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禽致病性大肠杆菌黏附素疫苗研究进展

中国畜牧兽医 2023年第12期50卷 5056-5066页

作者：马兴树宋金祥石虎河北工程大学生命科学与食品工程学院分子生物学实验室邯郸056038 河北省兽用液体制剂技术创新中心石家庄050200 河北科星药业有限公司河欣科技中心石家庄050200

禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是导致不同日龄禽类局部和全身感染的重要病原菌,也是人肠外致病性大肠杆菌(extraintestinal pathogenic E.coli,ExPEC)毒力基因的重要贮存库或来源。随着APEC耐药菌株的日益... 详细信息

禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是导致不同日龄禽类局部和全身感染的重要病原菌,也是人肠外致病性大肠杆菌(extraintestinal pathogenic E.coli,ExPEC)毒力基因的重要贮存库或来源。随着APEC耐药菌株的日益增多,迫切需要开辟防控APEC感染的有效途径,其中阻止细菌感染的初始阶段便是防控感染的最有效措施之一。黏附素除介导细菌与宿主组织结合外,也是成功建立初始感染的第一步。因此,利用黏附素作为靶标制备疫苗预防APEC感染将是一种极有前途的策略。笔者重点介绍了菌毛黏附素、非菌毛黏附素和非典型黏附素等的结构与功能,以及有望成为APEC候选疫苗的黏附素的应用潜力和最新研究进展,如1型菌毛、P菌毛、普通菌毛、Yqi菌毛、Stg菌毛、Curli菌毛、温度敏感血凝素(Tsh)、AatA、FdeC、YeeJ、鞭毛蛋白、脂多糖(LPS)和外膜蛋白A等。黏附素疫苗一旦开发成功,将有望成为一种防控APEC感染的有力手段。

关键词：禽致病性大肠杆菌黏附素黏附素疫苗

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牛支原体黏附素及黏附素结合蛋白研究进展

畜牧兽医学报 2023年第8期54卷 3206-3216页

作者：武琪张玉娟刘桐辛九庆徐青元中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

牛支原体(M.bovis)是感染牛的一种重要病原体,可导致感染牛出现肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎和生殖道炎等多种临床症状,给养牛业造成了巨大经济损失。M.bovis黏附素在M.bovis致病过程中发挥重要作用,包括病原感染、细胞入侵、免疫... 详细信息

牛支原体(M.bovis)是感染牛的一种重要病原体,可导致感染牛出现肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎和生殖道炎等多种临床症状,给养牛业造成了巨大经济损失。M.bovis黏附素在M.bovis致病过程中发挥重要作用,包括病原感染、细胞入侵、免疫逃逸和毒力产生。迄今为止,已鉴定出十多种M.bovis黏附素。这些黏附素主要结合宿主细胞的纤溶酶原(plasminogen,Plg)、纤连蛋白(fibronectin,FN)、硫酸肝素(heparin sulfate,HS)和淀粉样前体样蛋白-2(amyloid precursor-like protein-2,APLP2)。本文将对目前已知的M.bovis黏附素及其宿主细胞靶蛋白的研究现状进行综述,为M.bovis已知和未知黏附素的鉴定和应用提供参考。

关键词： Mycoplasma bovis 黏附素黏附素结合蛋白

黏附素-抗菌肽毕赤酵母共表达工程菌的构建与特性研究

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黏附素-抗菌肽毕赤酵母共表达工程菌的构建与特性研究

作者：刘清怡中南民族大学

学位级别：硕士

产肠毒素大肠杆菌是引起断奶仔猪腹泻的主要病原体,其表面的黏附素可附着于宿主肠细胞,然后表达一种或多种肠毒素,从而感染宿主导致机体腹泻。抗菌肽被公认为是最具应用前景的抗生素替代品之一。本研究利用毕赤酵母表面展示技术将黏附... 详细信息

产肠毒素大肠杆菌是引起断奶仔猪腹泻的主要病原体,其表面的黏附素可附着于宿主肠细胞,然后表达一种或多种肠毒素,从而感染宿主导致机体腹泻。抗菌肽被公认为是最具应用前景的抗生素替代品之一。本研究利用毕赤酵母表面展示技术将黏附素锚定到酵母细胞壁上,同时利用分泌表达系统表达抗菌肽,构建获得一株共表达黏附素-抗菌肽的重组酵母工程菌,使该重组酵母通过一次发酵,就能获得黏附素和抗菌肽两种生物学功能不同的外源蛋白,并且相互不会受到影响,使微生物制备复合制剂的生产方式得到简化。本论文主要研究结果如下:(1)由于使用不同锚定蛋白对展示表达的效率影响较大,本实验选用三种毕赤酵母GPI型细胞壁蛋白分别在毕赤酵母中展示表达两种常见的黏附素FaeG和FanC,并探究展示表达效率最优的锚定蛋白。通过流式细胞术荧光强度分析、重组酵母表面疏水性测定及Zeta电位仪细胞表面电位测量,实验结果表明使用锚定蛋白GCW21时黏附素FaeG和FanC的展示表达效率最好;(2)由于不同的黏附素在宿主中有着相似但不相同的受体,利用体外串联基因表达盒的方法构建获得双黏附素FaeG和FanC共展示表达重组质粒pPICZαA/FaeG(GCW21)-FanC(GCW21),将其电转化至分泌表达外源抗菌肽LFcinB-L3的重组酵母GS115/LFcinB-L3中,获得黏附素-抗菌肽共表达重组酵母GS115/(LFcinB-L3)-FaeG-FanC;(3)对共表达重组酵母GS115/(LFcinB-L3)-FaeG-FanC进行摇瓶发酵,通过对该共表达重组酵母菌体进行免疫荧光显微镜观察确证GCW21已成功同时将FaeG和FanC锚定在毕赤酵母细胞的细胞壁上。继而通过将该菌体与猪小肠上皮细胞IPEC-J2进行细胞粘附性实验,结果显示锚定在细胞壁上的FaeG和FanC使得共表达重组酵母的特异性黏附能力显著增强;(4)对共表达重组酵母GS115/(LFcinB-L3)-FaeG-FanC的发酵上清液中抗菌肽的抑菌活性进行检测,结果表明多种基因共表达不会影响抗菌肽的生物活性和表达效率,上清液中抗菌肽对产肠毒素大肠杆菌K99和金黄色葡萄球菌USA300均有较好的抑菌活性,对金黄色葡萄球菌USA300的抑菌效果更好,该抗菌肽在50℃以下、偏酸性环境中保持较高的抗菌活性,并对胰蛋白酶和胃蛋白酶有较强的耐受性。通过本课题以期获得一种能产生特异性免疫、抑制有害菌株生长、抵御传染病的发生与流行的复合肠道保护制剂,为新型抗菌剂及基因工程菌种的探索提供新的思路和方向。

关键词：黏附素抗菌肽表面展示毕赤酵母

益生特性双歧杆菌筛选及其细胞黏附相关表面黏附素分析

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益生特性双歧杆菌筛选及其细胞黏附相关表面黏附素分析

作者：张文丽内蒙古大学

学位级别：硕士

作为肠道的优势菌群,双歧杆菌对宿主的健康有重要影响,双歧杆菌若想发挥对人体的益生功能前提则是需要在肠道内定植和增殖。因此,对胃肠道耐受以及黏附是体外筛选双歧杆菌的重要指标。本研究以实验室保藏的来源于婴儿肠道粪便的9株双歧... 详细信息

作为肠道的优势菌群,双歧杆菌对宿主的健康有重要影响,双歧杆菌若想发挥对人体的益生功能前提则是需要在肠道内定植和增殖。因此,对胃肠道耐受以及黏附是体外筛选双歧杆菌的重要指标。本研究以实验室保藏的来源于婴儿肠道粪便的9株双歧杆菌为实验材料,通过益生特性和细胞黏附能力检测获得优良菌株,探究优良菌株表面黏附素对肠道细胞黏附的影响。主要研究结果如下:1.具有肠道益生特性的高黏附性双歧杆菌的筛选及鉴定通过模拟胃肠液方法筛选耐受胃肠道环境的双歧杆菌;通过抗生素敏感性以及抗性基因两个指标来确定菌株安全性;通过疏水性、自聚集以及黏附HT-29细胞的能力筛选高黏附性菌株;通过菌株与肠道细胞作用时间、耐受胃肠道环境以及二价金属离子是否促进益生菌黏附进一步探究影响菌株黏附于肠道细胞的因素;最后对所筛选的高黏附性菌株进行分子水平的鉴定。结果发现,菌株A17、A19在胃肠液环境中存活数达到了10CFU/m L以上;菌株A12、A16、RH以及F5存在红霉素抗性基因,9株菌对氨基糖苷类抗生素存在耐受性;菌株A160、A17、A19、RH具有很好的益生潜力,5h内自聚集与表面疏水性都达到了40%以上。黏附能力评估实验中菌株A17对HT-29细胞黏附效果最好,其黏附指数为6.41 bacteria/cell;双歧杆菌A17黏附性质在酸性环境以及Ca、Zn存在下且作用时间为2h时最好;经鉴定菌株A17为动物双歧杆菌。2.双歧杆菌A17表面黏附素分析及对其黏附的影响采用化学试剂氯化锂、高碘酸钠以及高温三种处理A17细菌表面,通过测定菌株与HT-29细胞黏附能力的变化确定A17参与黏附的表面黏附素成分;采用氯化锂提取表面蛋白,通过SDS-PAGE电泳和蛋白质谱分析表面蛋白种类,并通过扫描电镜和透射电镜观察氯化锂处理前后菌株细胞表面结构变化。结果表明,A17对HT-29细胞的黏附由表面蛋白介导;氯化锂处理A17后黏附指数从5.32 bacteria/cell下降到0.61 bacteria/cell;BCA结果显示氯化锂处理A17 9h后蛋白得率最高为868μg/m L。综合SDS-PAGE以及蛋白质谱结果共鉴定到20类蛋白预测参与A17与HT-29的黏附,分别为醇醛脱氢酶(98k Da)、GAPDH(39k Da)、β-半乳糖苷酶(80k Da)以及细胞表面蛋白(136k Da)等;电镜结果显示氯化锂处理后菌株由高度聚集状态变得分散,出现细胞壁变薄,表面蛋白层消失的现象。A17黏附能力的强弱也受到胞外多糖(EPS)控制。采用醇沉提取A17 EPS并将A17、EPS与HT-29细胞共孵育确定EPS参与黏附;通过全基因组测序明确调控A17 EPS合成相关基因。结果表明,EPS可以促进菌株对HT-29细胞的黏附,当EPS浓度为8mg/m L时,双歧杆菌A17的黏附能力达到最强为8.27bacteria/cell。此时菌株的自聚集能力以及表面疏水性也最高。全基因组测序结果显示A17 EPS的合成受到长度为20kb由19个基因组成的基因簇的控制,双歧杆菌利用葡萄糖和乳糖合成EPS前体糖核苷酸,进而合成EPS。

关键词：双歧杆菌黏附黏附素表面蛋白胞外多糖

重组梅毒螺旋体黏附素Tp0954的免疫保护性及血清学诊断价值评估

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重组梅毒螺旋体黏附素Tp0954的免疫保护性及血清学诊断价值评估

作者：陈德军南华大学

学位级别：硕士

目的:测定重组梅毒螺旋体(Tp)黏附素Tp0954(rTp0954)免疫新西兰兔后的适应性免疫应答水平及免疫保护性,评估rTp0954的血清学诊断价值,为筛选新的梅毒候选疫苗分子及血清学诊断抗原提供实验依据。方法:1.rTp0954表达纯化与鉴定:构建并验... 详细信息

目的:测定重组梅毒螺旋体(Tp)黏附素Tp0954(rTp0954)免疫新西兰兔后的适应性免疫应答水平及免疫保护性,评估rTp0954的血清学诊断价值,为筛选新的梅毒候选疫苗分子及血清学诊断抗原提供实验依据。方法:1.rTp0954表达纯化与鉴定:构建并验证原核表达载体pET-30a(+)-Tp0954,转化E.coli BL21宿主菌中诱导表达及纯化rTp0954,经Western Blot鉴定rTp0954的免疫反应性;2.rTp0954血清学诊断价值评估:建立基于rTp0954的间接ELISA法,检测各期梅毒血清、交叉血清和健康人血清的特异性IgG水平,评价rTp0954作为梅毒血清学诊断学候选抗原的潜在价值;3.动物分组与免疫:将雄性新西兰兔随机分成PBS组、FA组(弗氏佐剂组)与rTp0954/FA组(实验组)三组,经肌肉和皮下多点分别注射/免疫PBS、FA、纯化rTp0954与FA的混合物,每间隔2周加强免疫1次,共免疫3次;4.rTp0954免疫原性测定:每次免疫前采集血清,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测rTp0954特异性IgG抗体水平;取末次免疫后2周的兔脾脏,ELISA与CCK-8试剂盒分别检测培养后脾细胞分泌γ干扰素(IFN-γ)分泌水平和淋巴细胞增殖情况;5.rTp0954免疫保护性观察:末次免疫后2周对兔进行活Tp攻击感染,每观测攻击点的红疹、硬结与溃疡,测量皮损直径;Tp攻击后第21天处死兔,以实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测血液、皮损、肝脏及脾脏中Tp-DNA载量;以苏木精-伊红(HE)染色观察皮损组织的炎症细胞浸润情况;无菌分离出各组腘窝淋巴结,将提取液注射至健康新西兰兔睾丸,每天观察接种淋巴结提取物后兔睾丸炎,每三周测定兔血清学变化,镀银染色观察Tp.结果:1.rTp0954表达纯化与鉴定:经菌液PCR及测序鉴定,成功构建原核表达载体pET-30a(+)-Tp0954,Western Blot结果在55KDa左右出现特异性条带;2.rTp0954血清学诊断价值评估:ELISA结果显示rTp0954检测临床样本具有较高的敏感性(95.2%)和较低的特异性(86.7%)。3.rTp0954免疫可有效诱导体液免疫与细胞免疫应答:rTp0954/FA组特异性IgG随免疫次数增加而逐渐增加,在免疫第6周时达高峰,此时效价为1:10 240 000;ELISA与CCK-8试剂盒检测显示,与PBS组及FA组相比,rTp0954/FA组淋巴细胞IFN-γ分泌水平显著增加(P<0.0001),淋巴细胞刺激指数(SI)显著上升(P<0.05);4.rTp0954免疫有效减缓皮损发展并抑制Tp向远端组织扩散:经Tp攻击感染后,硬结全部出现时间在rTp0954/FA组(第14天)明显晚于PBS组及FA组(第9天);攻击后21天期间内,rTp0954/FA组皮损直径始终小于PBS和FA对照组(P<0.05);攻击后第21天,rTp0954/FA组溃疡形成率明显低于PBS和FA对照组;RT-PCR结果显示,血液及各组织(皮损、肝脏、脾脏)的Tp-DNA载量,rTp0954/FA组均明显低于PBS组和FA组(P<0.01);淋巴结转移试验结果显示,PBS和FA对照组新西兰兔出现睾丸炎及血清学反应,镀银染色可见Tp,而实验组直到第100天无任何反应。5.rTp0954免疫促进了炎症细胞浸润。HE染色显示rTp0954/FA组的皮损炎症细胞(巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞等)浸润数量明显多于PBS组和FA组。结论:1.Tp0954可能不适合作为梅毒血清学诊断抗原;2.Tp0954具有良好的免疫原性,免疫新西兰兔能延缓兔皮损发展、抑制Tp远端播散及促进炎症细胞浸润,是一个潜在的梅毒候选疫苗分子。

关键词：梅毒螺旋体 Tp0954 黏附素免疫保护性血清学诊断

动物源产肠毒素大肠杆菌(ETEC)黏附素研究进展

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微生物学报 2012年第6期52卷 679-686页

作者：周虹朱军朱国强扬州大学兽医学院禽类预防医学教育部重点实验室扬州225009

动物源产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起动物(尤其是幼龄动物)腹泻的主要病原菌。已知黏附素和肠毒素是ETEC中两种重要的毒力因子,在致病性中两者缺一不可。其中黏附素结合到宿主易感肠上皮细胞是ETEC感... 详细信息

动物源产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起动物(尤其是幼龄动物)腹泻的主要病原菌。已知黏附素和肠毒素是ETEC中两种重要的毒力因子,在致病性中两者缺一不可。其中黏附素结合到宿主易感肠上皮细胞是ETEC感染的第一步,也是最重要的关键步骤。动物源ETEC的菌毛黏附素主要包括K88、K99、987P、F18、F17和F41等。人们从20世纪60年代就开始了ETEC菌毛黏附素的相关研究,包括菌毛的基因、结构组成、生物合成、菌毛表达的调控机制以及黏附素和宿主受体相互作用等,这些研究基础有助于我们深入了解ETEC病原菌的感染机理;并且在疾病诊断和新疫苗的开发中具有重大意义。

关键词：产肠毒素大肠杆菌(ETEC) 黏附素菌毛

肠出血性大肠杆菌O157∶H7紧密黏附素免疫保护性片段的基因克隆与表达

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中华微生物学和免疫学杂志 2005年第2期25卷 142-145页

作者：易勇邹全明程建平毛旭虎曾明朱永红童文德第三军医大学检验系临床微生物及免疫学教研室重庆400038 中国药品生物制品检定所

目的　克隆表达肠出血性大肠杆菌 (EHEC)O1 5 7∶H7紧密黏附素 (intimin)免疫保护性片段 (intiminC30 0 )。方法　设计引物采用PCR法自EHECO1 5 7∶H7基因组扩增紧密黏附素及其免疫保护性片段的编码基因eae与eaeC30 0 ,T A克隆后构建原... 详细信息

目的　克隆表达肠出血性大肠杆菌 (EHEC)O1 5 7∶H7紧密黏附素 (intimin)免疫保护性片段 (intiminC30 0 )。方法　设计引物采用PCR法自EHECO1 5 7∶H7基因组扩增紧密黏附素及其免疫保护性片段的编码基因eae与eaeC30 0 ,T A克隆后构建原核表达质粒pET 2 8a(+) eae及pET 2 8a(+) eaeC30 0 ,经测序鉴定后转化E .coliBL2 1 (DE3) ,IPTG诱导表达 ,PAGE检测。结果　PCR法自EHECO1 5 7∶H7基因组扩增出了约 2 80 0bp和 90 0bp的目的片段 ;原核表达质粒pET 2 8a(+) eae及pET 2 8a(+) eaeC30 0经酶切及测序鉴定与预期序列一致。转化E .coliBL2 1 (DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约 2 5 %和 30 %;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量 (Mr)约 96× 1 0 3和 35× 1 0 3,破菌后电泳证实目的蛋白均以包涵体形式表达。结论　EHECO1 5 7∶H7紧密黏附素免疫保护性片段经基因克隆后获得了较高的表达量 ,为进一步的生物学性质及免疫学特性研究奠定了基础。

关键词：肠出血性大肠杆菌O157:H7 免疫保护性基因克隆黏附素片段 BL21(DE3) 原核表达质粒 E.coli 基因组扩增 EHEC 相对分子质量 PCR法 PAGE T-A克隆蛋白表达率生物学性质克隆表达设计引物编码基因诱导表达特性研究

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黏附素保守区疫苗防治鼠幽门螺杆菌感染

世界华人消化杂志 2005年第4期13卷 468-471页

作者：白杨梁燕玲刘秀丽施理王继德张兆山周殿元张亚历南方医科大学南方医院全军消化病研究所广东省广州市510515 军事医学科学院生物工程研究所北京市100071

目的:利用人类幽门螺杆菌(H pylori)感染的小鼠模型研究黏附素保守区(AB)疫苗在预防与治疗H pylori感染的作用. 方法:实验分为预防与治疗两部分.预防部分把实验动物无特定致病菌C57BL/6小白鼠分成4组,分别通过灌胃方法给予AB(100μg)加C... 详细信息

目的:利用人类幽门螺杆菌(H pylori)感染的小鼠模型研究黏附素保守区(AB)疫苗在预防与治疗H pylori感染的作用. 方法:实验分为预防与治疗两部分.预防部分把实验动物无特定致病菌C57BL/6小白鼠分成4组,分别通过灌胃方法给予AB(100μg)加CT(2 μg)、生理盐水、单纯AB(1 00 μg)、单纯CT(2 μg),1次/wk,共4次. 2 wk后再用活H pylori灌胃,再4 wk后处死动物.治疗部分把已感染H pylori的小白鼠分成4组,分组与治疗方法同预防部分,治疗结束后4 wk处死动物.取胃黏膜行半定量细菌培养检查H pylori情况. 结果:预防实验的保护率分别为AB加CT61.5%(16/26), 单纯AB、单纯CT和PBS保护率均为0.AB加CT治疗组H pylori根除率为:38.5%(1 0/26),生理盐水组、单纯AB、单纯CT组均无治疗作用.治疗组未根除H pylori的小鼠,疫苗组H pylori的定植密度明显低于其他4组(P<0.05). 结论:由AB加免疫佐剂组成的口服疫苗,不仅有预防H pylori感染的作用,同时也有根除已感染的H pylori 的作用.AB可用于H pylori疫苗的研制.

关键词：治疗感染 CT 预防 AB 黏附素疫苗保守结论特定

幽门螺杆菌黏附素A的原核表达、纯化及其结晶条件搜索

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中国生物制品学杂志 2014年第3期27卷 325-329页

作者：赵祥徐欢张欣熊昌辉马贤纵安家昆章金勇第三军医大学药学系微生物与生化药学教研室重庆400038 第三军医大学学员旅15队重庆400038

目的原核表达、纯化幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，11．pylori）黏附素A（麒pyloriadhesinA，HpaA），并初步搜索其结晶条件。方法采用TMHMM和SignalP．4．1软件预测HpaA蛋白中的跨膜序列和信号肽序列，根据GenBank中登录的编码HpaA... 详细信息

目的原核表达、纯化幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，11．pylori）黏附素A（麒pyloriadhesinA，HpaA），并初步搜索其结晶条件。方法采用TMHMM和SignalP．4．1软件预测HpaA蛋白中的跨膜序列和信号肽序列，根据GenBank中登录的编码HpaA的基因序列hp0797去掉预测出的信号肽序列后设计引物，以H．pylori标准株26695基因组为模板，PCR扩增编码HpaA的基因序列，插入原核表达载体pET-22b，构建重组表达质粒pET-22b-HpaA，转化大肠埃希菌（Ecoil）BL21（DE3），IPTG25℃诱导表达，表达的重组蛋白经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析进行纯化。将纯化产物浓缩至10mg／ml，采用结晶搜索试剂盒，通过悬滴汽相扩散法搜索HpaA的结晶条件，并在此基础上配制条件进行优化。结果去掉序列中编码信号肽区域或跨膜结构域的密码子，选择HpaA的36-260位氨基酸进行克隆，构建的重组原核表达质粒pET．22b-HpaA经双酶切及测序鉴定，证明构建正确；表达的重组蛋白HpaA相对分子质量约27000，表达量约占菌体总蛋白的10％以上，主要以可溶形式表达，纯化后的纯度可达99％以上。在多种条件下，均有结晶生长，晶体多为薄片状、针状或簇状，在20％PEG3350，0．1mol／LHEPES（pH7．0）条件下，晶体形状类似长方体，外形有所改善。结论成功表达了HpaA蛋白，初步掌握其结晶条件，为下一步晶体结构学的研究及其在H．pylori感染与致病中的作用机制奠定了基础。

关键词：幽门螺杆菌黏附素原核细胞基因表达晶体