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南开大学学报（自然科学版） 2009年第3期42卷 46-52页

作者：刘沐之马挺唐赟吕晶华梁凤来刘如林南开大学生命科学学院天津市功能基因组学重点实验室天津300071 西华师范大学生命科学学院四川南充637002

对1株高温解烃菌NG80-2黄素还原酶基因nfr进行了克隆,并在*** BL21中实现高效表达。对纯化的Nfr酶学性质进行研究,发现Nfr可以利用NADH、NADPH、FMN、FAD分别作为供氢体和氢受体,其中NADPH和FMN为最适底物.Nfr的最适反应温度为60～70℃... 详细信息

对1株高温解烃菌NG80-2黄素还原酶基因nfr进行了克隆,并在*** BL21中实现高效表达。对纯化的Nfr酶学性质进行研究,发现Nfr可以利用NADH、NADPH、FMN、FAD分别作为供氢体和氢受体,其中NADPH和FMN为最适底物.Nfr的最适反应温度为60～70℃,最适反应pH为5.0.在耐受性试验中,此酶在65℃高温中保温30 min后可保持47.3%的相对酶活。在受试的金属离子中,Fe^(2+)对酶活性的抑制作用最大。

关键词：高温解烃菌黄素还原酶克隆表达酶学性质

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兼性嗜热古地分枝杆菌X7C脱有机硫关键酶黄素还原酶的纯化和性质分析

兼性嗜热古地分枝杆菌X7C脱有机硫关键酶黄素还原酶的纯化和性质...

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作者：郑媛山东大学

学位级别：硕士

化石燃料中含有的硫成分,在燃烧后转化成二氧化硫进入空气,是造成污染的重要原因之一。目前,加氢脱硫（Hydrodesulfurization,HDS）是在工业上应用的比较常规的脱硫方法,此方法是个高温加氢催化过程,可以有效地脱除无机硫和简单的有机... 详细信息

化石燃料中含有的硫成分,在燃烧后转化成二氧化硫进入空气,是造成污染的重要原因之一。目前,加氢脱硫（Hydrodesulfurization,HDS）是在工业上应用的比较常规的脱硫方法,此方法是个高温加氢催化过程,可以有效地脱除无机硫和简单的有机硫成分,但却很难脱除石油中大量的多聚环结构的有机硫,随着低硫限制的提高,已经不能满足人们要求。而新近兴起生物催化法脱硫（Biodesufurization,BDS）,在常温下即可进行,并且对有机硫分具有高专一性,这使得BDS方法成为一种可供选择的方法,和HDS方法一起进行石油的脱硫。本课题组筛选获得能够在45℃条件下生长的一株古地分枝杆菌,短杆状,大小为0.3～0.5×2.0～3.0μm;革兰氏染色不易着色,通常为弱阳性;抗酸染色阳性,不运动,无孢子和荚膜;菌株细胞壁含有谷氨酸,丙氨酸和消旋二氨基庚二酸;主要的细胞壁糖为阿拉伯糖,半乳糖;可以在麦康凯培养基生长,不生成结晶紫,并且能抗5%NaCl。并且古地分枝杆菌X7C使用超声波破碎后,黄素还原酶酶活的情况,比红球菌IGTS8的酶活要高。由于是胞内酶体系,因此首先使用超声波破碎的方法释放出胞内蛋白,之后参考过去的经验进行了大幅度改进,重新优化了硫酸铵沉淀的条件,并且在经过鱼精蛋白沉淀,硫酸铵分级沉淀后先后使用两次Butyl-Sepharose FF层析,分子筛Sephadex G-100和Superdex 75层析,以及离子交换Q-Sepharose FF层析。最后得到了电泳纯的单带,虽然得率只有1.9%,但是却满足了N端测序的要求,测得N端序列为VNQQQADKM,在GenBank上Blast后发现与已收录的蛋白质序列没有任何同源性,因此需要采用基因组文库筛选的方法来获得基因。通过对纯化出的DszD酶的性质测定,可以看出这个酶在pH8.0,45℃酶活达到最大,属于兼性耐高温的酶。与IGTS8中的DszD不同,此酶除了作用于NADH和FMN之外,还可以作用于NADPH和FAD。

关键词：黄素还原酶生物脱硫基因文库

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2-萘酸加单氧酶基因及NADH:黄素还原酶基因的克隆与分析

2-萘酸加单氧酶基因及NADH:黄素还原酶基因的克隆与分析

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作者：李小波中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）

学位级别：硕士

偶氮芳香族化合物在自然界广泛存在,而且每年以数百万吨的数量被制造出来。许多偶氮芳香族化合物在化工工业上有重要用途,但该类化合物在使用过程中往往会造成严重的环境污染。2-萘酸是一种在化学结构上类似偶氮芳香族物质基本结构萘磺... 详细信息

偶氮芳香族化合物在自然界广泛存在,而且每年以数百万吨的数量被制造出来。许多偶氮芳香族化合物在化工工业上有重要用途,但该类化合物在使用过程中往往会造成严重的环境污染。2-萘酸是一种在化学结构上类似偶氮芳香族物质基本结构萘磺酸的化合物,研究2-萘酸的微生物代谢途径,确定其代谢过程中的酶系统以及对应的代谢基因,可以为偶氮类化合物的微生物降解提供理论依据,为通过基因工程技术构建多功能高效的环境污染物降解菌创造条件。伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)JT1500 是一株2-萘酸(2-naphthoate)降解菌,通过该菌株的转化作用,1mol 的2-萘酸可被转化为1mol 的丙酮酸,1mol 的琥珀酸,1mol 的乙酰CoA 和2mol 的CO, 在该过程中2-萘酸生物降解的关键步骤之一是通过2-萘酸加单氧酶羟化2-萘酸生成1-羟基-2-萘酸(1-hydroxy-2-naphthoate)。本研究对含有该2-萘酸加单氧酶基因的一个4.8kb 长度的基因簇进行了克隆测序,该序列上可合理地读出4 个阅读框orfB、orfC、orfD、orfA。序列比对发现,orfA 序列与Japonicum USDA 110 和Rastonia eutropha HF 39 中的加单氧酶基因同源性较高,orfB 序列与Bordetlla pertussis Tohama I 、Rastonia solanacearum GMI1000 和Bordetella bronchiseptica RB50 等菌中的黄素还原酶基因有一定的同源性。采用根据DNA 序列信息设计相应引物,分别构建含有不同阅读框的重组子,对不同阅读框编码的基因功能进行了确定。酶活分析发现只含基因orfA 的重组大肠杆菌SA的细胞提取液有很低的加氧活性,含基因orfB 的重组子SB的细胞提取液没有加氧活性,但在反应体系中同时加入S和S的细胞提取液后,其加氧活性显著增强,包含orfB+orfA 的重组子SB+A 在黄素(FMN、FAD)存在的条件下也表现出很强的加氧活性;在厌氧条件下,能检测出SB细胞提取液的黄素还原活性。基于以上信息,可以认定2-萘酸加单氧酶基因nmo 是由黄素还原酶基因(nmoB)和加单氧酶基因(nmoA)组成,由2-萘酸加单氧酶Nmo 羟化2-萘酸的关键一步应为:先由黄素还原酶(NmoB)在NADH 存在的条件下将黄素(FMN、FAD)还原为还原型黄素(FMNH2、FADH2),然后2-萘酸加单氧酶(NmoA)利用还原型黄素和分子O2羟化底物2-萘酸,生成1-羟基-2-萘酸。NmoB 是NmoA 的偶联蛋白。该2-萘酸加单氧酶的发现为双组分非亚铁血红素型黄素扩散加单氧酶(TC-FDM, two-component nonheme flavin-diffusible monooxygenase)家族增添了新成

关键词： 2-萘酸加单氧酶黄素还原酶基因克隆

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微生物脱有机硫研究前沿

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中国生物工程杂志 2003年第11期23卷 37-41页

作者：于波冯进辉李福利许平山东大学微生物技术国家重点实验室济南250100

环境问题日益成为人们关注的焦点 ,现代工业的发展使人类对化石燃料的依赖性越来越大。化石燃料的大量使用也造成了环境的严重污染 ,常规的加氢法处理燃油能耗高 ,处理效果不理想等方面的缺陷促进了生物脱硫的研究。简述了国外过去三年... 详细信息

环境问题日益成为人们关注的焦点 ,现代工业的发展使人类对化石燃料的依赖性越来越大。化石燃料的大量使用也造成了环境的严重污染 ,常规的加氢法处理燃油能耗高 ,处理效果不理想等方面的缺陷促进了生物脱硫的研究。简述了国外过去三年来在生物脱硫工作中取得的进展 ,包括菌株的改造 ;单加氧酶活力必需的黄素还原酶DszD ;途径的最后一个酶HPBS脱硫酶以及国外公司的一些工作。

关键词：生物脱有机硫黄素还原酶 HPBS脱硫酶处理效果

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江西伦茨氏菌和江西野野村氏菌中新颖套索肽的异源表达

江西伦茨氏菌和江西野野村氏菌中新颖套索肽的异源表达

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作者：邸金明兰州大学

学位级别：硕士

套索肽(Lasso peptide)是核糖体合成并经翻译后修饰的多肽(Ri PPs)天然产物的一种。目前已被报道的套索肽天然产物的翻译后修饰类型有:氧甲基化、C端丝氨酸侧链羟基连续磷酸化及磷酸化后的连续糖基化、赖氨酸侧链乙酰化、和天冬氨酸异... 详细信息

套索肽(Lasso peptide)是核糖体合成并经翻译后修饰的多肽(Ri PPs)天然产物的一种。目前已被报道的套索肽天然产物的翻译后修饰类型有:氧甲基化、C端丝氨酸侧链羟基连续磷酸化及磷酸化后的连续糖基化、赖氨酸侧链乙酰化、和天冬氨酸异构化等。许多已报道的套索肽具有丰富的生物活性,如抗菌活性和抗HIV活性等。色氨酸卤代酶在多种生物体中已经被发现,其主要功能为区域专一性地催化色氨酸的卤代反应,生成具有生物活性的卤代吲哚生物碱及其衍生物。少量核糖体肽天然产物也具有氯化的翻译后修饰,主要为氯代的羊毛硫肽天然产物,如Microbisporicin,其具有抗革兰氏阴性致病菌的活性。基于以上分析,我们期望得到具有潜在优良生物活性的卤代套索肽天然产物。在本论文的研究中,我们发现放线菌Lentzea jiangxiensis的基因组中编码一个潜在的卤代套索肽生物合成基因簇,将其命名为jcl。通过对jcl基因簇的异源表达以及相应提取物的质谱分析,我们分别发现了不含有氯代修饰、含一个氯和两个氯的天然套索肽,通过MALDI-TOF MS二级质谱分析,初步确定氯代修饰发生在两个色氨酸上。我们将这三个天然产物命名为Lentzycin A,B,C,这是首次发现含氯代修饰的套索肽天然产物。对jcl基因簇进行细致分析,发现除了编码套索肽生物合成必须的jclA,jclB,jclC基因外,还编码了一个色氨酸卤代酶基因(jclH)及氧化还原酶基因(jclS)。通过大肠杆菌异源表达的方式成功地表达了JclH和JclS两种酶,这将有助于进一步了解套索肽色氨酸卤代酶的区域专一性机理以及定向改造该类化合物。此外,我们在放线菌Nonomuraea jiangxiensis的基因组中发现了另一个套索肽生物合成基因簇(noj),其编码的核心肽与已报道的套索肽均不相同,表明其可能编码一个新颖的套索肽天然产物,我们初步构建了noj基因簇的异源表达质粒,并对其表达条件进行了初步筛选。这些研究丰富了套索肽天然产物的化合物库,以及核糖体肽天然产物后修饰酶的多样性。

关键词：套索肽色氨酸卤代酶黄素还原酶区域选择性

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