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Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909麦芽寡糖基海藻糖合成酶在Bacillus subtilis中的重组表达和发酵优化

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生物技术通报 2017年第7期33卷 162-168页

作者：韩唱宿玲恰吴敬江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江南大学食品科学与技术国家重点实验室无锡214122

为实现Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)基因tre Y在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中的重组表达,以质粒p ET-24a(+)-tre Y为模板PCR扩增得到目的基因,并与表达载体pHY300PLK连接,转入表达宿主Bacillus subtilis CCTCC M 2016536中,重组菌在TB培养基中培养48 h后MTSase酶活达到17.5 U/m L;在此基础上对重组菌发酵条件进行优化,通过单因素实验(氮源种类、氮源复配、氮源浓度、碳源种类、葡萄糖浓度、初始pH、诱导温度)和正交实验(氮源浓度、葡萄糖浓度、初始pH、诱导温度)确定其摇瓶发酵产酶的最适培养基和培养条件为:氮源(工业蛋白胨∶棉籽粉=3∶1)48.0 g/L、葡萄糖为10.0 g/L、培养基初始pH为7.0,最适培养温度为30℃;在此条件下,MTSase的酶活可达41.5 U/m L,是优化前的2.4倍。

关键词：麦芽寡糖基海藻糖合成酶枯草芽孢杆菌重组表达发酵优化

发菜麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定

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发菜麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定

作者：沈蓉蓉上海师范大学

学位级别：硕士

海藻糖代谢途径及其相关代谢酶的研究一直是生物工程研究的重点和热点。不论从理论研究还是应用方面都显示出了明显的价值和意义。发状念珠藻具有很强的抗逆性,能抵御极端不良环境的胁迫。本实验室于2007年在受到干旱胁迫的发状念珠藻... 详细信息

海藻糖代谢途径及其相关代谢酶的研究一直是生物工程研究的重点和热点。不论从理论研究还是应用方面都显示出了明显的价值和意义。发状念珠藻具有很强的抗逆性,能抵御极端不良环境的胁迫。本实验室于2007年在受到干旱胁迫的发状念珠藻中发现了海藻糖的存在,本研究进一步对其体内海藻糖代谢与抗逆性之间的关系做了一些探索。本研究通过设计简并引物,从发状念珠藻（Nostoc flagelliforme *** Flah.）中克隆得到一个基因组DNA片段,可能编码参与海藻糖代谢的麦芽寡糖基海藻糖合成酶（NfMTS）。NfMTS基因全长2799bp,编码933个氨基酸,表达形成一个106.6KD大小的蛋白。该基因编码的氨基酸序列包含四个麦芽寡糖基海藻糖合成酶的高度保守区域。通过大肠杆菌中表达NfMTS,这个重组蛋白可以将麦芽糊精转化成麦芽糖基海藻糖,证明了这个蛋白具有麦芽寡糖基海藻糖合成酶的功能。通过双倒数作图法得出该重组酶的米氏常数为1.87 mM（麦芽六糖为底物）,最适的酶活反应温度和pH分别为50℃和7.0。在干旱胁迫下,发状念珠藻中的海藻糖和蔗糖的积累量都显著升高,麦芽糖基海藻糖合成酶的表达量也呈现增加的趋势。然而,海藻糖积累得比较少,约0.36 mg·g-1DW,而蔗糖积累的量较大,约为0.90 mg·g-1DW,这表明了海藻糖和蔗糖在发状念珠藻的抗干旱胁迫中都起到了作用,同时,可能是蔗糖而不是海藻糖在发状念珠藻遇到干旱胁迫时作为化学伴侣分子起到了作用。本研究从分子水平研究了发菜海藻糖代谢途径中的关键酶,所得到的成果为研究发菜海藻糖代谢途径提供了一定的基础,也有利于我们深入了解发菜中海藻糖的代谢及功能。

关键词：发状念珠藻麦芽寡糖基海藻糖合成酶干旱胁迫蓝藻

发菜中麦芽寡糖基海藻糖合成酶的抗体制备及鉴定

同方学位论文库评论

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上海师范大学学报（自然科学版） 2009年第6期38卷 639-644页

作者：沈蓉蓉章秀吴双秀何靓王全喜上海师范大学生命与环境科学学院上海200234

通过PCR法从发菜总DNA中克隆到编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因前645bp的催化位点保守序列的片段,将该基因片段在大肠杆菌中表达,得到符合预期大小的重组蛋白.将该重组蛋白纯化回收用于制备该酶的特异性抗体.检测表明抗体具有较高效价.... 详细信息

通过PCR法从发菜总DNA中克隆到编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因前645bp的催化位点保守序列的片段,将该基因片段在大肠杆菌中表达,得到符合预期大小的重组蛋白.将该重组蛋白纯化回收用于制备该酶的特异性抗体.检测表明抗体具有较高效价.利用该抗体检测干旱胁迫下发菜藻丝体中该酶的表达量表明干旱胁迫条件下该酶的表达量增加,且与海藻糖积累量呈正相关,可能参与发菜的抗逆性保护作用.

关键词：发菜麦芽寡糖基海藻糖合成酶抗体干旱胁迫

谷氨酸棒杆菌麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的克隆与表达

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中国农业科技导报 2009年第1期11卷 68-72页

作者：张文德乔宇丁宏标中国农业科学院饲料研究所北京100081

采用PCR方法从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)基因组中分离得到2.4 kb的麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因(TreY),将其插入原核表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS获得重组基因工程菌。经IPTG诱导表达得到约90 kDa的目... 详细信息

采用PCR方法从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)基因组中分离得到2.4 kb的麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因(TreY),将其插入原核表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS获得重组基因工程菌。经IPTG诱导表达得到约90 kDa的目的蛋白,可溶性蛋白占细胞总蛋白的45.3%。重组酶作用于麦芽糊精,可使其DE值降低,得到麦芽寡糖基海藻糖的混合物。

关键词：麦芽寡糖基海藻糖合成酶麦芽糊精谷氨酸棒杆菌重组表达

发壮念珠藻麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的克隆的特性

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发壮念珠藻麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的克隆的特性

质粒复制原点在地衣芽孢杆菌中的功能鉴定及理性设计

第六届中国植物逆境生理学与分子生物学学术研讨会

作者：吴双秀沈蓉蓉章秀王全喜上海师范大学生命与环境科学学院生物系

＜正＞通过设计简并引物,从发状念珠藻（Nostoc flagelliforme *** Flah）中克隆得到一个基因组DNA片段,可能编码参与海藻糖代谢的麦芽寡糖基海藻糖合成酶（NfMTS）。NfMTS基因全长2799bp,编码933个氨基酸,表达形成一个106.6KD大小的蛋... 详细信息

＜正＞通过设计简并引物,从发状念珠藻（Nostoc flagelliforme *** Flah）中克隆得到一个基因组DNA片段,可能编码参与海藻糖代谢的麦芽寡糖基海藻糖合成酶（NfMTS）。NfMTS基因全长2799bp,编码933个氨基酸,表达形成一个106.6KD大小的蛋白。该基因编码的氨基酸序列包含四个麦芽寡糖基海藻糖合成酶的高度保守区域。通过大肠杆菌中表达NfMTS的重组蛋白可以将麦芽

关键词：发状念珠藻麦芽寡糖基海藻糖合成酶简并引物干旱胁迫蓝藻

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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食品与发酵工业 2024年第18期50卷 1-8页

作者：张高阳李由然肖丰旭石贵阳江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122

食品安全级工业微生物地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)与模式微生物相比,严重缺乏质粒载体等合成生物学标准化遗传工具,导致其研究与应用受到限制。该研究首先建立了质粒特性在地衣芽孢杆菌中的评价方法,由此鉴定获得了高效复制... 详细信息

食品安全级工业微生物地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)与模式微生物相比,严重缺乏质粒载体等合成生物学标准化遗传工具,导致其研究与应用受到限制。该研究首先建立了质粒特性在地衣芽孢杆菌中的评价方法,由此鉴定获得了高效复制原点。在此基础上进一步解析了复制原点中茎环结构影响质粒拷贝数和稳定性的分子机制,并理性设计了系列人工复制原点。结果表明,枯草芽孢杆菌来源的复制原点ORIT5拷贝数是pHY300内源复制原点的2.15倍(达到40.2),同时具有更高的稳定性。3′端增加1个motif为TCCGCC茎环的人工复制原点pT1,拷贝数进一步提升至62.2,稳定性提高36%。以麦芽寡糖基海藻糖合成酶为报告蛋白,携带pT1复制原点的重组菌发酵最高酶活力达到8726.7 U/mL,比出发菌株提高了43.9%。人工复制原点的开发与应用为地衣芽孢杆菌表达系统的改进和完善奠定了基础。

关键词：复制原点地衣芽孢杆菌茎环麦芽寡糖基海藻糖合成酶

MTSase和MTHase在Brevibacillus brevis中的克隆表达及应用研究

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食品与生物技术学报 2018年第8期37卷 838-844页

作者：吴世雄宿玲恰姚锴琳吴敬吴丹江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

为实现将来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)ATCC 33909的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)在短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)中的重组表达,分别以重组质粒pET-24a(+)-treY和pET-24a(+)-treZ为模板PCR扩增得到MTSase和MTHase基因片段,通过与表达载体pSVN连接得到重组质粒,电转化表达宿主Brevibacillus brevis,成功构建重组菌Brevibacillus brevis/pSVN-treY和Brevibacillus brevis/p SVN-treZ。重组菌在TM培养基中发酵48 h,胞内酶活力分别达到MTSase 630.0 U/g(wet cell)、MTHase 170.0 U/g(wet cell)。对重组MTSase和MTHase进行酶转化实验,结果表明,当以质量浓度为100 g/L马铃薯淀粉为底物,酶转化温度为60℃,pH为5.5,加酶量为MTSase 80 U/g淀粉、MTHase 20 U/g淀粉,普鲁兰酶5 U/g淀粉和环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)15 U/g淀粉,反应48 h,海藻糖转化率达到80.2%。

关键词：麦芽寡糖基海藻糖合成酶麦芽寡糖基海藻糖水解酶短短芽孢杆菌酶活力海藻糖

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海藻糖生产过程中产酶发酵条件的研究

工业微生物 2003年第3期33卷 16-20页

作者：孙长慧袁其朋周延北京化工大学化学工程学院北京100029

研究了产酶的培养基组分和比例以及最佳培养条件对微球菌生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶 (MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶 (MTHase)的影响 ,得到最优培养基组成为 :葡萄糖 2 .0 % ,酵母膏 2 .0 % ,蛋白胨 1.0 % ,磷酸氢二钾 0 .1% ... 详细信息

研究了产酶的培养基组分和比例以及最佳培养条件对微球菌生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶 (MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶 (MTHase)的影响 ,得到最优培养基组成为 :葡萄糖 2 .0 % ,酵母膏 2 .0 % ,蛋白胨 1.0 % ,磷酸氢二钾 0 .1% ,硫酸镁 0 .0 5 % ;优化后的培养条件为 :以15 %的接种量接种至 2 5 0mL的锥形瓶中 ,装液量为 5 0mL ,初始 pH值 7.5～ 8.5 ,培养温度为30℃ ,摇床培养 4d。经优化后菌体干重由原来的 1.938g/L增加到 18.5 g/L ,生物量几乎增长了 10倍 ;而酶活也由原来的 30 .6 4U / g增加到 2 0 6 .11U / g ,酶活提高了接近 7倍。

关键词：海藻糖发酵条件麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶麦芽寡糖基海藻糖合成酶微球菌正交试验

TreY-TreZ途径高产海藻糖菌株的筛选

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中国酿造 2008年第11期27卷 23-27页

作者：张勇伟刘新育徐倩文宋安东陈红歌河南农业大学生命科学学院河南郑州450002

为筛选能以TreY-TreZ途径合成海藻糖的菌株,对采自鲁山中汤温泉水样、温泉土样及面粉厂附近的土样,经高渗平板高温培养,以碘-淀粉水解圈作为初筛方法,通过TLC及HPLC检测,获得了2株产海藻糖的节杆菌属新菌株,经过初步的途径验证,证实这2... 详细信息

为筛选能以TreY-TreZ途径合成海藻糖的菌株,对采自鲁山中汤温泉水样、温泉土样及面粉厂附近的土样,经高渗平板高温培养,以碘-淀粉水解圈作为初筛方法,通过TLC及HPLC检测,获得了2株产海藻糖的节杆菌属新菌株,经过初步的途径验证,证实这2株菌均以TreY-TreZ途径生成海藻糖。

关键词：海藻糖麦芽寡糖基海藻糖合成酶麦芽寡糖基海藻糖水解酶