检索结果-南通市图书馆

作者：唐欣巍四川农业大学

学位级别：硕士

猪革拉瑟氏病(Glasser’s disease)是由副猪革拉瑟氏菌(Glaesserella parasuis,GPS)引起的猪的一种泛嗜性细菌病,严重威胁着我国养猪业的发展。GPS感染和入侵机制复杂,致病机制尚不清晰,因此,深入研究其毒力因子及致病机制有利于该病的... 详细信息

猪革拉瑟氏病(Glasser’s disease)是由副猪革拉瑟氏菌(Glaesserella parasuis,GPS)引起的猪的一种泛嗜性细菌病,严重威胁着我国养猪业的发展。GPS感染和入侵机制复杂,致病机制尚不清晰,因此,深入研究其毒力因子及致病机制有利于该病的科学防控。Esp P2(Putative extracellular serine protease,espp)是一种自转运蛋白,可以将自身的结构域部分运输到胞外发挥作用。同时Esp P2也是GPS高、低毒力菌株的差异表达蛋白,是副猪革拉瑟氏菌一种潜在的毒力因子。本研究以GPS SC1401为材料,对比Esp P2缺失株和野生株之间的毒力差异,证明Esp P2缺失会显著降低细菌黏附入侵能力,其次发现该蛋白能引起紧密连接蛋白Claudin1和Occludin的表达量上调并鉴定Esp P2是通过上调紧密连接蛋白表达量促进细菌黏附入侵宿主细胞,最后通过转录组测序分析,验证影响黏附入侵过程中可能涉及的差异表达基因和通路。本研究的具体内容包括:1.成功构建GPS的Esp P2缺失株并研究其生物学特性,成功原核表达并纯化Esp P2。本研究采用自然转化的方法成功构建Esp P2的基因全长敲除的突变菌株ΔEsp P2∷Kan。对其生物学相关特性与野生株进行比较,发现Esp P2缺失并没有影响细菌的生长速率,但在PK15和NPTR细胞中,ΔEsp P2∷Kan黏附在细胞上和入侵的数量显著少于野生株。将Esp P2克隆至p ET-32a质粒,后转入大肠杆菌感受态BL21(DE3),在18℃、180 r/min的条件下培养16 h进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,成功表达出103 k Da的Esp P2。2.探究Esp P2在副猪革拉瑟氏菌黏附和入侵中的功能,发现其能影响紧密连接蛋白表达。将Esp P2以50μg/ml的浓度作用于PK15细胞和NPTR细胞6 h、12 h、24 h、36 h、48 h,检测细胞紧密连接蛋白表达量。发现随着孵育时间增加,紧密连接蛋白Claudin1和Occludin的转录水平和表达水平显著增加。分别用SC1401野生株和Esp P2缺失株感染细胞,发现在两种细胞中,缺失株感染的细胞紧密连接蛋白表达量均显著减少。以Claudin1敲除和Occludin基因敲低的PK15细胞系为材料,分别用野生株和Esp P2缺失株感染细胞,检测黏附和入侵宿主细胞的细菌数量。结果显示,在Claudin1和Occludin基因缺失后,无论野生株还是基因缺失株,能够黏附和入侵上皮细胞的细菌数量都比未缺失紧密连接基因的细胞减少的更加显著,结合之前结论可得出,Esp P2是通过上调紧密连接蛋白Claudin1和Occludin的表达量进而促进副猪革拉瑟氏菌的黏附和入侵。3.通过RNA-seq技术确定Esp P2作用于PK15细胞后转录组水平基因的差异表达情况及通路功能验证。将50μg/ml的Esp P2作用于PK15细胞12 h、36 h后,使用RNA-seq技术发现差异表达基因主要与细胞顶端、顶端质膜,信息调节,信号转导等生物进程相关,信号通路富集分析确定细胞因子与细胞因子受体相互作用、TNF信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路和Rap1信号通路聚集程度较高。对差异表达基因和富集信号通路进行验证,发现Esp P2能够激活Rap1信号通路,且抑制Rap1信号通路会导致紧密连接蛋白Occludin的表达水平降低。说明Esp P2介导紧密连接蛋白对副猪革拉瑟氏菌黏附入侵的机制可能与Rap1信号通路有关。

关键词：副猪革拉瑟氏菌 EspP2 黏附入侵紧密连接蛋白

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副猪嗜血杆菌lpxL基因介导的生物被膜形成及黏附入侵能力的分析

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中国兽医科学 2020年第12期50卷 1542-1548页

作者：席振军秦翠丽宋帅张昆丽勾红潮李春玲河南科技大学河南洛阳471000 广东省农业科学院动物卫生研究所广东广州510640

为了研究lpxL基因在副猪嗜血杆菌生物被膜形成及对细胞黏附入侵方面的作用,采用同源重组方法构建副猪嗜血杆菌lpxL基因缺失株H45-ΔlpxL;与野生株H45进行生物学特性比较。结果表明,lpx L基因缺失后,副猪嗜血杆菌的生长速度小于野生株;... 详细信息

为了研究lpxL基因在副猪嗜血杆菌生物被膜形成及对细胞黏附入侵方面的作用,采用同源重组方法构建副猪嗜血杆菌lpxL基因缺失株H45-ΔlpxL;与野生株H45进行生物学特性比较。结果表明,lpx L基因缺失后,副猪嗜血杆菌的生长速度小于野生株;生物被膜合成量减小,对猪肾上皮细胞(PK-15)的黏附能力与入侵能力均有一定程度的减弱。结论,lpxL基因对副猪嗜血杆菌的增殖以及致病性都会产生一定作用。

关键词：副猪嗜血杆菌 lpxL 脂多糖黏附入侵

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