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黑曲霉脂肪酶的摇瓶发酵、性质及其合成月桂酸单酯的研究

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黑曲霉脂肪酶的摇瓶发酵、性质及其合成月桂酸单酯的研究

作者：邓颖颖江南大学

学位级别：硕士

脂肪酶(lipase,EC3.***.1.3)又称甘油三酯水解酶,在水相体系中具有水解特性,在非水相体系中具有酯化、转酯、胺解和醇解等特性。与化学法相比,脂肪酶催化反应具有反应过程温和、选择性好、分离纯化简单、产量高、无毒环保等特点,因此,脂... 详细信息

脂肪酶(lipase,EC3.***.1.3)又称甘油三酯水解酶,在水相体系中具有水解特性,在非水相体系中具有酯化、转酯、胺解和醇解等特性。与化学法相比,脂肪酶催化反应具有反应过程温和、选择性好、分离纯化简单、产量高、无毒环保等特点,因此,脂肪酶成为当今的研究热点。本课题从一株实验室筛选的黑曲霉菌株出发,优化了摇瓶发酵的工艺条件:在3g/L蔗糖、12g/L鱼粉蛋白胨、10g/L橄榄油、0.5g/L MgSO4·7H2O、2.0g K2HPO4·3H2O、pH7.0的培养基上于30℃下发酵培养,所产脂肪酶的酶活力可达2.7U/mL,比优化前的酶活力有很大的提高。黑曲霉脂肪酶的酶学性质研究:酶的最适pH为7.0,最适温度为45℃;在200℃和pH3.0.0区间内有较高的稳定性;此种脂肪酶的酶活受Na+,Cu,Zn影响较小,K+,Mg,Ca对酶活有促进作用,其中Ca作用较为明显,Mn,Fe存在明显的抑制作用;并且该脂肪酶具有很好的催化月桂酸和甘油合成反应的能力,可用于脂肪酸甘油酯的合成。最后,本实验对黑曲霉脂肪酶在合成单脂肪酸甘油酯方面的应用做了研究。发现此黑曲霉脂肪酶具有很好的催化活性和选择性,在无溶剂条件下可催化月桂酸和甘油直接反应生成高含量的单月桂酸甘油酯,并对反应条件进行了优化,实验表明:采用甘油月桂酸摩尔比为1:1,脂肪酶与底物质量比为0.5%,水与底物质量比为3%的条件在50℃下反应12h,可使月桂酸转化率达到91.2%,单酯含量高达70%。

关键词：黑曲霉脂肪酶发酵性质合成

黑曲霉脂肪酶基因优化设计、合成及其在酵母中的表达

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黑曲霉脂肪酶基因优化设计、合成及其在酵母中的表达

作者：李娜华中师范大学

学位级别：硕士

脂肪酶（Triacylgycerol acylhydrolase, Lipase, EC3.***.1.3）,是一类水解酶,广泛存在于植物种子,动物组织及微生物体中。能催化长链脂肪酸甘油酯水解为长链脂肪酸和甘油。黑曲霉脂肪酶是重要的工业用酶,在食品、制药及前体化合物的合... 详细信息

脂肪酶（Triacylgycerol acylhydrolase, Lipase, EC3.***.1.3）,是一类水解酶,广泛存在于植物种子,动物组织及微生物体中。能催化长链脂肪酸甘油酯水解为长链脂肪酸和甘油。黑曲霉脂肪酶是重要的工业用酶,在食品、制药及前体化合物的合成和手性化合物的拆分等方面有广泛的用途。获得高效表达黑曲霉脂肪酶的基因工程菌是该酶工业化生产的前提。本文以毕赤酵母分泌表达能提高目的蛋白表达量为研究目标,对黑曲霉脂肪酶基因进行了优化设计、合成并在毕赤酵母中进行了表达,主要工作包括以下内容： 1、根据毕赤酵母密码子的偏爱性,对已有的黑曲霉脂肪酶基因lip的带信号肽序列的基因和成熟肽基因5’端的99个氨基酸进行突变,并合成突变引物。以原有的基因为模板PCR扩增得到突变基因的序列,与pPIC9K构建重组表达载体pPIC9K-lipm和pPIC9K-lipm-27,并在毕赤酵母GS115中进行分泌表达,摇瓶水平诱导酶液经SDS-PAGE检测表明有蛋白表达,但检测其酶活性较低。 2、从Genbank已登录的黑曲霉脂肪酶基因（GenBank Accession No. DQ647700）出发,对lipA基因进行生物学分析。分析表明该基因全长1044bp,编码一个348氨基酸的多肽,其中编码成熟肽基因序列长894bp,编码298氨基酸成熟肽。其中（G+C）%含量为55.59%,密码子第三位GC碱基含量为66.1%。按P.pastoris密码子偏爱性,密码子分析显示基因中RSCU值＜0.3的密码子数量为190个,占整个基因密码子的63.7%。对lipA基因mRNA分析表明,lipA基因mRNA折叠后最小自由能△G=-293.74kcal/mol。确定优化方案设计lipA基因,并人工合成lipAm基因。根据毕赤酵母密码子偏爱性,去除黑曲霉脂肪酶基因中酵母表达低频率密码子,替换为酵母高频密码子,获得能在毕赤酵母中高效表达的黑曲霉脂肪酶基因lipAm,并在合成基因的5’端加入EcoR I酶切位点,3’端加入Not I酶切位点,以便基因转入表达载体pPIC9K中。 3、经人工合成及序列测定以后,构建了优化黑曲霉脂肪酶基因酵母表达载体pPIC9K-lipAm及pPIC9K-lipAm。经Sal I线性化后,电击转化巴斯德毕赤酵母GS115,经MD和MM平板筛选、PCR检测获得阳性重组酵母,实现了lipAm基因在酵母中的分泌表达。结果表明,摇瓶水平诱导120h后,其优化后的lipAm基因重组酵母酶活为优化前酶活的5倍。

关键词：黑曲霉脂肪酶优化设计突变脂肪酶基因合成巴斯德毕赤酵母

SBA-15固定化黑曲霉脂肪酶对柚皮苷的区域选择性酰化

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合成化学 2023年第12期31卷 925-931页

作者：姜丽艳董洪举杜映达吉林大学生命科学学院吉林长春130012

柚皮苷(Naringin)是一种天然存在的生物类黄酮,分布于较多种类的水果和蔬菜中,具有抗癌症、抗氧化和保护心血管等多种生物活性。但因其较差的生物利用率致使其深度开发和临床治疗应用面临着严重阻碍。为了提高柚皮苷的生物利用价值,采用... 详细信息

柚皮苷(Naringin)是一种天然存在的生物类黄酮,分布于较多种类的水果和蔬菜中,具有抗癌症、抗氧化和保护心血管等多种生物活性。但因其较差的生物利用率致使其深度开发和临床治疗应用面临着严重阻碍。为了提高柚皮苷的生物利用价值,采用SBA-15固定化黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase,ANL)对柚皮苷进行了酶法转化研究。系统考察了在非水相有机介质中固定化ANL催化柚皮苷酰基化反应的酶活及区域选择性的影响因素。结果表明:酰基供体、反应溶剂、水活度及反应温度对柚皮苷的酰化反应具有不同程度的影响。在最佳催化条件下,酶活最高(153±5μmol·h^(-1)·g^(-1)),酶转化率可达92.00%±2.43%,且固定化ANL对柚皮苷的C-6'位置具有区域选择性(>99%)。

关键词：柚皮苷黑曲霉脂肪酶酶的固定化区域选择性酰化反应

磁性金属—生物分子框架材料固定化黑曲霉脂肪酶及其应用研究

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磁性金属—生物分子框架材料固定化黑曲霉脂肪酶及其应用研究

作者：夏高辉华南理工大学

学位级别：硕士

对映体纯环氧化物是一类具有高附加值的有机合成中间体,在医药、农药、精细化工及食品等领域有着广泛的应用,以其作为原料能够合成许多具有价值的化合物,如光学活性材料、手性药物及杀虫剂等。在对映体纯环氧化物的合成方法中,脂肪酶催... 详细信息

对映体纯环氧化物是一类具有高附加值的有机合成中间体,在医药、农药、精细化工及食品等领域有着广泛的应用,以其作为原料能够合成许多具有价值的化合物,如光学活性材料、手性药物及杀虫剂等。在对映体纯环氧化物的合成方法中,脂肪酶催化烯烃环氧化生成环氧化物是一个新兴的研究热点,它具有高效、经济、绿色、反应条件温和、对映体选择性高等优点。本研究发现黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase,ANL)能够有效地催化环辛烯环氧化,但是在环氧化反应过程中游离脂肪酶失活现象严重且难以重复回收利用,这些缺点造成其工业生产成本较高因此难以大规模生产。为解决以上问题,提高酶的稳定性,降低其催化成本,本研究利用一种生物相容金属有机骨架材料(ZnGlu)和四氧化三铁纳米粒子(MNPs)构建而成的磁性金属-生物分子框架纳米材料(ZnGlu-MNPs)为载体对黑曲霉脂肪酶进行固定化并将其应用于催化环辛烯环氧化。本研究首次研究了磁性金属-生物分子框架纳米材料固定化黑曲霉脂肪酶,并将其酶制剂应用于高效催化环辛烯环氧化反应。本研究通过理性设计制备成一种活性高、稳定性优良、载酶量高、分离回收方便的新型纳米级酶制剂ANL@ZnGlu-MNPs。该研究有助于丰富酶的固定化技术,深化对酶-载体相互作用的认识,为制备对映体纯环氧环辛烷提供了一个新途径。本研究首先采用改进的碱共沉淀法合成了MNPs,然后利用层层静电自组装技术将ZnGlu包裹在MNPs表面,制备得到磁性金属-生物分子框架纳米材料ZnGlu-MNPs,通过扫描电镜、红外光谱、X射线衍射、热重分析和磁饱和强度等对ZnGlu-MNPs进行结构表征和成分分析,结果表明成功制备得到ZnGlu-MNPs,并且其具有较强的磁性。其次,以制备的ZnGlu-MNPs作为载体,利用载体表面ZnGlu中含有的氨基与含有游离羧基的ANL分子发生酰化反应,从而将ANL固定在ZnGlu-MNPs表面,制备得到一种活性高、稳定性高、易分离回收的新型磁性纳米级酶制剂ANL@ZnGlu-MNPs。通过对不同酶/载体质量比、pH、固定化时间对ANL@ZnGlu-MNPs酶活回收率和载酶量的影响的探究,发现在酶/载体质量比为7:10,固定化pH为7.0,固定化时间为3.5 h时,酶的负载量为118.0 mg/g,酶活回收率达到82.0%。以对硝基苯基棕榈酸酯为模型底物对游离ANL和ANL@ZnGlu-MNPs的酶学性质进行详细的研究发现:游离酶的最适pH为6.0,最适温度为35℃;而固定化酶的最适pH为7.0,最适温度为35℃;同时,由于ANL@ZnGlu-MNPs酶活性中心构象结构的刚性强于游离酶,其热稳定性、pH稳定性、溶剂稳定性都优于游离酶;酶反应动力学研究表明,ANL@ZnGlu-MNPs的Vmax/Km值为0.018 min,而游离酶的Vmax/Km值为0.014min,这表明表明固定化酶ANL@ZnGlu-MNPs具有更好的底物亲和力,在同等条件下其具有更强的催化能力。酶学性质研究表明,ANL@ZnGlu-MNPs的稳定性和催化活性均较游离ANL有所提高。本研究对ANL@ZnGlu-MNPs催化烯烃环氧化的反应进行了研究。在所选择的底物中,ANL@ZnGlu-MNPs催化环辛烯环氧化的效果较好,产率达50%以上。通过研究固定化酶ANL@ZnGlu-MNPs催化环辛烯环氧化反应中各因素对反应的影响,表明最适底物浓度为150 m M,最适温度为40°C,最适酶添加量为100 mg,最适HO加入量为4.4mmol。在上述最适条件下,反应初速度、产率和产物e.e.值分别为16.3 mM?h、56.8%和84.1%。在重复利用10次后,ANL@ZnGlu-MNPs相对活性仍超过51.6%,而且其对映体选择性几乎未受到影响。

关键词：黑曲霉脂肪酶金属-生物分子框架材料四氧化三铁纳米粒子固定化环氧化

重组黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶的培养优化、固定化及晶体初筛研究

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重组黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶的培养优化、固定化及晶体初筛研究

作者：朱若男贵州大学

学位级别：硕士

脂肪酶是一种多用途水解酶,在疏水环境中表现出优异的活性,主要从动、植物及微生物中筛选得到,可广泛应用于食品加工、精细化工、化妆品、医药工业化妆品、生物柴油生产和洗涤剂工业中。实验室前期已成功地将黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶(Asp... 详细信息

脂肪酶是一种多用途水解酶,在疏水环境中表现出优异的活性,主要从动、植物及微生物中筛选得到,可广泛应用于食品加工、精细化工、化妆品、医药工业化妆品、生物柴油生产和洗涤剂工业中。实验室前期已成功地将黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶(Aspergillus niger GZUF36 extrellular lipase,EXANL1)在毕赤酵母中进行重组表达。本论文首先对毕赤酵母重组黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶(Recombinant Aspergillus niger GZUF36 extracellular lipase expressed by Pichia pastoris,PEXANL)进行培养条件优化,以提高其酶活力,利于后续的固定化及PEXANL1纯化结晶。然后对不同固定化条件对PEXANL1的酶活力以及二级结构的影响以及固定化前后的PEXANL1酶学性质进行探究,初步进行了PEXANL1的晶体初筛,为深入分析PEXANL1的构效关系奠定基础。具体研究内容及结果如下所示:(1)探究了不同培养条件对PEXANL1的酶活力的影响,得到的最优培养条件为:当接种量为3.2%,BMMY的培养基pH为6,培养时间为4 d,甲醇添加量为1%时,此时的酶活达到33.80±0.57 U/mL,经响应面试验设计优化后得到的最优条件为:接种量为3.2%,BMMY的培养基pH为7,培养时间为5 d,甲醇添加量为1%,经验证试验,得到的PEXANL1的酶活最高为92.51±0.03 U/m L,约为初始酶活的6倍。(2)以壳聚糖-FeO磁性纳米颗粒(Chitosan-FeO magnetic nanoparticles,FeO@CS MNPs)为载体,采用了吸附-沉淀-交联固定化法高效固定化PEXANL1得到了固定化酶PEXANL1-FeO@CS MNPs。通过扫描电镜、傅里叶变换红外光谱、X射线衍射、热重分析、振动样品磁强计表征了FeO@CS MNPs的合成情况以及FeO@CS MNPs与PEXANL1的结合情况,结果表明FeO@CS MNPs合成情况良好,与PEXANL1成功地结合。探究了不同固定化条件对PEXANL1的酶活力以及二级结构的影响,在乙腈与丙酮等体积混合作为沉淀剂,载体质量125 mg,沉淀剂与酶液比例为4:1,戊二醛浓度为15 mM,交联时间为1 h的条件下,得到了酶活力最高的PEXANL1-FeO@CS MNPs,此时酶活回收率达到153.73±2.00%,固定化效率为71.55±0.77%。与游离酶相比,经吸附-沉淀-交联最优条件固定化后得到的固定化酶PEXANL1-FeO@CS MNPs的二级结构为:α-螺旋相对含量为31.29%,β-折叠相对含量为18.54%,β-转角相对含量为20.33%,无规则卷曲相对含量为29.85%,与游离酶相比,无规则卷曲含量增加了29.85%,α-螺旋、β-折叠、β-转角的相对含量分别减少了5.95%、1.66%、20.44%。(3)探究了固定化前后PEXANL1的酶学性质,结果表明游离酶的最适pH为4,而固定化酶的最适pH是3,往酸性条件偏移。PEXANL1的pH稳定性通过固定化策略有所提高,PEXANL1-FeO@CS MNPs在pH 2–10的环境下相对酶活均可达到65%以上。固定化PEXANL1的最适温度为45℃,较游离酶增加了5℃。固定化策略改变了PEXANL1的温度稳定性,PEXANL1-FeO@CS MNPs的温度稳定性比PEXANL1高。PEXANL1-FeO@CS MNPs对Zn,Fe,Fe,Na,K,Cu,Mn,Ca,Mg这九种金属离子的耐受性高于游离酶,固定化PEXANL1的有机溶剂耐受性有较大的提高,并且经过四氢呋喃、乙腈、叔丁醇、乙醚处理后的固定化酶都出现了超酶活现象。在储藏稳定性方面固定化后的PEXANL1较游离酶有明显提高。通过对PEXANL1与PEXANL1-FeO@CS MNPs的动力学参数进行测定,发现固定化提高了PEXANL1的最大反应速率(Vmax),PEXANL1的最大反应速率为10.64 mmol/L/min,PEXANL1-FeO@CS MNPs的最大反应速率(Vmax)为18.45 mmol/L/min。而PEXANL1-FeO@CS MNPs的Km值比游离酶低,说明PEXANL1经固定化后对底物的亲和力增强。对固定化酶PEXANL1-FeO@CS MNPs的可重复利用性测试,经过8次循环利用后,保持了大约50%的相对活力。(4)进行结晶条件初筛,使用8 mg/mL蛋白浓度的PEXANL1对98个结晶条件进行了筛选,经过21天的培养,出现了疑似为PEXANL1的晶体。

关键词：毕赤酵母黑曲霉脂肪酶培养优化固定化晶体初筛

黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶的异源表达、酶学性质及结构研究

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黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶的异源表达、酶学性质及结构研究

作者：蔡洋洋贵州大学

学位级别：硕士

脂肪酶是一种可以催化水解和合成反应的多功能性酶,广泛应用于各大工业。黑曲霉能够将大量蛋白质分泌到细胞外,是脂肪酶的重要生产者。先前研究发现,来自黑曲霉GZUF36菌株sn-1,3选择性胞外脂肪酶(EXANL1)在较宽pH范围内酶活保持稳定,对... 详细信息

脂肪酶是一种可以催化水解和合成反应的多功能性酶,广泛应用于各大工业。黑曲霉能够将大量蛋白质分泌到细胞外,是脂肪酶的重要生产者。先前研究发现,来自黑曲霉GZUF36菌株sn-1,3选择性胞外脂肪酶(EXANL1)在较宽pH范围内酶活保持稳定,对底物具有较高sn-1,3选择性,有良好应用价值。但黑曲霉GZUF36菌株的产酶状况不稳定,培养周期长,酶学性质还需进一步研究,从结构上对底物的选择性机制研究尚不清楚。为解决上述问题,首先,本课题以黑曲霉GZUF36菌株sn-1,3选择性胞外脂肪酶(EXANL1)为研究对象,采用融合表达的方式,实现脂肪酶EXANL1在大肠杆菌的异源表达。其次,重组表达的融合蛋白分离纯化后详细研究了脂肪酶EXANL1的酶学性质。最后,基于圆二色谱(CD)对EXANL1进行了结构表征,通过分子对接研究了EXANL1的底物选择性,使用预测结晶可能性的软件预测了EXANL1的结晶可能性大小。上述研究为EXANL1进一步工业应用的方向及三维结构研究提供了理论依据和基础。主要研究内容和结果如下:(1)脂肪酶EXANL1在大肠杆菌中的克隆表达,纯化及包涵体复性根据实验室前期报道的黑曲霉脂肪酶基因ANL(NCBI登录号:MK592411.1),成功实现编码成熟肽基因在大肠杆菌BL21中(DE3)低温下诱导的活性表达。探讨了不同条件对重组大肠杆菌表达的脂肪酶表达量的影响。结果表明,当诱导剂浓度(IPTG)为0.05 mM,OD为0.6,诱导后培养时间为20h,诱导后培养温度为16℃时,脂肪酶的比酶活最高达到3.74 U/mg,比初始培养条件提高了2.7倍。发酵上清液经过谷胱甘肽树脂和阴离子交换层析后获得了电泳纯的脂肪酶EXANL1。使用透析复性的方法进行包涵体复性,得到了具有活性的蛋白质,与未复性的包涵体溶解液相比,复性后的EXANL1酶活为8.66±0.30U/mL。(2)EXANL1的酶学性质研究酶学性质研究显示,EXANL1最适pH为4,EXANL1在pH 6-9的缓冲液中孵育48 h,相对酶活损失低于45%,说明EXANL1在酸性条件下有最适pH但在碱性条件下稳定。EXANL1的最适温度为40℃,在55℃以下的稳定性较高,说明EXANL1是一个中温脂肪酶。在40%(v:v)的有机溶剂中,EXANL1同时对极性有机溶剂丙三醇和二甲基亚砜,非极性有机溶剂正己烷和甲苯表现出强耐受性,相对酶活高于75%。EXANL1在所测的低浓度(终浓度为0.01%)表面活性剂中,相对酶活均在85%以上。EXANL1在5%(m/v)的聚乙二醇2000中,酶活依然保持稳定,而同一浓度下的其他表面活性剂均抑制EXANL1的活性。在5 mM的Cu中EXANL1出现超酶活现象而1mM的Fe已抑制酶活。底物特异性试验表明EXANL1最适底物为对硝基棕榈酸酯,却几乎不水解短链脂肪酸(C 2-C 8)。(3)底物特异性分析圆二色谱研究了不同温度下EXANL1二级结构的变化。当温度高于55℃时,α螺旋的比例显著下降。分子对接显示,脂肪酶EXANL1和其他sn-1,3选择性脂肪酶的结合口袋类似,形状如花生壳,具有两个口袋。与无显著区域选择性的其他脂肪酶的3D结构的催化口袋相比,推测口袋大小和形状的差异可能影响脂肪酶的区域选择性及对不同碳链长度的偏好性。相对于底物sn-2位置上的酯键,EXANL1催化三联体ser 173上的羟基氧与底物sn-1及sn-3上的羰基碳的距离更近,分子对接的这些结果可初步解释EXANL1是sn-1,3选择性脂肪酶。分子对接研究了EXANL1对不同链长的对硝基苯酚酯的亲和性,表明尽管脂肪酶与对硝基己酸酯的结合能最低,但是对硝基己酸酯并没有与EXANL1的催化三联体形成分子间氢键;分子对接亦显示EXANL1对对硝基棕榈酸酯的特异性最高,这与实验得到的结果吻合。结晶可能性预测软件预测EXANL1具有结晶的可能,可尝试进行进一步的结晶实验。上述研究为EXANL1的进一步工业应用的方向,底物特异性及晶体学结构研究提供了理论依据和基础。

关键词：黑曲霉脂肪酶异源表达酶学性质底物特异性大肠杆菌

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黑曲霉GZUF36脂肪酶的结构与功能研究

黑曲霉GZUF36脂肪酶的结构与功能研究

作者：邢书奇贵州大学

学位级别：硕士

脂肪酶是重要的工业酶之一,其来源、种类、结构和催化反应多种多样,因而广泛地用于食品、医药和新能源开发等领域。黑曲霉脂肪酶是使用最早的脂肪酶之一。然而,黑曲霉脂肪酶晶体结构未知,对其性质的结构基础还不清楚。因此,本文利用黑曲... 详细信息

脂肪酶是重要的工业酶之一,其来源、种类、结构和催化反应多种多样,因而广泛地用于食品、医药和新能源开发等领域。黑曲霉脂肪酶是使用最早的脂肪酶之一。然而,黑曲霉脂肪酶晶体结构未知,对其性质的结构基础还不清楚。因此,本文利用黑曲霉GZUF36菌株,逆转录PCR扩增得到一条黑曲霉GZUF36sn-1,3选择性胞外脂肪酶(EXANL1)基因,该基因分别在大肠杆菌和毕赤酵母表达,分别对其表达重组酶分离纯化和酶学性质进行深入研究,基于同源建模和小角X射线散射对毕赤酵母表达重组酶进行结构分析,这些为EXANL1进一步晶体结构解析和分子改造提供借鉴和指导。主要研究内容和结果如下:(1)EXANL1在大肠杆菌中的克隆表达、纯化及其酶学性质表征根据NCBI数据库报道的黑曲霉脂肪酶基因序列(GenBank ID:KJ703109.1),设计引物,逆转录PCR扩增得到EXANL1的编码蛋白序列,全长894 bp。生物信息学分析EXANL1基因与其他黑曲霉脂肪酶的基因序列相似性在90%以上,编码297个氨基酸,存在57 bp信号肽序列,预测蛋白成熟肽(278个氨基酸)与黑曲霉F044,黑曲霉CBE 332.1,黑曲霉CBS 513.88和黑曲霉A733脂肪酶氨基酸序列都有99%同源性,只是个别位点氨基酸有差异,其等电点为4.76,分子量为30 kDa,潜在的糖基化位点为N59、N150、N269。基于EXANL1与已知结构的氨基酸序列多重比对确定了EXANL1催化三联体(Ser173,Asp228,His285),氧阴离子洞形成氨基酸S84、L155和S154,盖子区域STVKNWIADLD。将EXANL1编码成熟肽基因克隆到大肠杆菌表达载体pET28a(+)上,转化至大肠杆菌BL21(DE3),在20℃下培养,0.1 mM IPTG诱导获得最高活性表达。利用镍柱一步纯化N-端带有6x His标签的重组酶。测定的酶学性质表明重组EXANL1的最适温度和最适pH分别为35℃和4,在55℃孵育30 min,剩余酶活只有51±3.97%,在pH 3-10孵育48 h,剩余酶活达90%。和大肠杆菌重组表达黑曲霉F044脂肪酶的酶学性质比较发现,即使个别位点氨基酸的差异也会导致其酶学性质较大的差异。(2)EXANL1的高活性表达及其详细酶学性质研究编码成熟肽的基因克隆表达至毕赤酵母中,甲醇诱导表达72 h,从发酵上清获得与野生酶相当的酶活(17.56±0.31 U/mL)。使用硫酸铵沉淀和镍柱相结合的方法从发酵上清纯化重组EXANL1,重组EXANL1由于糖基化修饰显示为两条分子量很近的条带。测定的酶学性质表明重组EXANL1的最适温度和最适pH分别为40-45℃和4,在55℃孵育1h,剩余酶活为80%,在pH 2-8孵育48 h,剩余酶活也在80%以上。底物特异性试验,表明重组EXANL1最适底物为对硝基苯基辛酸酯,暗示重组EXANL1偏爱水解中长链酯。在测试的50%有机溶剂中,重组EXANL1都比较稳定,尤其是50%正己烷中,酶活提高了6%;测试的洗涤剂(终浓度为0.01%)都促进酶活,其中吐温20提高最多,近20%。所有测试的金属离子都不激活酶,反而有些抑制酶活,尤其是Ca和Fe。重组EXANL1对橄榄油的动力学参数显示,它的Vmax为10 U/mL,Km为68 g/L。由于N端多插入氨基酸和糖基化修饰,毕赤酵母表达重组酶和原核表达的重组酶相比,最适温度和热稳定性有所增加。(3)基于同源建模和小角X射线散射(SAXS)对毕赤酵母表达重组酶的结构进行了表征基于毕赤酵母表达重组酶氨基酸序列(pEXANL1),使用Modeller 9.18多模板建模预测pEXANL1的三维结构,结果显示,模型整体结构紧凑折叠,符合α/β水解酶折叠的结构特征。通过将模型pEXANL1封闭构象与含类甘油三酯底物的TLL复合物开放时构象(PDB:5AP9＿A)的叠加,显示底物结合时盖子构象会发生变化,催化三联体Ser162-His274-Asp217处在催化裂缝中。由于组氨酸基序XXXH中X是Val,指向蛋白表面,因而pEXANL1形成三个底物结合口袋,这三个底物结合口袋分别容纳甘油三酯的三条链,同时发现甘油二酯脂肪酶X1是Phe,这导致其脂肪酶只有两个底物结合口袋,分别容纳两条羧酸链,因而只能水解甘油二酯和甘油单酯,因此,组氨酸基序决定脂肪酶的底物选择性。与配体羟甲基膦酸二乙酯(DEP)对接显示DEP与pEXANL1的Ser144、Ser145、Tyr28、His257、Trp88和Asp91形成疏水相互作用,而且DEP通过与氧阴离子洞Ser82和Leu145形成强力的氢键牢固地结合到活性中心;与配体三辛酸甘油酯对接显示三辛酸甘与pEXANL1的氨基酸残基Ser82、Gly81、Tyr28、Phe111、Pro177、Asp 91、Ser144、Ile204、Leu208、Va

关键词：黑曲霉脂肪酶异源表达酶学性质同源建模 SAXS

基于聚多巴胺的磁性纳米生物催化剂高效催化二氢杨梅素酰化（英文）

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Chinese Journal of Catalysis 2016年第4期37卷 584-595页

作者：邓啸曹诗林李宁吴虹 Thomas J.Smithd 宗敏华娄文勇华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室广东广州510640 华南理工大学食品科学与工程学院应用生物催化实验室广东广州510640 华南理工大学化学与化工学院广东广州510640 谢菲尔德哈勒姆大学生物分子科学研究中心

脂肪酶是一种三酰基甘油水解酶,目前广泛用于油脂化学、食品、有机合成和生物医药等领域.但是,游离脂肪酶在有机反应体系中容易失活,难以从反应体系中回收,导致其循环利用困难和生产成本增加.因此,需要对游离脂肪酶进行固定化,提高酶的... 详细信息

脂肪酶是一种三酰基甘油水解酶,目前广泛用于油脂化学、食品、有机合成和生物医药等领域.但是,游离脂肪酶在有机反应体系中容易失活,难以从反应体系中回收,导致其循环利用困难和生产成本增加.因此,需要对游离脂肪酶进行固定化,提高酶的稳定性和重复使用性,使其能够大规模用于工业生产.磁性四氧化三铁纳米粒子(MNPs)具有其超顺磁性和大比表面积等性质,但MNPs需表面修饰才能进一步应用.近年来,仿生矿化法制备的聚多巴胺纳米材料受到人们关注.在仿生矿化过程中,单体多巴胺经自聚合作用后形成聚多巴胺,该反应活性高,能对各类有机和无机纳米材料进行表面修饰.而且,聚多巴胺表层中的活性基团能与含有氨基和巯基的生物大分子发生迈克尔加成或席夫碱反应,从而将生物大分子固定在材料表面.本文利用聚多巴胺表面修饰MNPs,对所得聚多巴胺表面修饰的四氧化三铁纳米粒子(PD-MNPs)进行了结构表征.结果表明,PD-MNPs尺寸在14 nm左右.同时,成功将黑曲霉脂肪酶(ANL)固定在PD-MNPs上,结果显示在pH=8、固定化时间为12 h条件下,酶负载量为138 mg/g,酶活回收率达到83.6%,而且固定化酶的pH稳定性及热稳定性、储藏稳定性都优于游离酶.动力学研究表明,固定化酶Km值(63.2 mmol/L)低于游离酶(74.5 mmol/L),固定化酶的底物亲和性增强.进一步研究了固定化酶和游离酶在乙腈、二甲基亚砜、乙醇和[HMIm]BF_4这四种溶剂中的溶剂耐受性,结果显示固定化酶的耐受性均强于游离酶.采用红外光谱对游离酶和固定化酶二级结构的分析表明,游离黑曲霉脂肪酶经固定化后,α-螺旋和β-折叠含量分别增加了0.84%和2.74%,使得固定化后α-螺旋和β-折叠中存在的氢键能够更好地保持酶结构刚性,避免因结构改变而引起酶失活,增强了固定化酶在溶剂中的耐受性.二氢杨梅素是一种具有类黄酮结构的天然产物,具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤和保护肝脏等作用,但其脂溶性很差,很难透过细胞膜被人体吸收.本课题组曾首次以乙酸乙烯酯为酰基供体,采用游离脂肪酶生物催化方法成功将二氢杨梅素酰化.本文考察了PD-MNPs固定化脂肪酶在二氢杨梅素酰化反应中的应用.结果表明,与游离酶相比,固定化酶在反应介质二甲基亚砜中的耐受性更强,反应48 h后其催化二氢杨梅素酰化的转化率接近80%,明显好于游离酶(69%).固定化酶催化二氢杨梅素酰化的最适底物摩尔比、温度和酶量分别为10:1(乙酸乙烯酯:二氢杨梅素)、45 ℃,和40 U.此外,固定化酶在外界磁场作用下能迅速从反应混合物中分离,从而可回收利用,在重复使用10次后,其活性仍保持在初始活性的55%以上,具有良好的工业应用前景.

关键词：磁性四氧化三铁纳米粒子聚多巴胺黑曲霉脂肪酶二氢杨梅素酰化

高乳酸乙酯酯化酶活力菌种的筛选及在老白干三茬酒中的应用

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高乳酸乙酯酯化酶活力菌种的筛选及在老白干三茬酒中的应用

作者：刘小敏天津科技大学

学位级别：硕士

乳酸乙酯是老白干香型白酒的重要风味物质,其与乙酸乙酯共同构成了老白干白酒的主体香。随着近年来白酒机械化和清洁生产的推进,酿造环境中的乳酸菌群和酒中乳酸乙酯的含量有所下降,尤其是老白干三茬酒的乳酸乙酯和总酯含量都很低,其相... 详细信息

乳酸乙酯是老白干香型白酒的重要风味物质,其与乙酸乙酯共同构成了老白干白酒的主体香。随着近年来白酒机械化和清洁生产的推进,酿造环境中的乳酸菌群和酒中乳酸乙酯的含量有所下降,尤其是老白干三茬酒的乳酸乙酯和总酯含量都很低,其相应基酒的品质很差。本研究从老白干大曲中筛选糖化酶、蛋白酶和酯化酶等酿酒酶系活性较高的菌株应用于老白干三茬酒的生产实验中,以提高三茬酒中乳酸乙酯的含量和三茬基酒的品质;并通过基因工程育种的方法构建高产乳酸乙酯酯化酶的菌株,为酿酒用乳酸乙酯酯化酶的开发和应用打下基础。主要研究结果如下:(1)高酶活菌株的筛选。从老白干香型大曲中筛出了两株酿酒酶系活性均较高的黑曲霉菌株T2和T16,其中T2催化合成乳酸乙酯的含量最高,为1706.60mg/L,T16的糖化酶活力最高为2438.65 u/g。(2)黑曲霉脂肪酶酶学性质解析及乳酸乙酯合成条件优化。将从黑曲霉T2中挖掘出的脂肪酶基因在大肠杆菌中异源表达,得到了脂肪酶tab U和tab I,比酶活分别为48.67 U/mg和54.34 U/mg。对脂肪酶tab U和tab I进行了酶学性质解析得出,脂肪酶tab U和tab I的最适底物均为对硝基苯酚乙酸酯,其Km值分别为0.79 mmol/L和0.85 mmol/L,Vmax值分别为71.32 mmol/(m L·h)和63.75mmol/(m L·h);脂肪酶tab U和tab I的最适温度均为40℃,最适p H分别为9和8;在以叔丁醇为溶剂,乳酸浓度为1.17 mol/L,乙醇浓度为8.190 mol/L的体系中,脂肪酶tab U和tab I催化合成乳酸乙酯的含量分别为8.08 mg/L和13.75 mg/L,对脂肪酶tab I合成乳酸乙酯的条件做了进一步的优化,优化后在酸醇比为1:3.75,温度为40℃、反应时间为12 h的条件下,乳酸乙酯的合成量达210.24 mg/L;在以水为溶剂,乳酸浓度为5 g/L,体积分数为20%的乙醇体系中,调节反应液p H为6时,脂肪酶tab U催化合成乳酸乙酯的含量为7.96 mg/L,调节反应液p H为8时,脂肪酶tab I催化合成乳酸乙酯的含量为5.12 mg/L,在此条件下,脂肪酶tab U和tab I均在水相中表现出催化合成能力。本研究对高产乳酸乙酯酯化酶的开发和应用奠定了基础。(3)高酶活菌株在老白干三茬酒中的应用。将酿酒酶系活性较高的菌株应用于老白干三茬酒的生产实验中,确定了最佳糖化剂是麸曲T16,最佳酵母为△por,酸性蛋白酶的最适添加量为4 u/g醅,最适加粮比例为1:6,最佳蒸粮时间为15 min,10天为最佳发酵时间。在此发酵条件下,酒醅中的酒精度为7.5%v/v,酒醅里出现了11.26 mg/L的乙酸异戊酯,乙酸乙酯的含量提高了32.12倍,乳酸乙酯的含量提高了1.97倍,总酯含量提高了2.3倍。

关键词：老白干香型酒乳酸乙酯黑曲霉脂肪酶转录组分析大肠杆菌表达系统