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基于差异基因表达谱的Microbacterium ***11降解黄原胶潜能挖掘

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微生物学杂志 2023年第1期43卷 20-31页

作者：袁悦王雪妍李宪臻杨帆大连工业大学生物工程学院辽宁大连116034

为挖掘微杆菌(Microbacterium sp.)XT11在黄原胶降解过程中起关键作用的功能基因,预测黄原胶降解通路,利用转录组测序技术对该菌株在不同碳源培养条件下的转录本进行测序,对差异基因进行功能富集分析。结果表明,菌株XT11以葡萄糖为对照... 详细信息

为挖掘微杆菌(Microbacterium sp.)XT11在黄原胶降解过程中起关键作用的功能基因,预测黄原胶降解通路,利用转录组测序技术对该菌株在不同碳源培养条件下的转录本进行测序,对差异基因进行功能富集分析。结果表明,菌株XT11以葡萄糖为对照组,以黄原胶为碳源时可获得上调差异基因213个。显著上调的基因主要富集在聚糖降解、淀粉和蔗糖代谢途径、ABC转运、苯丙氨酸代谢、丙酮酸代谢五个KEGG途径。碳水化合物活性酶(Carbohydrate-active enzymes,CAZymes)功能注释表明,位于同一基因簇上的4个CAZymes基因和黄原胶降解直接相关,其余的CAZymes基因具有潜在的黄原胶降解活性。此外,预测到磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS)和ABC转运途径(ABC transporters)参与了胞外黄原胶降解中间产物的跨膜转运。挖掘了菌株XT11中黄原胶降解过程中的功能基因,并阐述了菌株XT11的黄原胶降解通路。

关键词： Microbacterium sp.XT11 黄原胶降解转录组差异表达基因富集分析

Microbacterium ***11中黄原胶内切酶MiXen酶学性质的研究

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作者：孙杰大连工业大学

学位级别：硕士

黄原胶是由野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris产生的多功能可溶性多糖,其降解产物黄原胶寡糖能够抗氧化,抑菌,抗肿瘤,具有巨大的商业前景。目前,相对于物理法和化学法,生物酶法制备黄原胶寡糖具有条件温和,环保,产物结构可控等优点... 详细信息

黄原胶是由野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris产生的多功能可溶性多糖,其降解产物黄原胶寡糖能够抗氧化,抑菌,抗肿瘤,具有巨大的商业前景。目前,相对于物理法和化学法,生物酶法制备黄原胶寡糖具有条件温和,环保,产物结构可控等优点。然而,黄原胶主链的降解机理不是特别清晰,且黄原胶的三级结构是高度有序的,不易被酶法降解,致使利用酶法降解黄原胶效率低。这些阻碍了我们利用酶法降解黄原胶,制备黄原胶寡糖的工业化进程。本课题以黄原胶降解菌Microbacterium ***11的黄原胶内切酶MiXen为研究对象展开讨论。首先,本工作对MiXen的序列与结构进行分析,分析结果表明,MiXen含有952个氨基酸,可能是GH9家族糖苷水解酶的一个新分支。它具有多模块结构,包括N-末端类似免疫球蛋白(lg)结构域,(α/α)桶状催化中心和C-末端结构域。同时,对MiXen的C-末端结构域进行序列和结构的比对分析,发现它可能是一类新的碳水化合物结合模块(Carbohydrate Binding Module,CBM)。接下来,通过实验对MiXen的催化结构域和C-末端结构域的功能进行分析。首先,对MiXen进行异源表达和酶学性质表征,确定它的酶活为15.7±0.98 U/g;最适温度为40oC;最适pH为8.0;最佳缓冲液离子浓度为10 mM;相对于羧甲基纤维素(Caboxy Methyl Cellulose,CMC),MiXen的最适底物为黄原胶;通过圆二色谱(Circular Dichroism,CD)和酶活测定,发现MiXen能有效的随机切割高度有序黄原胶主链,且在与酶温育12 h后黄原胶的无序分数由0增加至0.425±0.018;通过剪切粘度和凝胶渗透色谱分析,表明与商品化的Cellulases相比,Mi Xen能够有效的降解黄原胶。之后,通过粘度,还原糖线性分析和凝胶渗透色谱分析,证实了MiXen具有黄原胶内切酶的活性。然后,通过对不含C-末端结构域的MiXen突变体酶活的测定及C-末端结构域的表面等离子共振(Surface plasmon resonance,SPR)分析,C-末端结构域能够辅助MiXen特异性结合到高度有序的黄原胶上。最后,通过CD,原子力显微镜(Atomic Force Microscopy,AFM),对不同修饰侧链黄原胶,即纯化黄原胶,去丙酮酸基黄原胶,去乙酰基黄原胶,去乙酰基去丙酮酸基黄原胶和去掉侧链末端甘露糖的黄原胶进行分析,发现不同修饰侧链影响黄原胶的二级结构,进而影响MiXen对黄原胶的活性。本课题所得结果为揭示一种新型黄原胶内切酶的水解机理和酶学性质提供一种新的视角,并为黄原胶寡糖的酶法制备打下基础。

关键词：黄原胶内切酶黄原胶降解黄原胶主链水解机理

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离子液体辅助黄原胶酸水解制备黄原胶寡糖

离子液体辅助黄原胶酸水解制备黄原胶寡糖

作者：孙大禹大连工业大学

学位级别：硕士

黄原胶寡糖是一种由黄原胶降解而成的寡糖,其具有良好的抗氧化能力和抑菌功能,在化妆品、农药以及医疗保健等方面有着非常好的应用前景。然而,由于分子量大、结构异常复杂,黄原胶难以被降解为寡糖分子,阻碍了黄原胶寡糖工业化生产的进... 详细信息

黄原胶寡糖是一种由黄原胶降解而成的寡糖,其具有良好的抗氧化能力和抑菌功能,在化妆品、农药以及医疗保健等方面有着非常好的应用前景。然而,由于分子量大、结构异常复杂,黄原胶难以被降解为寡糖分子,阻碍了黄原胶寡糖工业化生产的进程。离子液体是一种新兴的化学催化溶剂,研究表明,离子液体可以辅助酸降解纤维素。黄原胶主链结构与纤维素有着高度相似性,因此,本工作利用离子液体辅助酸降解黄原胶主链制备黄原胶寡糖,并对黄原胶寡糖进行生理活性与结构表征。本工作首先利用不同化学方法水解黄原胶制备寡糖,包括:酸氧化法、离子液体辅助酸水解法、碱氧化法、离子液体辅助碱水解法。随后比较了不同方法制备寡糖的生理活性,研究结果表明,离子液体辅助黄原胶酸水解法较之其他方法能够有效高水平的制备黄原胶寡糖。该方法制备的黄原胶寡糖的还原糖含量为1.1 mg/m L,较之酸氧化法、碱氧化法分别提高了1.7倍和6.1倍。离子液体辅助酸氧化法产生寡糖的羟基自由基清除率为17.5%,较之碱氧化法与酸氧化法分别提高了1.2倍和16.5倍。本工作随后对离子液体辅助黄原胶酸水解法进行了离子液体浓度、酸浓度、过氧化氢浓度、反应时间、反应温度的单因素分析。结果表明,当离子液体浓度为10 mg/m L,酸浓度为0.4 mol/L,HO的质量浓度为0.75%,温度为80℃的体系中反应4 d获得的黄原寡糖得率最高。黄原胶寡糖的产率为19.6%,2 mg/m L的黄原胶寡糖即可清除90%的羟基自由基。最后,本工作对离子液体辅助黄原胶酸水解制备的寡糖进行了生理活性以及结构的表征。凝胶渗透色谱分析结果表明,黄原胶寡糖的分子量分别在1500 Da与6000 Da左右;红外光谱以及核磁的结果表明分析结果表明,黄原价寡糖的链长变短且其侧链基团被去除;X射线衍射结果表明,黄原胶寡糖的结构相比于原始的黄原胶更致密。生理活性分析结果表明,寡糖有着很好的抗氧化活性与抑菌能力。1 mg/m L的寡糖对DPPH与羟基自由基的清除率分别为12%与46%。黄原胶寡糖其对野油菜黄单胞菌的半抑制浓度为9.2 mg/m L,有较好的抑菌能力。本工作的研究结果为今后制备新型黄原胶寡糖以及寡糖的功能开发提供了新思路。

关键词：黄原胶降解黄原胶寡糖离子液体寡糖的生理活性

嗜热地衣芽孢杆菌特性的研究、改良及初步应用研究

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嗜热地衣芽孢杆菌特性的研究、改良及初步应用研究

作者：姚潇婷中南林业科技大学

学位级别：硕士

黄原胶具有良好的流变性、乳化稳定性、悬浮性、兼容性及增粘性,在原油开采中常被用作驱替剂,以提高钻井、完井、调剖堵水及三次采油等过程中的采油率。在实际应用过程中发现,使用黄原胶后加大了后续处理工艺的难度,因此,有效地降解黄... 详细信息

黄原胶具有良好的流变性、乳化稳定性、悬浮性、兼容性及增粘性,在原油开采中常被用作驱替剂,以提高钻井、完井、调剖堵水及三次采油等过程中的采油率。在实际应用过程中发现,使用黄原胶后加大了后续处理工艺的难度,因此,有效地降解黄原胶是石油开采的重要工序。本研究以课题组前期鉴定的一株具有降解黄原胶能力的嗜热地衣芽孢杆菌HT-1为材料,对其进行紫外微波复合诱变,测定复合诱变菌株温度耐受性、pH耐受性以及对黄原胶的降解能力,并与原始菌株进行比较。最后,对复合诱变菌株的应用进行初步探索。本研究对后续黄原胶生物降解法以及黄原胶在石油工业的应用提供一定的参考依据。主要研究结果如下:原始菌株HT-1菌株的最适生长条件:温度50℃,pH 7.5,0.1%的黄原胶,1%的葡萄糖(碳源),1%的酵母粉(氮源);最适黄原胶降解条件:0.3%黄原胶作为唯一碳源和氮源,温度50℃,pH7.5。对原始菌株HT-1进行紫外诱变,选取一株较好的诱变菌株,命名为HT1UV-3,其对黄原胶的降粘率达到了 35.79%,较原始菌株提高了 14.42%。随后,对筛选得到的HT1UV-3突变株进行微波诱变,最终得到5株突变型菌株HT1UM3-1、HT1UM3-2、HT1UM3-3、HT1UM3-4、HT1UM3-5。温度耐受方面,5株突变菌株耐高温性能较原始菌株明显提高,其中HT1UM3-3菌株的最适生长温度趋于55℃;pH耐受方面,复合诱变菌株与原始菌株无明显差别;黄原胶降解方面,5株突变菌株的黄原胶降解能力较原始菌株均有提高,其中HT1UM3-5菌株的降粘率最高,达到42.02%,较原始菌株提高了 20.70%。在原油环境下,对原始菌株和复合诱变菌株的存活情况与黄原胶降解能力进行探索。结果显示,不同原油浓度下,原始菌株和复合诱变菌株对原油的耐受程度都不高,半数致死率均在0.5g/L;在0.5g/L原油浓度下,原始菌株和复合诱变菌株对黄原胶降解能力均较差,原始菌株降粘率趋近于0%,复合诱变菌株降粘率约7.5%。探究原始菌株和复合诱变菌株对瓜尔胶、田箐胶、卡拉胶三种胶的降解能力。结果表明,对瓜尔胶的降解上,所有菌株降解能力微弱,最大降粘率不超过4%;对田箐胶的降解上,HT1UM3-1、HT1UM3-2、HT1UM3-4、HT1UM3-5的降解能力略高于原始菌株,降粘率在5%-8%之间;对卡拉胶的降解上,复合诱变菌株的降解能力显著高于原始菌株,降粘率在10%-12%之间,较原始菌株提高了约60%。

关键词：嗜热地衣芽孢杆菌黄原胶降解复合诱变温度耐受性