜类枯萎病的发生和危害。中国是世界瓜类的主要生产国,而枯萎病是影响瓜类产量和品质主要病害之一。通常发生在瓜类的主栽区,导致瓜类减产20%～60%。课题组前期以白皮、绿皮花纹黑籽南瓜为材料,接种枯萎病菌并对光合作用、过氧化物酶和氧化伤害物质含量以及NBS类抗病基因片段HQRGA2表达变化进行研究,发现绿皮花纹黑籽南瓜抗性最强,但该两种材料在病菌浸染抗性响应的机制还未阐明,为明晰白皮和绿皮花纹2种黑籽南瓜对枯萎病菌侵染抗性响应机制。本研究以白皮和绿皮花纹2种黑籽南瓜为材料,对等量无菌水处理2 d和枯萎病菌浸染2 d后的两种黑籽南瓜叶片进行RNA提取并利用Illumina Hiseq 2500测序平台进行转录组测序,经过数据整理、GO富集和KEGG富集分析,并结合代谢通路响应机制预测和QRT-PCR验证明晰了相关差异表达基因及调控通路,为黑籽南瓜抗病机制研究奠定了基础。主要研究结果如下:(1)黑籽南瓜转录组测序通过转录组测序数据,拼接得到的unigenes总长度为166218177 bp,平均长度为1441 bp,GC含量为42.11%,将Unigene和NR、SWISSPROT、KOG、GO和KEGG数据库进行比对,共有89196条Unigene(76.36%)获得生物信息学注释结果,有42394条unigene(47.53%)能比对到甜瓜基因组,有33832条unigene(37.93%)能比对到黄瓜基因组。(2)枯萎病菌胁迫下的2种黑籽南瓜差异表达基因分析通过接种后2 d的2种黑籽南瓜处理的差异表达基因进行功能注释和代谢通路富集,并采用QRT-PCR验证结果表明,转录组测序结果较为可靠。结果显示:(1)所获得unigene共有65571条被富集到25个分子功能家族。一般功能预测(General function prediction only)富集基因数最多,为12247条,防御机制(defense mechanisms)富集基因数最少,为578条。(2)接菌后2 d的处理:白皮(b2d1-vs-b2ck)和绿皮花纹(h2d1-vs-h2ck)2种黑籽南瓜差异表达基因分别为2082、1116个。有141个基因在2种黑籽南瓜中均呈现出表达差异。其中具有相同的表达趋势(持续上调或持续下调)有62个,31个持续上调表达,31个持续下调表达。(3)Pathway富集分析显示,接种2d后白皮黑籽南瓜的差异表达基因均显著的富集在植物激素信号转导(ko04075)和碳代谢(ko01200)等抗病相关代谢途径;与白皮黑籽南瓜不同之处在于绿皮花纹黑籽南瓜激活了苯丙烷生物合成(ko00940)、淀粉和蔗糖代谢(ko00500)和光合成(ko00195)等次生代谢产物合成。(3)2种黑籽南瓜转录组GO富集分析将白皮和绿皮花纹黑籽南瓜中具有相同表达趋势的差异表达基因BLAST到GO数据库并分别比对到GO条目上,结果发现富集在生物学过程(BF)差异表达基因数量最多,其次是分子功能(MF),富集基因最少的是细胞组分(CC)。其中,在生物过程、细胞成分和分子功能这几个类别中,富集基因数量最多的条目分别为代谢过程(metabolic process)、细胞组分(cell part)、结合(binding)和催化活性(catalytic activity)等。对共同差异表达基因的GO富集分析发现,在被显著富集的GO term中,27条属于生物学过程,有9条与代谢过程有关,还有12条与植物激素信号转导等有关;28条属于分子功能,其中有14条跟酶活性有关,11条与结合有关;7条属于细胞组分,包括细胞器及细胞器成分。综上所述,植物激素信号转导和酶活性富集基因数最多,推测可能由枯萎病菌胁迫引起。(4)2种黑籽南瓜转录组KEGG富集分析将白皮和绿皮花纹黑籽南瓜的差异表达基因进行KEGG pathway分析,使用超几何检验的方法,通过显著性分析发现既有共同富集途径也有不同富集的途径:共同显著富集途径为络氨酸(ko00350),甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,该途径中酪氨酸是以一种生物合成的前体参与到反应中,丝氨酸乙醛酸氨基转移酶(SAGT)基因AGXT下调表达,造成过氧化氢(HO)积累;丝、甘和苏氨酸代谢途径中,AGXT2基因在黑籽南瓜叶片中上调表达可促进黑籽南瓜植株生长发育,推测该途径与抗病性并无直接关联。不同富集途径分别为白皮显著富集的植物激素信号转导(ko04075)途径和绿皮花纹富集的苯丙烷生物合成途径(ko00940)。白皮处理的植物信号转导途径中ABA通过Sn RK2上调表达激活SAUR、GH3家族基因的表达导致植物体内ABA含量累积上升,促进气孔关闭,从而增强植株抗病性。JA和SA作为重要的信号分子,通过JAZ蛋白

关键词：黑籽南瓜尖孢镰刀菌抗病机制转录组分析差异表达基因

NaCl胁迫对黑籽南瓜和西葫芦种子萌发影响的对比研究

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农业工程学报 2005年第Z2期21卷 96-98页

作者：王广印韩世栋赵一鹏河南科技学院园林学院新乡453003 潍坊职业学院潍坊261041

用不同浓度的N aC l胁迫处理黑籽南瓜和西葫芦种子,观察其发芽情况,计算发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数,进行对比分析。结果表明,黑籽南瓜种子萌发对盐水生境的适应性比西葫芦强,黑籽南瓜种子萌发的N aC l胁迫浓度适宜值为50.66 mm... 详细信息

用不同浓度的N aC l胁迫处理黑籽南瓜和西葫芦种子,观察其发芽情况,计算发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数,进行对比分析。结果表明,黑籽南瓜种子萌发对盐水生境的适应性比西葫芦强,黑籽南瓜种子萌发的N aC l胁迫浓度适宜值为50.66 mm o l/L,而西葫芦为43.98 mm o l/L。

关键词：黑籽南瓜西葫芦种子萌发 NaCl胁迫

黑籽南瓜NBS类抗病基因的鉴别及关键基因分析

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植物生理学报 2020年第9期56卷 1833-1844页

作者：丁玉梅高婷暴会会谢俊俊姚春馨周晓罡侯思名杨正安云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所昆明650205 云南省农业生物技术重点实验室昆明650205 昆明学院农学与生命科学学院昆明650214 云南农业大学园林园艺学院昆明650201

以云南栽培的枯萎病抗病品种绿皮黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)为材料,采用二代转录组和全长转录组测序相结合的方法,对黑籽南瓜NBS类抗病基因进行鉴别和筛选。结果显示:以NB-ARC作为参考氨基酸序列,共鉴定了43条CfNBS(NBS-type gene f... 详细信息

以云南栽培的枯萎病抗病品种绿皮黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)为材料,采用二代转录组和全长转录组测序相结合的方法,对黑籽南瓜NBS类抗病基因进行鉴别和筛选。结果显示:以NB-ARC作为参考氨基酸序列,共鉴定了43条CfNBS(NBS-type gene from C.ficifolia)类基因全长序列,分属于TNL、CNL、TN、RPW8-N和N类5个亚基因家族,典型的TNL和CNL类分别有2个和13个。系统进化树分析表明,CfNBS类基因可以分为4大类群,黑籽南瓜的NBS类抗病基因数量较少但其基因进化类型比其他瓜类物种丰富。与二代转录组进行比对,筛选获得11个差异表达的黑籽南瓜NBS类关键基因,包括4个抗病蛋白、2个蛋白激酶、2个TMV抗性蛋白和3个未知功能蛋白,qRT-PCR分析表明有10个Cf NBS类关键基因在枯萎病菌接种后48和96 h出现上调或下调表达,可能参与了黑籽南瓜对枯萎病菌侵染不同时间点的抗病应答过程。11个CfNBS类关键基因的GO(Gene Ontology)功能富集分析表明,其涉及的生物学过程显著富集在防卫反应、谷胱甘肽转运、改良氨基酸转运等10条GO条目中,涉及分子功能富集在ADP结合、受体丝氨酸/苏氨酸激酶结合、细胞壁结构成分3个GO条目中。而富集通路最多的是与TMV抗性蛋白同源的2个基因(CL19588contig1和CL21402contig1),说明这2个基因在抗病应答过程中起到了重要作用。11个CfNBS类关键基因qRT-PCR组织表达特异性分析表明,在根、茎、叶和果实中表达量最高的基因分别是CL34065Contig1、CL52011Contig1、CL6035Contig1和CL19588Contig1。以上结果可为开展黑籽南瓜NBS类抗病基因的克隆和功能验证,以及解析黑籽南瓜响应枯萎病菌胁迫的抗性应答机制提供参考。

关键词：黑籽南瓜枯萎病转录组 NBS类基因 qRT-PCR

黑籽南瓜中NBS类抗病基因同源序列的克隆与表达分析

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农业生物技术学报 2018年第8期26卷 1305-1317页

作者：丁玉梅高婷仲莎姚春馨周晓罡杨正安张兴国西南大学园艺园林学院云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所云南省农业生物技术重点实验室云南农业大学园林园艺学院

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)是云南特有的对病害有较强抗性的一种瓜类作物。为发掘利用其蕴含的优异抗病基因资源,本研究根据已克隆到的植物核苷酸结合位点(nucleotide binding site,NBS)类抗病基因的保守氨基酸结构域基因设计简并引... 详细信息

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)是云南特有的对病害有较强抗性的一种瓜类作物。为发掘利用其蕴含的优异抗病基因资源,本研究根据已克隆到的植物核苷酸结合位点(nucleotide binding site,NBS)类抗病基因的保守氨基酸结构域基因设计简并引物,通过PCR扩增从黑籽南瓜基因组中分离了8条黑籽南瓜抗病基因同源序列(resistance gene analogous,RGAs),聚类分析和相似性比较结果显示,黑籽南瓜抗病基因同源序列2(black seed squash resistance gene analogous 2,HQRGA2(Gen Bank No.:MG946756)单独为一类,且具有核苷酸结合衔接子(nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1,R proteins and CED-4;NBARC)结构,其余7条序列均不具有NBS保守结构域。核苷酸相似性分析表明,HQRGA2与部分抗病基因序列的相似性达到87%99%,其中与南瓜(Cucurbita maschata)NBS类抗病蛋白基因13(squash resistance gene analogous,SQRGA-13)和SQRGA-8的相似性分别达到98.0%和97.0%。对HQRGA2编码的氨基酸保守结构域分析表明,其含有NBS类抗病基因的4个保守模块:P-loop、Kinase-2、Kinase-3a和GLPL区,且属于无Toll蛋白或白介素1受体类似的NBS富亮氨酸重复(non toll/interleukin-1 receptor like of NBS plus leucine-rich region,non-TIR-NBS-LRR)类抗病基因同源序列。HQRGA2编码氨基酸的同源性分析结果表明,其与南瓜抗病蛋白基因SQRGA-13氨基酸同源性较高,达到96.6%,与其余抗病基因同源性在16.6%43.8%之间,NBS区域氨基酸系统进化树分析结果表明,HQRGA2可能是一个新的抗病基因片段。q RTPCR分析表明,黑籽南瓜HQRGA2片段的表达受尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的胁迫诱导,表现出先扬后抑的表达模式,说明HQRGA2可能为抗病相关基因片段。黑籽南瓜中NBS类抗病基因同源序列HQRGA2的获得为分离克隆其完整抗病基因提供了新线索。

关键词：黑籽南瓜核苷酸结合位点(NBS)类基因保守结构域 qRT-PCR

NaCl胁迫对中国杂交南瓜和黑籽南瓜幼苗生长的影响

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农业工程学报 2007年第7期23卷 202-205页

作者：周俊国朱月林刘正鲁王建国南京农业大学园艺学院

在组织培养条件下,对中国南瓜杂交种和黑籽南瓜的幼苗分别进行不同NaCl浓度(0、40、80、120、160、200、240mmol/L)胁迫处理,10 d后调查不同处理单株幼苗的下胚轴长度、鲜质量、干质量和盐害程度。结果表明,360-3×112-2杂交种和黑籽南... 详细信息

在组织培养条件下,对中国南瓜杂交种和黑籽南瓜的幼苗分别进行不同NaCl浓度(0、40、80、120、160、200、240mmol/L)胁迫处理,10 d后调查不同处理单株幼苗的下胚轴长度、鲜质量、干质量和盐害程度。结果表明,360-3×112-2杂交种和黑籽南瓜在幼苗期存在明显的耐盐性差异,360-3×112-2杂交种耐盐性比黑籽南瓜强,360-3×112-2的最高耐盐浓度是160 mmol/L,黑籽南瓜的最高耐盐浓度是120 mmol/L,其耐盐性具有较大的利用价值。

关键词：组培中国南瓜黑籽南瓜幼苗耐盐性

黑籽南瓜NBS类基因CfRFN2的克隆及VIGS验证

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西北植物学报 2021年第5期41卷 727-737页

作者：丁玉梅侯思名姚春馨杨加珍谢俊俊曾亚文杨正安云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所昆明650205 云南省农业生物技术重点实验室昆明650205 昆明学院农学与生命科学学院昆明650214 云南农业大学园林园艺学院昆明650201

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)是云南特有的具有高抗枯萎病遗传性状的瓜类种质资源。为鉴定黑籽南瓜中NBS-LRR类基因的抗病功能,该研究从其叶片中克隆了NBS类基因CfRFN 2(GenBank ID:MK618462),测序全长为4303 bp,完整的编码框长度为40... 详细信息

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)是云南特有的具有高抗枯萎病遗传性状的瓜类种质资源。为鉴定黑籽南瓜中NBS-LRR类基因的抗病功能,该研究从其叶片中克隆了NBS类基因CfRFN 2(GenBank ID:MK618462),测序全长为4303 bp,完整的编码框长度为4092 bp,编码1363个氨基酸残基,该基因注释为拟南芥抗病蛋白At4g27190类转录体X1的同源基因,含有1个NB-ARC和2个LRR结构域,属于具有信号肽的可溶性蛋白。核苷酸相似性分析显示,CfRFN 2与其他瓜类NBS类基因相似性在87%~98%之间;系统进化树分析表明,CfRFN2蛋白和瓜类的其他NBS类抗病蛋白聚为一个分支,其中CfRFN2蛋白与中国南瓜和美洲南瓜的RPS2、印度南瓜的RPS2-like亲缘关系最近,其次是黄瓜的At4g27190和苦瓜的At4g27220,与甜瓜的Atg27190亲缘关系相对较远;组织表达特性分析表明,CfRFN 2基因在黑籽南瓜叶片中表达量最高,其次是茎,而在果皮和根中表达量较低。该研究采用烟草脆裂病毒载体系统,构建了黑籽南瓜VIGS沉默载体pTRV2-CfRFN 2,含沉默载体的农杆菌侵染黑籽南瓜幼苗后接种枯萎病菌,qRT-PCR检测表明,接种后2 d和4 d的转pTRV2-CfRFN 2沉默组植株的CfRFN 2基因表达量比接种后同时期的野生型植株显著降低(分别下降34.75%和98.27%),病情指数增加为野生型的1.32倍,初步证明黑籽南瓜CfRFN 2基因具有抗枯萎病的功能,推测该基因可能在黑籽南瓜抗枯萎病防御过程中发挥着重要作用。该研究中NBS类基因CfRFN2的克隆和VIGS验证为黑籽南瓜更多优异基因的克隆和功能验证奠定了前期基础,也为发掘黑籽南瓜优异抗病基因和开展瓜类分子育种提供新信息。

关键词：黑籽南瓜 NBS类基因枯萎病基因克隆病毒诱导的基因沉默(VIGS)

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黑籽南瓜根提取物对黄瓜体内某些物质的影响

华北农学报 2005年第F12期20卷 36-38页

作者：孙鸿举李铎马立国刘杰才云兴福白永泉内蒙古农业学校内蒙古呼和浩特010070 北京市监狱管理局清河分局柳林监狱北京300481 内蒙古农业大学农学院内蒙古呼和浩特010018 巴彦淖尔市农牧业局内蒙古临河015000

分别用蒸馏水、乙醇和乙醚3种溶液提取黑籽南瓜幼苗根内物质,于黄瓜幼苗期(第一真叶宽5cm时及其后第七天)进行叶面喷施处理2次,以3种空白溶液为对照,试验结果表明:叶片和根中的总糖含量高于ck,除乙醇提取液处理试验结果外,其他处理差异... 详细信息

分别用蒸馏水、乙醇和乙醚3种溶液提取黑籽南瓜幼苗根内物质,于黄瓜幼苗期(第一真叶宽5cm时及其后第七天)进行叶面喷施处理2次,以3种空白溶液为对照,试验结果表明:叶片和根中的总糖含量高于ck,除乙醇提取液处理试验结果外,其他处理差异均表现为极显著和显著水平;真叶和根内的木质素和单宁含量显著和极显著地增加。

关键词：黑籽南瓜根提取物黄瓜某些物质

枯萎病菌胁迫下3种黑籽南瓜HQRGA2表达及抗氧化酶活性差异分析

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植物生理学报 2019年第3期55卷 349-358页

作者：丁玉梅张杰谢俊俊姚春馨刘庆周晓罡周丽英杨正安张兴国西南大学园艺园林学院重庆400715 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所昆明650205 云南省农业生物技术重点实验室昆明650205 云南农业大学园林园艺学院昆明650201

以云南栽培的3个黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)品种(白皮、花皮和绿皮品种)为试材,在室内接种评价枯萎病抗性基础上,研究了3种材料受枯萎病菌胁迫后NBS抗病基因同源序列HQRGA2(GenBank登录号MG946756)的表达差异,以及活性氧产生和抗氧... 详细信息

以云南栽培的3个黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)品种(白皮、花皮和绿皮品种)为试材,在室内接种评价枯萎病抗性基础上,研究了3种材料受枯萎病菌胁迫后NBS抗病基因同源序列HQRGA2(GenBank登录号MG946756)的表达差异,以及活性氧产生和抗氧化酶活性差异。结果显示,3种黑籽南瓜HQRGA2的表达均受枯萎病菌诱导,与感病白皮品种和中抗花皮品种相比,抗病绿皮品种HQRGA2的表达水平增加迅速且持续能力强,呈增加-降低的表达特点。接种枯萎病菌后,感病品种和中抗品种■产生速率呈上升趋势,抗病品种则在侵染中后期急剧升高。感病品种和中抗品种的POD活性、MDA含量主要呈升-降-升的变化趋势,SOD活性则主要呈先升后降的变化趋势;而抗病品种的POD和SOD活性变化平稳,MDA含量呈逐步增加的趋势。枯萎病抗性与侵染早期POD和SOD活性呈负相关,与后期MDA含量呈正相关,而CAT活性与抗性并无一致性,感病品种和抗病品种的变化平稳,中抗品种表现为平稳-升高。由此表明,枯萎病菌侵染黑籽南瓜后,产生了较高水平的■,感病品种主要依赖SOD和POD,中抗品种依赖POD、SOD和CAT来清除活性氧,以增加植株的抗氧化能力。与感病品种相比,抗病品种能迅速启动并维持NBS类抗病基因序列的高量表达,其抗氧化酶可维持较高的活性水平,但对枯萎病菌胁迫不敏感。

关键词：黑籽南瓜枯萎病 NBS类基因 qRT-PCR 抗氧化酶