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黏着素调节因子Pds5与蛋白酶体互作调控减数分裂染色体轴长

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黏着素调节因子Pds5与蛋白酶体互作调控减数分裂染色体轴长

作者：田中宇山东大学

学位级别：硕士

减数分裂是真核生物进行有性生殖的必经环节。在减数分裂过程中,二倍体细胞进行一次DNA复制,发生两次染色体分离。减数第一次分裂(Meiosis I)发生同源染色体分离,减数第二次分裂(Meiosis II)发生姐妹染色单体分离,最终产生染色体数目减... 详细信息

减数分裂是真核生物进行有性生殖的必经环节。在减数分裂过程中,二倍体细胞进行一次DNA复制,发生两次染色体分离。减数第一次分裂(Meiosis I)发生同源染色体分离,减数第二次分裂(Meiosis II)发生姐妹染色单体分离,最终产生染色体数目减半的配子,保证了后代遗传的稳定性。减数分裂过程中同源染色体的配对、联会和分离等事件伴随着染色体形态和结构的剧烈变化。黏着素复合体参与这一重要过程,Pds5作为黏着素复合体的调节因子,定位在减数第一次分裂前期的染色体轴上,调控染色体轴长。但其具体调控机制未知。本文选取酿酒酵母作为实验材料,首先验证了 Pds5和蛋白酶体之间的相互作用。在此基础上,我们构建了相应的突变体菌株,探究了 Pds5和蛋白酶体在减数分裂中相互作用的功能。主要结果包括以下两方面:***5与蛋白酶体互作将其募集到减数分裂染色体我们实验室前期对Pds5进行免疫沉淀,对沉淀下来的样品进行质谱分析,发现了多个蛋白酶体组分。本文通过酵母双杂和免疫共沉淀实验证实了 Pds5与蛋白酶体组分Pre1、Rpn6、Rpt2之间存在互作。利用Pds5的截短体进行酵母双杂交,发现Pds5的N端701个氨基酸残基(Pds51-701AA)与Pre1、Rpn6、Rpt2相互作用。进一步通过易错PCR随机突变,发现Pds5的第355-701氨基酸区段上多个氨基酸位点突变影响Pds5与Rpn6的互作。对野生型和突变体菌株进行染色体铺片及免疫荧光染色观察他们的定位情况,发现Pds5缺失使蛋白酶体在染色体上的定位显著减少,而蛋白酶体缺失对Pds5在染色体上的定位影响较小。上述结果说明,Pds5通过与蛋白酶体互作而将其募集到减数分裂染色体。***5与蛋白酶体互作调节减数分裂染色体轴长减数分裂过程中,Pds5缺失菌株、蛋白酶体亚基Pre1、Rpn6或Rpt2缺失菌株与二者同时缺失的菌株,均表现出与Pds5相同程度的染色体轴长变短现象。这说明Pds5通过招募蛋白酶体进而调控减数分裂染色体轴长。另外,蛋白酶体亚基突变体的减数分裂核分裂进程明显延迟、产孢率显著降低。综上所述,本文发现Pds5募集蛋白酶体调控减数分裂染色体轴长,揭示了 Pds5调控减数分裂染色体结构的机制和蛋白酶体在减数分裂中的新功能。

关键词：减数分裂 Pds5 黏着素蛋白酶体染色体轴

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染色体黏着素

生物学教学 2008年第12期33卷 2-4页

作者：刘石娟山东省曲阜师范大学生命科学学院

本文简要综述了黏着素的结构组成、分布与定位，并对其生物学功能进行了重点阐述。

关键词：黏着素损伤修复基因沉默染色质隔离

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百日咳杆菌黏着素的纯化及生物学特性研究

国际生物制品学杂志 2012年第1期35卷 1-5页

作者：王玲肖詹蓉叶娟韩俊杰孙翔宇北京天坛生物制品股份有限公司菌苗室 100024

目的建立从天然百日咳杆菌中提纯百日咳杆菌黏着素（pertactin，PRN）的方法，研究PRN的生物学特性并确定PRN在无细胞百日咳疫苗中的作用。方法百日咳杆菌CS株于发酵罐培养后，经热浸提、硫酸铵分级沉淀及离子交换层析得到纯化PRN，根... 详细信息

目的建立从天然百日咳杆菌中提纯百日咳杆菌黏着素（pertactin，PRN）的方法，研究PRN的生物学特性并确定PRN在无细胞百日咳疫苗中的作用。方法百日咳杆菌CS株于发酵罐培养后，经热浸提、硫酸铵分级沉淀及离子交换层析得到纯化PRN，根据《中华人民共和国药典》2005年版三部的要求，对纯化PRN进行纯度检测及生物学特性研究。结果各项检测显示，纯化PRN的纯度在95％以上，其相对分子质量和等电点与标准PRN一致。纯化PRN对小鼠具有保护效力，且其保护效力随PRN免疫浓度的增加而增强。未检出纯化PRN的特异性毒性和异常毒性。结论建立了从天然百日咳杆菌中提纯PRN的方法，而且纯化PRN具有免疫原性和保护效力。

关键词：博德特菌,百日咳细菌外膜蛋白类疫苗黏着素

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染色体浓缩素

细胞生物学杂志 2005年第6期27卷 607-612页

作者：王会珍薛社普韩代书中国医学科学院基础医学研究所

染色体的形成是细胞周期的重要事件,然而有关染色体构筑动力学的分子机制仍未阐明。近年来对染色体浓缩素的分离与研究,为认识DNA浓缩和染色体构建机制提供了重要的线索,是细胞生物学研究领域的里程碑。现对浓缩素的发现过程,浓缩素在... 详细信息

染色体的形成是细胞周期的重要事件,然而有关染色体构筑动力学的分子机制仍未阐明。近年来对染色体浓缩素的分离与研究,为认识DNA浓缩和染色体构建机制提供了重要的线索,是细胞生物学研究领域的里程碑。现对浓缩素的发现过程,浓缩素在有丝分裂和减数分裂中的作用,浓缩素与黏着素的关系,浓缩素参与基因调节等方面进行综述,为相关领域的研究者提供参考。

关键词：浓缩素染色体细胞周期黏着素基因调节

小鼠肺炎链球菌psaA核酸疫苗的制备及其初免-蛋白加强免疫策略的研究

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中华耳鼻咽喉头颈外科杂志 2009年第9期44卷 762-766页

作者：章德广王正敏徐江红陈兵戴文佳范小勇复旦大学附属眼耳鼻喉医院耳鼻咽喉头颈外科上海200031 复旦大学附属上海市公共卫生临床中心

目的制备肺炎链球菌核酸疫苗，初步探讨初免一蛋白加强免疫策略能否增强疫苗在动物体内的免疫原性。方法从肺炎链球菌基因组中克隆出肺炎球菌表面黏附素A（pneumococcalsurfaceadhesinA，PsaA）基因，将其分别插入到真核表达载体pVAX1... 详细信息

目的制备肺炎链球菌核酸疫苗，初步探讨初免一蛋白加强免疫策略能否增强疫苗在动物体内的免疫原性。方法从肺炎链球菌基因组中克隆出肺炎球菌表面黏附素A（pneumococcalsurfaceadhesinA，PsaA）基因，将其分别插入到真核表达载体pVAX1和原核表达载体pET28a中，分别构建出表达PsaA的核酸疫苗及其基因工程表达菌株。pVAX1-psaA核酸疫苗体外转染293T细胞，并通过反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）加以鉴定。实验组5只BALB／c小鼠经核酸疫苗免疫3次后，PsaA纯化蛋白加强免疫1次，对照组5只小鼠经pVAXl空载体免疫3次后，生理盐水加强免疫1次，分别采集血清测定两组抗PsaA抗体水平。结果成功克隆出psaA基因并实现其亚克隆；所构建的psaA核酸疫苗序列正确，同时实现了PsaA蛋白的一步亲和纯化；psaA核酸疫苗可在293T真核细胞中成功表达；核酸疫苗初免后蛋白加强组的抗PsaA抗体滴度高于对照组（t=87．518，P〈0．05）。结论成功构建出psaA核酸疫苗，采用核酸疫苗初免一蛋白加强免疫策略能增强肺炎链球菌psaA核酸疫苗的免疫原性。

关键词：中耳炎链球菌肺炎黏着素细菌疫苗 DNA 免疫接种加强

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染色体分离的分子机理

科学通报 2003年第19期48卷 2014-2021页

作者：丁兆军邓祝云陶佳乙张亮然王台中国科学院植物研究所光合作用与环境分子生理学重点实验室北京100093

染色体分离是有丝分裂和减数分裂的关键事件,是保证姊妹(同源)染色体正确分配到子细胞中关键的调控环节之一。近年来,利用酵母等真核模式生物突变体,研究人员克隆了一些调控细胞分裂早期姊妹染色体黏着和后期黏着素酶解的关键基因,初步... 详细信息

染色体分离是有丝分裂和减数分裂的关键事件,是保证姊妹(同源)染色体正确分配到子细胞中关键的调控环节之一。近年来,利用酵母等真核模式生物突变体,研究人员克隆了一些调控细胞分裂早期姊妹染色体黏着和后期黏着素酶解的关键基因,初步阐明了染色体分离的分子调控机理。由多亚基蛋白组成的黏着素是保证染色体正确黏着和分离的关键分子。在细胞分裂中后期过渡时,经过一系列的分子识别和互作导致黏着素蛋白选择性地降解,使染色体分离。本文在详细地讨论了参与有丝分裂染色体分离调节的关键蛋白质及其作用机制的基础上,简单介绍了有丝分裂和减数分裂染色体分离过程中分子调节的差异,并分析了染色体分离分子机制研究中尚待解决的关键问题。

关键词：染色体分离分子机理细胞分裂黏着素有丝分裂减数分裂真核模式生物突变体细胞学

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酿酒酵母Scc4在减数分裂中的功能研究

酿酒酵母Scc4在减数分裂中的功能研究

作者：曹燕仃山东大学

学位级别：硕士

减数分裂是真核生物有性生殖的基础,是配子发生(精子和卵子)的必经过程。减数分裂异常是引发人类不孕不育以及出生缺陷的重要原因。但是,减数分裂的机制尚不明晰。因此,深入探究减数分裂的分子机制和调控过程,对于预防出生缺陷和改善人... 详细信息

减数分裂是真核生物有性生殖的基础,是配子发生(精子和卵子)的必经过程。减数分裂异常是引发人类不孕不育以及出生缺陷的重要原因。但是,减数分裂的机制尚不明晰。因此,深入探究减数分裂的分子机制和调控过程,对于预防出生缺陷和改善人类生殖健康具有重要意义。姊妹染色单体黏着是有丝分裂和减数分裂的关键事件,对保证染色体正确分离至关重要。姊妹染色单体之间的黏着由黏着素介导。黏着素装载复合体则负责将黏着素装载到染色体的正确位置。此外,黏着素装载复合体还在基因表达调控、个体发育等基本生物学过程中也发挥关键作用。如黏着素装载复合体功能异常,在人类中会引发德朗热综合症,在小鼠中会导致其颅面缺失。在酿酒酵母中,黏着素装载复合体由Scc2和Scc4两个亚基组成。近来研究发现,Scc2和Scc4的功能可能存在差异。例如,酿酒酵母有丝分裂中Scc4突变导致近着丝粒处的黏着素减少,染色体臂上的黏着素不变;而Scc2突变导致染色体臂上的黏着素减少,近着丝粒处的黏着素不变。酿酒酵母减数分裂中,Scc2还可以作为特异的转录激活因子调控REC8等减数分裂基因的表达。但是Scc4在减数分裂中的功能及其与Scc2的功能差异尚不明晰。为了探究Scc4在减数分裂中的功能,本论文以酿酒酵母为研究材料,构建了不同的Scc4突变体,包括在有丝分裂表达但减数分裂特异不表达的pCLB2-SCC4突变体,黏着素装载效率降低的scc4-m35突变体和pCLB2-SCC4/scc4-m35突变体。通过对pCLB2-SCC4突变体的研究发现,Scc4缺失会严重影响酿酒酵母减数分裂,如核分裂进程延迟,核分裂比例仅为野生型的40%,产孢率明显降低,所有孢子不能存活。在减数分裂中,DNA双链断裂经酶切加工形成单链DNA末端被Rad51等蛋白结合,最终帮助其以同源染色体为模板进行修复。因此,通过分析随减数分裂进程Rad51点数的动态变化可以探究DNA双链断裂的形成与修复情况。利用染色体展片结合Rad51免疫荧光,我们发现pCLB2-SCC4突变体中减数分裂DNA双链断裂的修复比野生型明显延迟。通过DNA单向凝胶电泳和Southern杂交研究发现,pCLB2-SCC4突变体在减数分裂重组热点HIS4-LEU2处的DNA双链断裂的水平减少到野生型的40%。减数分裂DNA双链断裂通常会被修复形成crossover或者non-crossover。为了揭示Scc4对生成的重组产物的影响,我们通过Southern杂交,对pCLB2-SCC4突变体减数分裂重组热点HIS4-LEU2处的重组修复情况进行了定量分析,结果表明,crossover的数量降低,而non-crossover 的数量则不受影响。由于减数分裂 crossover 的数目和分布会受到染色体轴以及同源染色体联会的调控。因此,利用染色体展片和免疫荧光染色分析pCLB2-SCC4突变体染色体轴成分Rec8和联会复合体中央元件Zip1的形成,结果发现,减数分裂同源染色体联会和染色体轴形成发生严重缺陷。与pCLB2-SCC4突变体相比,黏着素装载效率降低的scc4-m35突变体和pCLB2-SCC4/scc4-m35突变体对减数分裂孢子存活率、产孢率及核分裂的影响相对较轻。上述结果表明,Scc4除介导黏着素装载外,在减数分裂中还发挥其他重要功能。我们推测Scc4可能通过调控减数分裂染色体轴的形成影响DNA双链断裂的形成和修复,进而影响同源染色体联会及染色体分离,最终影响减数分裂核分裂、孢子形成效率和孢子存活率。本论文探究了酿酒酵母Scc4突变对减数分裂关键事件的影响,初步阐明了Scc4在减数分裂中的功能及其作用机制。该研究完善了 Scc4的生物学功能,促进了人们对减数分裂分子机制的理解。

关键词：酿酒酵母减数分裂 Scc4 黏着素重组