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黄色粘球菌发育阶段外膜蛋白表达的变化（英文）

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微生物学通报 2015年第6期42卷 1025-1031页

作者：赵金凤金晶毛晓华东南大学医学院基础医学实验教学中心细胞分子实验室江苏南京210009 东南大学医学院生物化学系江苏南京210009

【目的】黄色粘球菌是研究原核发育的一种模式生物,对其膜蛋白的研究仍然十分缺乏。【方法】利用6种预测软件,在黄色粘球菌的基因组中筛选编码外膜蛋白(OMP)的基因。根据报告基因lac Z,检测这些基因在营养性生长和发育阶段的表达。【结... 详细信息

【目的】黄色粘球菌是研究原核发育的一种模式生物,对其膜蛋白的研究仍然十分缺乏。【方法】利用6种预测软件,在黄色粘球菌的基因组中筛选编码外膜蛋白(OMP)的基因。根据报告基因lac Z,检测这些基因在营养性生长和发育阶段的表达。【结果】基于生物信息学分析,筛选出11个编码外膜蛋白的基因。其中2个基因(MXAN3106和MXAN3883)在发育阶段表达量上升,它们分别编码Secretin家族和Fimbrial usher protein(FUP)家族转运蛋白。其余9个基因在发育起始阶段表达量降低或保持较低水平,它们均编码Ton B依赖型受体或外排蛋白。【结论】这些数据提示,黄色粘球菌由生长到发育的转换过程,伴随着膜蛋白表达的显著变化。

关键词：黄色粘球菌膜蛋白基因表达

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黄色粘球菌和铜绿假单胞菌的相互关系研究

黄色粘球菌和铜绿假单胞菌的相互关系研究

作者：卢会宁天津大学

学位级别：硕士

黄色粘球菌和铜绿假单胞菌作为环境中普遍存在的生物被膜菌,都具有出色的表面运动能力,通过产生胞外基质调控自身的运动行为及生物被膜的形成,但关于二者相互作用的研究却很少。本课题分别从黄色粘球菌分泌的胞外多糖(exopolysaccharide... 详细信息

黄色粘球菌和铜绿假单胞菌作为环境中普遍存在的生物被膜菌,都具有出色的表面运动能力,通过产生胞外基质调控自身的运动行为及生物被膜的形成,但关于二者相互作用的研究却很少。本课题分别从黄色粘球菌分泌的胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)对铜绿假单胞菌表面运动的影响和黄色粘球菌捕食铜绿假单胞菌这两个方面,来探究它们之间的相互作用关系。我们首先通过黄色粘球菌DK1622和铜绿假单胞菌在玻璃基底上的运动和定殖,分别制备了覆盖EPS和覆盖Psl的玻璃表面,进而利用高通量的显微追踪技术,原位监测铜绿假单胞菌分别在EPS修饰和Psl修饰的玻璃表面上的运动行为。通过观察铜绿假单胞菌WT PAO1和Psl敲除菌株△pslBCD在EPS修饰的玻璃表面上的运动,发现相比于未修饰的玻璃表面,其在EPS修饰的玻璃表面的运动速率降低、表面扩散减慢、轨迹更加集中,而且相比于Psl敲除菌株△pslBCD,野生型菌株PAO1受EPS的影响程度更大。该结果表明铜绿假单胞菌在EPS修饰的表面上的运动受到一定限制,并且Psl参与介导了细胞和EPS的相互作用。作为对照,我们也对铜绿假单胞菌在Psl修饰的玻璃表面上的运动行为进行了观察。结果发现在Psl修饰的表面,铜绿假单胞菌的运动同样受到了限制。但是相比于WT PAO1,△pslBCD受Psl的影响程度更大。对比铜绿假单胞菌在EPS表面上的运动行为,该结果进一步支持了Psl参与介导了细胞和EPS的作用。为了进一步理解Psl的作用,我们观察了Psl感应缺陷株△sia D在Psl修饰的玻璃表面的运动行为,结果发现其表面行为几乎不受表面修饰的影响,暗示Sia D在铜绿假单胞菌表面感知Psl信号的重要作用,与文献结果相符。此外,我们从单细胞和群体水平探究了黄色粘球菌DK1622捕食铜绿假单胞菌PAO1的过程。单细胞运动行为的分析结果表明相较于非捕食情况,在捕食过程中黄色粘球菌的运动速率降低、轨迹更加弯曲、方向更容易改变,定量化了细胞之间的物理接触对捕食行为的影响。通过观察黄色粘球菌运动突变株(A+S-、A-S+)和TA突变株(TA-)的捕食过程,我们进一步解析了黄色粘球菌的运动行为和分泌的抗生素TA在其捕食中的作用,发现捕食过程中双运动系统比抗生素起到更重要的调控作用。

关键词：黄色粘球菌铜绿假单胞菌胞外多糖捕食运动生物被膜

黄色粘球菌中四型菌毛蛋白与胞外多糖特异性结合关键位点的研究

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黄色粘球菌中四型菌毛蛋白与胞外多糖特异性结合关键位点的研究

作者：张坤梅山东大学

学位级别：硕士

作为粘细菌的模式菌,黄色粘球菌具备多细胞水平的典型社会性特征,能够进行复杂多样化的细胞行为并贯穿于其生命周期的各个环节,主要包括:在固体介质表面进行的群体细胞运动过程;群体细胞的捕食过程;子实体的发育。其中社会性细胞运动(S... 详细信息

作为粘细菌的模式菌,黄色粘球菌具备多细胞水平的典型社会性特征,能够进行复杂多样化的细胞行为并贯穿于其生命周期的各个环节,主要包括:在固体介质表面进行的群体细胞运动过程;群体细胞的捕食过程;子实体的发育。其中社会性细胞运动(S运动)是黄色粘球菌进行捕食和分化发育的行为基础,其分子机制的解析对黄色粘球菌多细胞水平的社会性行为研究具有重要的理论指导意义。S运动系统主要介导了黄色粘球菌细胞在固体表面的群体运动过程,与铜绿假单胞菌的颤动系统非常类似,胞外多糖(EPS)和Ⅳ型菌毛(TFP)参与的收缩模型是目前普遍接受的S运动分子机制。EPS为TFP的收缩提供了锚定的位点;细胞前导端伸出的TFP细丝抓住附近细胞产生的EPS并激发收缩,从而拉动细胞以粘-滑交替的方式前行。在这一过程中,TFP与EPS这两个胞外生物大分子之间的特异性相互作用的实质是极为重要的科学问题。在本学位论文中,我们对组成TFP的菌毛蛋白PilA与EPS在互作过程中各自参与识别的关键位点进行了探寻。首先,我们利用表面等离子共振的方法,基于直接偶联、多循环动力学-捕获、单循环动力学-捕获以及多循环动力学竞争等手段构建了 PilA-糖类生物大分子体外相互作用的检测体系。首先分析了 EPS天然类似物壳聚糖与PilA蛋白的相互作用。结果显示,不同分子量的壳聚糖均可以通过直接偶联的方式与PilA蛋白相互作用。随后,根据提取方法的不同,我们从黄色粘球菌DK1622菌株中获取了可溶性与不可溶性的EPS,在直接偶联模式下,无论是可溶性还是不可溶性的EPS均与PilA蛋白存在相互作用。直接偶联法由于偶联的方式简单被广泛应用,但是该方法也存在特异性吸附以及蛋白偶联方向不一致导致蛋白结合位点被屏蔽等弊端。因此,我们改进了检测手段,建立了多循环动力学-捕获法以及单循环动力学-捕获法,EPS与PilA蛋白相互作用的阳性信号响应值明显增大。既然EPS与PilA蛋白间存在相互作用,那么EPS参与识别PilA蛋白的关键位点是什么?我们分别检测了参与构成EPS的各个单糖组分与PilA蛋白之间的结合能力。结果显示,含有氨基的单糖能够与PilA蛋白结合,而无修饰的单糖以及N-乙酰修饰的氨基单糖均不能与PilA蛋白结合。该结果与等温滴定量热仪测定的结果一致。同时,基于多循环动力学-捕获法的竞争实验结果显示葡萄糖胺能够与EPS竞争性结合PilA蛋白。另一方面,我们对PilA蛋白参与识别EPS的关键位点也进行了分析。根据生物信息学分析的结果,我们推测PilA蛋白中有22个氨基酸残基位点可能参与了 EPS的识别。从中选取了 3个位点,即Tyr69、Trp146、Trp181,分别将其突变成为Ala。体外互作的结果显示,PilA(W146A、W181A)突变型蛋白和EPS的相互作用与野生型蛋白无差别,而PilA(Y69A)突变型蛋白与氨基糖类的相互作用消失,推测Tyr69可能是PilA蛋白与EPS互作识别时的关键位点。随后,将含有突变位点的全长PilA基因回补到PilA蛋白缺失菌株10410中,结果显示菌株 DK10410::PilAY69A,DK10410::PilAw146A和 DK10410::Pi1Aw181A在固体平板上的S运动能力丧失。在甲基纤维素实验中,菌株DK10410::PilAY69A和DK10410::PilAW146A呈现出一定程度的运动趋势,而菌株DK10410::PilAw181A没有明显运动趋势。Western Blot分析显示,三种回补菌株均没有表面菌毛,菌株菌株DK10410::PilAY69A和DK10410::PilAw146A具有全细胞菌毛蛋白。根据以上实验结果,我们认为Trp146突变后能够产生PilA蛋白,但是PilA蛋白不能进行有效组装,而Trp181突变后不产生任何的PilA蛋白。Tyr69突变后能够产生少量的PilA蛋白,但是PilA蛋白不能进行有效组装。

关键词：黄色粘球菌四型菌毛蛋白胞外多糖分子相互作用关键位点

黄色粘球菌四型菌毛与胞外多糖特异性相互作用的分子机制研究

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黄色粘球菌四型菌毛与胞外多糖特异性相互作用的分子机制研究

作者：李浩铭山东大学

学位级别：硕士

黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)是一类由土壤分离的革兰氏阴性细菌,具有区别于其他原核生物的复杂多细胞行为,如群体运动、形成子实体和抗逆性的粘孢子以及对外界大分子物质的捕食行为。依赖于鞭毛的滑动运动(Gliding motility)使粘细... 详细信息

黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)是一类由土壤分离的革兰氏阴性细菌,具有区别于其他原核生物的复杂多细胞行为,如群体运动、形成子实体和抗逆性的粘孢子以及对外界大分子物质的捕食行为。依赖于鞭毛的滑动运动(Gliding motility)使粘细菌细胞可以沿长轴方向运动,粘细菌的滑动运动由A (adventurous)运动和S (social)运动两个相互独立的系统组成。A运动系统中,细胞可以独立的运动;S运动系统则依赖于细胞间的相互接触,细胞可以共同的运动。粘细菌特殊的滑动运动与铜绿假单胞菌和淋病柰瑟氏菌的颤搐运动(Twiching motility)具有一定的相似性。黄色粘球菌的S运动研究显示,S运动受到四型菌毛(Type Ⅳ pili, TFP)、胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)和脂多糖O-抗原的共同调控作用。研究发现,TFP周期性的伸长和收缩介导S运动的进行,且该过程依赖于TFP和EPS的相互作用。作为S运动的器官,TFP由数千个pilin (PilA)亚单位呈螺旋状排列构成。TFP在细胞一端聚集,伸长并粘附在介质或相邻细胞的表面,收缩拉动细胞运动。EPS是S运动中的另一关键组分,为TFP提供粘附的位点,EPS对于粘球菌生物膜骨架和子实体形成、细胞间的聚集及细胞与介质粘附作用等具有重要的作用。目前关于TFP与EPS间特异性的相互作用曾被提出,并研究出一些自然状态下两个分子相互作用的证据,但对于TFP和EPS之间具体的作用机制以及定量的分析一直是研究的难点。本文采用实时和非生物标记的研究方法,定量的对PilA蛋白和EPS特异性的识别和结合过程进行分析,以此阐明TFP与EPS特异性相互作用的分子机制。本文第二章,详细的描述了黄色粘球菌PilA蛋白的异源表达和EPS的分离纯化过程。由于PilA蛋白较差的水溶性,全长的PilA蛋白很难在体外大量的可溶性表达。基于前期的实验研究和生物信息学分析,我们构建了含有截短的PilA蛋白的异源表达质粒,截短的PilA蛋白只含有C-端的结构域(含32-208位氨基酸),体外实验证实了截短的PilA蛋白与野生型PilA蛋白具有相同的EPS结合能力。同时,通过大平板培养黄色粘球菌DK1622,分离纯化了得到EPS样品。利用气相色谱／质谱联用(GC/MS)方法,对纯化的EPS进行组分分析,结果发现EPS是一类复杂的混合多糖,由不同比例的葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、葡萄糖胺、N-乙酰-葡萄糖胺和N-乙酰-甘露糖胺等组分构成。本文第三章,主要介绍了利用非标记的生物物理技术,如表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR)和等温量热滴定(isothermal titration calorimetry,ITC)技术,利用GC/MS分析并确认存在于粘球菌EPS组分中的某些单糖与PilA蛋白的相互作用情况,并以此分析两个分子结合过程中的动力学和热力学数据。实验结果显示,在EPS的所有糖组分中,葡萄糖胺可以与PilA蛋白发生特异性的相互作用,据此猜测TFP可能识别葡萄糖胺作为结合位点。另外,壳聚糖是由葡萄糖胺和N-乙酰-葡萄糖胺组成的多聚糖,与PilA蛋白可以发生明显的相互作用,并且结合作用的强度随着壳聚糖分子量的增加而呈现减小的趋势。在糖竞争作用实验中,葡萄糖胺可以抑制与壳聚糖的与PilA蛋白的结合作用,这可能与葡萄糖胺和壳聚糖与PilA蛋白有着相同的作用位点有关。本文第四章,期望通过多种生物信息学方法,分析得到PilA蛋白上与EPS相互作用的关键位点信息。通过分析,预测得到22个可能的与多糖发生结合作用位点。壳聚糖可以替代EPS行使其在S运动中的功能,在22个预测的作用位点中,由几丁质酶的识别葡萄糖胺的位点预测的146位和181位的色氨酸残基,是两个关键位点。通过点特异性突变,将两个位点的色氨酸残基(W)分别突变成了丙氨酸残基(A),并分离纯化得到了突变的PilA蛋白。但是,ITC实验结果显示,两个突变的PilA蛋白与葡萄糖胺和壳聚糖的滴定结果与野生型的PilA蛋白相似。说明146位和181位的色氨酸残基对于PilA与EPS的结合并没有很大的影响,目前对其他20个预测位点进行相应分析和验证工作。

关键词：黄色粘球菌四型菌毛胞外多糖表面等离子共振等温量热滴定

黄色粘球菌DK1622双拷贝recA基因的功能分析

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黄色粘球菌DK1622双拷贝recA基因的功能分析

作者：王昳雪山东大学

学位级别：硕士

粘细菌(Myxobacteria)是一类革兰氏阴性细菌,具有较好的环境适应性和分布的地理性特征,是多种自然环境中的优势菌群。作为一种原核生物,粘细菌拥有庞大的基因组和较多的重复基因,因此,粘细菌是研究原核生物基因重复的重要实验材料。Rec... 详细信息

粘细菌(Myxobacteria)是一类革兰氏阴性细菌,具有较好的环境适应性和分布的地理性特征,是多种自然环境中的优势菌群。作为一种原核生物,粘细菌拥有庞大的基因组和较多的重复基因,因此,粘细菌是研究原核生物基因重复的重要实验材料。RecA是一个多功能的蛋白,它既是一种重组酶,作为DNA重组修复和基因同源重组相关过程的中心组成部分,介导一系列DNA链交换反应,为同源重组的中心步骤创造条件;同时还参与了细胞对DNA损伤的应答(SOS反应),RecA作为一种蛋白酶参与SOS反应中LexA和几个相关的抑制因子的裂解,使SOS反应发挥作用。大多数细菌基因组中只有一个recA的拷贝,因此人们虽然对RecA已经有了较为深入的认识,但大多是基于单拷贝RecA的结构、功能及调控等方面展开的,对于多拷贝recA的功能分化及调控机制仍知之甚少。在以往的研究中发现,芽孢杆菌和粘细菌中存在双拷贝recA现象,在巨大芽孢杆菌(***)中,双拷贝的recA基因均受损伤诱导,且在大肠杆菌中也同样表现出一定的DNA修复能力。在黄色粘球菌模式菌株Myxococcus xanthus DK1622中编码两个recA基因,recA1(MXAN441)和recA2(MXAN388),RecA1和RecA2都能部分恢复大肠杆菌recA缺失突变体的抗紫外线能力,但只有recA2的表达受丝裂霉素或萘啶酸的诱导。然而,之前的研究都没有涉及双拷贝recA基因的功能,以及更加深入的分子机制及表达调控的探究。因此,本文以黄色粘球菌DK1622为实验材料,采用体内体外的生物化学和分子生物学实验与生物信息学以及转录组分析相结合的方法,初步解释了双拷贝recA的细胞功能。黄色粘球菌模式菌株DK1622中,recA1和recA2的表达量是受到严格调控的,并且这两种RecA蛋白是在DNA损伤修复的不同阶段发挥作用。通过构建recA1,recA2的敲除突变株,并分别测定野生型与两个突变株在不同损伤条件下的生长曲线及存活率,证明了 RecA1与RecA2在参与细胞的损伤修复中有不同的分工,其中RecA1主要负责应对紫外线带来的细胞损伤,而RecA2在抵抗H2O2的氧化损伤中发挥主要作用。RecA重组酶需要水解ATP提供能量,体外ATP酶活性实验结果说明,单链和双链DNA都能显著提高RecA1和RecA2的ATP酶活性,但单链DNA的效果更为明显,而且DNA的添加对于RecA1的ATP酶活性提高效果较RecA2更为明显。进一步的同源重组率分析、链入侵反应以及DNA链交换反应的结果都表明,只有RecA1参与同源重组过程。RT-qPCR显示recA1的缺失影响了lexA被紫外线诱导,而缺失recA2则不影响,这说明只有RecAI负责依赖于lexA的SOS反应,RecA2不参与这一反应。同时,RecA催化LexA蛋白自裂解的实验也表明,只有RecA1参与了依赖于LexA的SOS诱导反应。通过氨基酸序列比对表明,RecA1、RecA2存在功能差异的根本原因可能在于二者N端和C端结构域氨基酸存在的较大差异。由于RecA2的内部螺旋部分呈碱性,且MxLexA存在碱性长linker区,因此可能阻碍了其与RecA2的结合,从而不具有促进LexA自裂解的能力。对RA2突变株的转录组数据基于GO和KEGG数据库富集分析,结果表明差异表达基因主要富集在两个功能区,分别是转运定位以及抗氧化,结合实验结果,RecA2的功能应该涉及细胞的转运和抗氧化相关功能。结合实验结果以及粘细菌本身特性,我们认为双拷贝RecA的功能分化和严格的表达调控可能是大基因组中存在大量重复序列的细菌避免错误重组的一种策略。

关键词： RecA 重复基因黄色粘球菌功能分化

黄色粘球菌生物被膜中胞外DNA的整合机制与生物学功能

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黄色粘球菌生物被膜中胞外DNA的整合机制与生物学功能

作者：郑悦山东大学

学位级别：硕士

自然条件下,细菌附着于生物或者非生物表面,通过一系列的复杂过程,形成群落化和高度结构化的生物被膜(biofilm)结构,该生物被膜结构主要由蛋白质,多糖,核酸等物质组成。生物被膜作为一种更有优势的生存模式,可以帮助细菌对抗恶劣的环境... 详细信息

自然条件下,细菌附着于生物或者非生物表面,通过一系列的复杂过程,形成群落化和高度结构化的生物被膜(biofilm)结构,该生物被膜结构主要由蛋白质,多糖,核酸等物质组成。生物被膜作为一种更有优势的生存模式,可以帮助细菌对抗恶劣的环境条件,如紫外线、金属毒害、不利pH、干燥、强盐、抗生素等不利环境。粘细菌(Myxobacteria)作为一类高等原核生物类群,是研究原核生物分化发育和细胞间信号传导的重要材料,并能形成十分复杂的生物被膜结构。通过我们的前期研究,首次证实了粘细菌的代表类群黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)形成的生物被膜胞外基质中存在大量高度组织化的胞外DNA(Extracellular DNA,eDNA),并且 eDNA 与胞外多糖(Extracellular polysaccharide,EPS)分子呈现了明显的共定位分布,形成了复合型的胞外基质(Extracellular matrix,ECM)。我们提出***胞外基质中 eDNA 与EPS分子之间发生了大分子相互作用,这一相互关系导致了 eDNA以一种化学/物理有序的方式与EPS紧密交织,遵循类似的构建和分布方式,形成复合型胞外基质的网络结构,为黄色粘球菌生物被膜履行各种生物功能提供物质和结构基础。本论文综合利用微生物学、生物化学以及分子生物学等多种方法,按照从简单到复杂,从体内到体外,从化学分子水平到细胞系统水平的原则展开了相关研究。首先,我们对eDNA与EPS的相互作用进行了确认,接着探究二者相互作用的化学本质以及二者的相互作用对DNA构象的影响。我们对纯化后的eDNA和EPS进行了体外相互作用表征,利用透射电子显微镜观察,确认了二者可以在体外形成复合物。光散射技术建立的eDNA-EPS体外相互作用的表征体系表明,DNA-EPS复合物的形成可导致光散射强度的强烈增加。接着,我们探究了随pH的变化,EPS与DNA之间结合强度的变化。结果显示,荧光的增强幅度与pH有关。这说明在eDNA-EPS体外相互作用的过程中,静电作用可能处于主导位置。另外,使用溴化乙锭(EB)进行染料的竞争替代实验是表征待测物质与DNA相互作用的非常有效的方法。我们通过染料替代的实验方法验证了 EPS和DNA之间的结合作用。在不使用外源探针的情况下,我们利用傅里叶变换红外光谱技术测定DNA-EPS之间结合的特征,结果表明,EPS分子可能只是嵌入了 DNA分子的大沟中,并不足以影响DNA的构象。然后,我们通过圆二色谱进一步确认了 EPS对DNA构象的影响,实验结果表明DNA仍然保持了 B构象,也就是说EPS与DNA的相互作用是一种中弱强度的相互作用,保持了一定程度的可逆性。在上述的实验基础之上,我们表征了 eDNA-EPS的相互作用所赋予整合型ECM的相关生物学功能和特性,通过系统的实验证明了 eDNA与EPS的相互作用对于构建DNA-EPS整合型ECM以及功能的履行是十分重要的。首先,我们表征了 DNA-EPS复合物的粘着力,结果显示复合物的粘度比单独的DNA和EPS粘度明显增大。原子力显微镜(AFM)的检测结果也表明经DNase Ⅰ处理后的生物被膜表面粘附力也明显减弱。这说明eDNA对维持胞外基质的粘附力和机械强度有非常重要的作用。接下来我们确认了 EPS具有保护DNA免受各种核酸水解酶攻击的作用,从而保证eDNA在基质中持续稳定地存在。此外,我们证实了具有eDNA的*** DK1622生物被膜对于阴离子和阳离子表面活性剂具有更强的耐受性,并且去除eDNA后细胞对氨基糖苷类抗生素的耐受性减弱,这说明eDNA-EPS复合型的ECM可以提高生物被膜的耐受性和抗逆性。***子实体和粘孢子是其抵御恶劣环境的一种策略,除此之外,***可以捕食包括蓝细菌、大肠杆菌、根瘤菌等各种原核生物。我们探究了 eDNA缺陷菌株对粘细菌子实体发育和捕食的影响,结果表明,eDNA对于其子实体发育基本无影响,对大肠杆菌的捕食、摄食以及邻近捕食也无影响。有趣的是,我们发现在加入DNA的培养条件下,SW504(△difA)得到了更好的生长,说明eDNA可以作为细胞的营养成分支持其在饥饿条件下的存活。最后,我们分别在液体培养条件下以及生物被膜培养条件下对*** eDNA含量随其生长的变化趋势进行了测定。初步的研究结果表明,*** eDNA主要来自于细胞生长后期的细胞裂解,且eDNA与基因组DNA具有极高的相似性。另外,在细胞没有发生裂解的情况下,生长前期的eDNA的释放表明,***很可能还存在一个eDNA的主动分泌过程,这一点还有待于进一步验证。本论文的研究结果不但可以帮助我们更加深入地了解eDNA和EPS在细菌生物被膜形成过

关键词：黄色粘球菌生物被膜胞外基质胞外DNA 胞外多糖

水稻酚酸与萜类物质组合对黄色粘球菌的诱导作用及其抑草潜力研究

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水稻酚酸与萜类物质组合对黄色粘球菌的诱导作用及其抑草潜力研究

作者：渐欣福建农林大学

学位级别：硕士

植物化感潜力的形成涉及复杂的根际微生物学过程是当前普遍认同的学术观点。前期研究表明强化感水稻PI312777根际土壤中粘球菌的数量显著高于非化感水稻Lemont根际土壤中的数量,外源分别添加肉桂酸、阿魏酸能够促进粘球菌的增殖并显著... 详细信息

植物化感潜力的形成涉及复杂的根际微生物学过程是当前普遍认同的学术观点。前期研究表明强化感水稻PI312777根际土壤中粘球菌的数量显著高于非化感水稻Lemont根际土壤中的数量,外源分别添加肉桂酸、阿魏酸能够促进粘球菌的增殖并显著增强其化感抑草潜力,推测化感水稻的根系分泌物能够促进该菌生长增殖与聚集,并在水稻化感抑草过程中发挥重要作用。为深入揭示不同化感物质组合对粘球菌的促进效应,本研究通过外源添加混合酚酸、混合萜类、混合酚酸加萜类组合,探讨这些化感物质对黄色粘球菌增殖的诱导效应,结果显示各测试浓度下的化感物质组合处理都能对粘球菌的生长产生促进作用,但以混合酚酸的诱导效果最为显著,显示了该菌对酚酸类化感物质的高效趋化作用与化感诱导效果。进一步采用稗草迟播法对各诱导条件下粘细菌的抑草能力进行评价,结果显示添加混合酚酸、混合酚酸加萜类组合,粘球菌的抑草潜力较对照组达到显著性差异,其中添加混合酚酸对稗草的抑制效果最明显,混合萜类处理效果不明显,暗示着混合酚酸在水稻化感抑草作用的重要性。在化感物质的诱导过程中,调控粘球菌群体社会行为的趋化相关基因也可能发生相应的表达变化,为研究这一变化,进一步提取混合酚酸、混合萜类、混合酚酸加萜类组合的最佳诱导浓度处理下黄色粘球菌的总RNA,运用荧光定量PCR技术检测各诱导条件下粘球菌中与趋化相关的csgA、FruA、FrzCD、csgB、csgG、FrzA和FrzE 基因较对照组的表达差异,结果显示混合酚酸、混合酚酸加萜类组合诱导下,上述各基因均较对照组上调表达,且在诱导3-6小时下的基因表达水平最高,而混合萜类诱导下12-24小时甚至48小时以后,部分基因才有较微弱的上调表达,而FrzE则在不同诱导时间下均较对照下调表达。由此可见,混合酚酸较混合萜类更显著促进了黄色粘球菌中化学趋化基因的表达,表现为短时间内就能促进这些基因的增强表达,且上调倍数大,预示酚酸能够有效调控粘球菌群体社会行为。进一步以不同组合诱导培养3小时的粘细菌发酵液为材料,测定发酵液对稗草的生长抑制率,结果发现混合酚酸、混合酚酸加萜类组合诱导3个小时的发酵液对稗草茎长的抑制效果明显,分别为23.3%和23.6%.混合萜类诱导的粘球菌的发酵液以及粘球菌的单独发酵液对稗草的抑制效果不明显,仅为3.8%和7.1%。通过上述研究预示粘球菌能够利用这些化感物质,为揭示粘细菌与化感物质的相互关系,利用GC-QQQMS分析了各混合物质诱导下黄色粘球菌的代谢产物,结果发现在混合酚酸、混合酚酸加萜类组合诱导后,粘细菌的次级代谢产物在数量和种类上均较对照组存在明显差异,且诱导后发现具有有生物活性作用的物质,如槲皮素等,这可能是添加酚酸类化感物质后粘细菌的抑草能力增强的原因之一。与之相对,添加混合萜类,粘球菌的次级代谢产物种类和数量增加不明显。进一步为验证槲皮素是否具有抑草潜力,将槲皮素外源添加进行稗草的抑制率试验,结果显示槲皮素对稗草根茎长均有一定的抑制作用,对根长的抑制效果大于对茎长的抑制,且随着槲皮素浓度的增加抑制效果也逐渐增加,浓度为 0.32mg/L、3.2mg/L、16mg/L、32mg/L、160mg/L的槲皮素对根长的抑制率分别达14.1742%、30.5455%、34.5894%、36.3033%、60.5901%。综上所述,本研究认为以酚酸为主的化感物质组合对粘细菌的生长增殖具有显著的促进作用,该体系下的化感抑草潜力最高;萜类化合物与粘细菌互作对稗草的抑制效果不明显。酚酸诱导能够促使黄色粘球菌的趋化基因表达增强,促进其生长增殖,此外,酚酸类化感物质能够刺激粘球菌产生具有抑草活性的槲皮素等化合物,增强抑草能力。通过本研究进一步证实酚酸类化合物在水稻化感抑草作用中的重要作用,这类物质能与粘球菌相互作用,最终提高化感抑草潜力。

关键词：化感物质黄色粘球菌趋化基因抑草潜力次级代谢物

具有抑草潜力的化感水稻根际黄色粘球菌的增殖机制研究

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具有抑草潜力的化感水稻根际黄色粘球菌的增殖机制研究

作者：林威鹏福建农林大学

学位级别：硕士

植物释放的化感物质与其根际土壤微生物相互作用最终决定植物化感潜力已成为当前普遍认可的学术观点。前期研究发现,水稻第2号染色体上的PAL基因(PAL-2)是化感水稻PI312777酚酸类物质合成的重要功能基因,该基因被干扰后的转基因植株酚... 详细信息

植物释放的化感物质与其根际土壤微生物相互作用最终决定植物化感潜力已成为当前普遍认可的学术观点。前期研究发现,水稻第2号染色体上的PAL基因(PAL-2)是化感水稻PI312777酚酸类物质合成的重要功能基因,该基因被干扰后的转基因植株酚酸类物质合成能力和化感抑草效果均明显弱于野生型植株,且转基因水稻根际土壤中的细菌多样性降低,其中包括粘球菌等粘细菌属微生物。已有研究还发现强化感水稻PI312777根际土壤中粘球菌数量丰富,并显著高于非化感水稻根际土壤中的数量,暗示粘球菌在水稻化感作用根际生物学过程中具有重要作用。据此,为深入揭示酚酸类化感物质与化感水稻根际粘球菌的相互关系,本研究以强化感水稻PI312777(PI)、非化感水稻Lemont(LE)以及化感水稻PI312777的PAL-2基因过量表达(PAL-OE)和干扰(PAL-RNAi)的转基因植株为材料,经甲醇浸提法提取水稻五叶期根系分泌液进行过滤除菌后,分别接种和不接种强化感水稻根际黄色粘球菌,检测混合物对稗草萌发和生长的影响。生测结果显示,经过滤除菌的不同水稻根系浸提液对稗草的生长抑制率均未达到显著差异;而PAL-OE根系浸提液与黄色粘球菌混合物的抑草率显著高于野生型PI312777根系浸提液与粘球菌混合物的抑草率,PAL-RNAi根系浸提液与粘球菌混合物的抑草率则显著降低;进一步运用实时荧光定量PCR(qPCR)检测不同处理下土壤中粘球菌的数量,结果表明生物测试显示出的化感抑草能力的强弱与土壤粘球菌属微生物的数量呈现出明显的正相关,暗示PAL-2基因调控酚酸类化感物质的合成与分泌后进一步影响了土壤中粘球菌属微生物的群体生长,最终对受体稗草产生化感效应。在此基础上,利用阿魏酸和肉桂酸对黄色粘球菌进行诱导培养,并动态检测黄色粘球菌的生长变化情况以及粘细菌对酚酸类物质的利用率,结果表明,适宜浓度的阿魏酸和肉桂酸均可作为信号物质促进粘细菌细胞的增殖,其中以0.10mM阿魏酸对黄色粘细菌增殖的促进作用最为明显。进一步利用二甲基化标记技术对阿魏酸诱导下黄色粘球菌菌体蛋白及分泌至发酵液中蛋白进行质谱鉴定,结果显示黄色粘球菌蛋白质表达量显著地受阿魏酸处理影响,其中在0.05mM与O.10mM阿魏酸诱导下,鉴定到共同上调表达的蛋白质76种,共同下调表达的蛋白质56种,其中共同上调表达的蛋白质涉及的功能包括营养生长、运动、信号响应与转导、代谢过程、次级代谢物质产生、群体捕食、转运和胞内运输等。对重要差异蛋白进行转录水平验证,结果显示不同浓度阿魏酸诱导下frzS、MXAN023、MXAN668和MXAN339基因在mRNA水平和相应蛋白水平的变化情况基本一致。进一步对Frz基因家族另外5个成员基因frzA、frzB、frzCD、frzE、frzG的表达变化模式进行检测,结果也显示0.1OmM阿魏酸诱导下黄色粘球菌中5个Frz成员基因均明显上调表达。上述研究结果初步揭示了具有化感抑草潜力的化感水稻根际黄色粘球菌的增殖机制,为深入理解水稻酚酸类化感物质与根际土壤微生物的相互作用机制提供了理论依据。

关键词：酚酸类化感物质黄色粘球菌 Frz基因趋化性阿魏酸

用海藻酸钙胶珠固定化粘质沙雷氏菌和黄色粘球菌生长细胞生产蛋白酶

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应用微生物 1989年第2期 21-23页

作者： Vuil.,JC 戈苏国