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麦芽四糖淀粉酶基因优化表达及酶学性质分析

中国生物工程杂志 2013年第5期33卷 100-106页

作者：赵云朱蓓霖汪正华周杰吴自荣黄静华东师范大学生命科学学院上海200241

麦芽四糖淀粉酶是一种新型外切淀粉酶,从淀粉的非还原末端特异地顺序切割第4个α-1,4糖苷键,产物为麦芽四糖,广泛应用于食品、医疗保健等领域。对来自嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)的麦芽四糖淀粉酶基因序列进行优化,优化前... 详细信息

麦芽四糖淀粉酶是一种新型外切淀粉酶,从淀粉的非还原末端特异地顺序切割第4个α-1,4糖苷键,产物为麦芽四糖,广泛应用于食品、医疗保健等领域。对来自嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)的麦芽四糖淀粉酶基因序列进行优化,优化前后基因序列同源性达75%。将优化合成的成熟肽基因克隆至原核表达载体pET32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体经变性、复性、多步纯化,获得有活性的麦芽四糖淀粉酶。将麦芽四糖淀粉酶与不同来源的淀粉水解反应,结果表明,该酶能与7种不同来源的淀粉反应产生单一的麦芽四糖。经SDS-PAGE电泳,DNS法和硅胶板薄层色谱分析法(TLC)进行酶学性质分析,结果表明麦芽四糖淀粉酶的分子量约为57kDa,纯化后的酶液最适反应温度为45℃,最适反应pH为8.0。研究结果为麦芽四糖淀粉酶的研究和开发提供依据和参考。

关键词：麦芽四糖淀粉酶嗜糖假单胞菌基因优化酶学性质

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麦芽四糖淀粉酶基因克隆、表达及活性研究

麦芽四糖淀粉酶基因克隆、表达及活性研究

作者：赵云华东师范大学

学位级别：硕士

麦芽四糖淀粉酶(Glucan1,4-alpha-maltotetraohydrolase, G4淀粉酶,EC3.***.1.60)属淀粉酶系中的外切型酶,其产物为麦芽四糖(G4)。因其具有良好的食品加工适应性以及对人体健康有益的多种功能,被广泛应用于食品、化工、医药等行业。本课... 详细信息

麦芽四糖淀粉酶(Glucan1,4-alpha-maltotetraohydrolase, G4淀粉酶,EC3.***.1.60)属淀粉酶系中的外切型酶,其产物为麦芽四糖(G4)。因其具有良好的食品加工适应性以及对人体健康有益的多种功能,被广泛应用于食品、化工、医药等行业。本课题以来源于嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)的麦芽四糖淀粉酶基因mta作为研究对象,对mta的序列进行优化、合成,构建基因工程菌,优化表达条件,分离、纯化目标蛋白,并对该酶的基本酶学性质进行研究。本研究包括以下三方面内容： (1)麦芽四糖淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及酶学性质分析根据宿主细胞的偏爱密码子、mRNA二级结构及GC碱基含量优化麦芽四糖淀粉酶基因mta,共改变314个碱基,GC含量从67.6%下降到51.9%,优化前后基因序列同源性达75%。将优化后的mta基因克隆至大肠杆菌载体pET32a(+)中,成功构建基因工程表达菌株pET32a(+)-mta/BL21(DE3)。麦芽四糖淀粉酶融合蛋白的表达产物,主要以包涵体形式存在,通过有效的变性、复性、纯化,获得电泳条带单一且有活性的麦芽四糖淀粉酶,SDS-PAGE电泳及Western blotting检测分子量约为64kDa,其中麦芽四糖淀粉酶约为47kDa,载体标签约为17kDa。DNS检测原始发酵液的酶活为2.6U/mL, BCA检测纯化后酶液的蛋白浓度为0.1mg/mL,比活为26U/mg。对大肠系统pET32a(+)-mta/BL21表达条件进行优化,通过比较蛋白产量,得出最优表达条件为：7%接种量,装瓶量为35%,IPTG浓度0.2mmol/L,37℃诱导6h,优化后蛋白产量提高约88.7%。引入优化的乳糖自诱导培养基—ZYPB,15h后菌体OD600达到10.496,蛋白产量为708.48,相比IPTG诱导下蛋白产量提高了4倍。融合蛋白的可溶性表达占菌体可溶性蛋白表达总量的比例,由IPTG诱导下的5.5%增加到35.3%,提高了5倍。酶学基本性质分析表明,该酶具有水解底物广泛性,能水解7种不同来源淀粉,包括小麦淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉和糖原;产物的单一性,TLC显示主要产物均为G4;水解速度具差异性,以分解玉米淀粉的能力最强,分解糖原的能力最弱;最适温度45℃,最适作用pH为8.O;Cu+、Zn2+、Fe3+及Mg2+对酶活力有促进作用,而Ni2+、Li+及EDTA对酶活力有抑制作用。 (2)麦芽四糖淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌的克隆表达及酶学性质分析枯草芽孢杆菌表达系统中构建2个克隆：其一选用IPTG诱导型穿梭质粒pHT43及8种蛋白酶缺失的受体菌WB800,构建了基因工程菌pHT43-mta/WB800, SDS-PAGE及TLC显示该工程菌蛋白表达量及活性均不高;其二经过优化载体和受体菌,选用含强启动子P43和SacB信号肽的组成型表达、非穿梭载体pWB980,筛选获得的淀粉酶缺失型1A474作为受体菌,构建工程菌pWB980-mta/lA474。SDS-PAGE电泳及活性条带定位表明麦芽四糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中成功获得分泌表达,分子量约47kDa。该基因工程菌在48h内,质粒稳定性达到100%,对基因工程菌pWB980-mta/1A474表达条件优化,综合菌体浓度和酶活两项指标,得出最优表达条件为：菌种活化7h,以8%接种量,装瓶量48mL(150mL),1.5%麦芽糖和1.5%Polypeptone的培养基,0.3%TWEEN80分泌促进剂,37℃培养36h。优化后的菌体密度提高了14.9%,酶活为90.6268U/mL,比未优化的提高了34.99%。基本酶学性质分析表明,与大肠杆菌系统获得的麦芽四糖淀粉酶一致,能水解小麦淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉和糖原,以分解玉米淀粉的能力最强,糖原最弱。综上所述,本文在国内首次采用基因工程手段,成功实现麦芽四糖淀粉酶在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌系统中的表达,通过表达载体、受体菌以及基因工程菌发酵条件的优化,使得麦芽四糖淀粉酶的产量得到明显提高,研究结果为该酶的理论研究和生产实践提供参考。

关键词：麦芽四糖淀粉酶 mta基因基因优化枯草芽孢杆菌酶学性质表达元件

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产碱菌麦芽四糖淀粉酶的底物特异性

Acta Biochimica et Biophysica Sinica 1995年第6期27卷 663-669页

作者：朱静严自正周健梁改芹张树政中国科学院微生物研究所

产碱菌Ｇ４Ａ仅能水解由α－１，４－葡萄糖苷键连接的麦芽寡糖、淀粉或糖原。淀粉和糖原的水解产物为Ｇ４；麦芽寡糖Ｇ５，Ｇ６和Ｇ７的水解产物分别为Ｇ４＋Ｇ、Ｇ４＋Ｇ２和Ｇ４＋Ｇ３，水解速度为Ｇ５＜Ｇ６＜Ｇ７。直链淀粉的水解... 详细信息

产碱菌Ｇ４Ａ仅能水解由α－１，４－葡萄糖苷键连接的麦芽寡糖、淀粉或糖原。淀粉和糖原的水解产物为Ｇ４；麦芽寡糖Ｇ５，Ｇ６和Ｇ７的水解产物分别为Ｇ４＋Ｇ、Ｇ４＋Ｇ２和Ｇ４＋Ｇ３，水解速度为Ｇ５＜Ｇ６＜Ｇ７。直链淀粉的水解限度为１００％，其他淀粉为６０～７４％，糖原仅３４％，表明该酶为从麦芽寡糖、淀粉或糖原非还原末端顺序切割第４个ａ－１，４－葡萄糖苷键的外切型淀粉酶。Ｇ４Ａ对Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７及直链淀粉、可溶性淀粉、糯米淀粉、支链淀粉、糖原、糊精的Ｋｍ值分另为１．１５６、０．９２６、０．８７７ｍｍｏｌ／Ｌ及３．２８、３．２、３．１、２．８．２．４２、３．９２ｍｇ／ｍｌ，Ｖｍａｘ值分别为１９６１、１５３８５、１７８５７及４３９９０、２９８２２、２９３６２、２３５８２、１４６１５、３２０２０ｍｇＧ４·ｈ－１·ｍｐ－１。

关键词：麦芽四糖淀粉酶糖苷酶底物特异性产碱菌

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产碱菌麦芽四糖淀粉酶的化学修饰

生物化学与生物物理学报 1995年第3期27卷 299-303页

作者：朱静周健严自正梁改芹张树政中国科学院微生物研究所

不同蛋白质侧链修饰剂对麦芽四糖淀粉酶进行修饰。在一定条件下分别用ＩＡＡ、ＮＥＭ、ＥＤＣ和ＮＡＩ处理后，酶活力不受影响，仍为１００％，说明巯基、羧基和酪氨酸残基与酶活力无关。用ＤＥＰ、ＮＢＳ和ＨＮＢＢ＃饰后，酶活力大幅... 详细信息

不同蛋白质侧链修饰剂对麦芽四糖淀粉酶进行修饰。在一定条件下分别用ＩＡＡ、ＮＥＭ、ＥＤＣ和ＮＡＩ处理后，酶活力不受影响，仍为１００％，说明巯基、羧基和酪氨酸残基与酶活力无关。用ＤＥＰ、ＮＢＳ和ＨＮＢＢ＃饰后，酶活力大幅度下降，说明组氨酸和色氨酸残基为酶活力所必需。

关键词：麦芽四糖淀粉酶化学修饰产碱菌

重组Bacillus subtilis产麦芽四糖淀粉酶的发酵优化及麦芽四糖制备

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食品与发酵工业 2019年第8期45卷 44-49,56页

作者：杨亚楠宿玲恰吴敬食品科学与技术国家重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122 工业生物技术教育部重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122

麦芽四糖淀粉酶可水解淀粉或麦芽糊精生成麦芽四糖,在食品领域有着广泛应用。为降低生产成本,对前期构建的生产麦芽四糖淀粉酶的重组枯草芽孢杆菌进行发酵优化。通过对培养基的氮源和碳源进行优化,以5%的接种量,在33℃、200 r/min条件... 详细信息

麦芽四糖淀粉酶可水解淀粉或麦芽糊精生成麦芽四糖,在食品领域有着广泛应用。为降低生产成本,对前期构建的生产麦芽四糖淀粉酶的重组枯草芽孢杆菌进行发酵优化。通过对培养基的氮源和碳源进行优化,以5%的接种量,在33℃、200 r/min条件下发酵48 h,发现以25 g/L豆粕粉和25 g/L工业蛋白胨为氮源,5 g/L甘油为碳源时,重组酶酶活力最高可达236 U/m L。利用发酵所得重组麦芽四糖淀粉酶制备麦芽四糖并进行酶反应条件优化,使用高效液相色谱检测产物含量。发现当酶转化反应温度为50℃,反应p H为7. 0,加酶量为30U/g底物,底物麦芽糊精的质量浓度为250 g/L时,反应12 h,麦芽四糖转化率可达73. 2%,为降低生产成本和工业制备麦芽四糖提供了理论依据。

关键词：麦芽四糖淀粉酶发酵优化酶转化反应麦芽四糖

嗜糖假单胞菌麦芽四糖淀粉酶的枯草芽孢杆菌表达及酶学性质分析

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食品与发酵工业 2014年第5期40卷 70-76页

作者：韦云萍赵云张金龙张利杨芳潘盈盈吴自荣黄静华东师范大学生命科学学院上海200241 上海外国语大学附属浦东外国语学校上海201203

麦芽四糖淀粉酶是淀粉酶中第3种外切型酶,可以顺序地从淀粉非还原性末端依次切割第4个α-1,4糖苷键,产物为麦芽四糖,广泛应用于食品、医疗保健等领域。该研究采用含有P43启动子和SacB信号肽的pWB980枯草芽孢杆菌表达载体,连接嗜糖假单... 详细信息

麦芽四糖淀粉酶是淀粉酶中第3种外切型酶,可以顺序地从淀粉非还原性末端依次切割第4个α-1,4糖苷键,产物为麦芽四糖,广泛应用于食品、医疗保健等领域。该研究采用含有P43启动子和SacB信号肽的pWB980枯草芽孢杆菌表达载体,连接嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖淀粉酶基因,获得了重组菌pWB980-G4/1A747,实现了麦芽四糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的外分泌表达,并具有生物学活性。对表达产物进行酶学性质分析,结果表明麦芽四糖淀粉酶可广泛作用于7种不同来源的淀粉,生成单一产物麦芽四糖。最适反应温度为50℃,最适pH为7.0。进一步对pWB980-G4/1A747菌株进行发酵条件优化,得到其最佳活化时间为5 h,接种量为5%(v/v),通气量为20 mL/150 mL,培养时间为24 h,培养温度为37℃。

关键词：嗜糖假单胞菌麦芽四糖淀粉酶枯草芽孢杆菌酶学性质发酵条件

Pseudomonas saccharophila麦芽四糖淀粉酶的重组表达、发酵优化及其应用研究

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Pseudomonas saccharophila麦芽四糖淀粉酶的重组表达、发酵优化...

作者：杨亚楠江南大学

学位级别：硕士

麦芽四糖淀粉酶(maltotetraohydrolase或maltotetraose amylase,EC 3.***.1.60)具有外切酶活性,属于GH13家族的淀粉水解酶类,从淀粉的非还原末端,特异的依次切割第4个α-1,4糖苷键,生成以麦芽四糖为主的麦芽低聚糖。麦芽四糖是由4个α-D... 详细信息

麦芽四糖淀粉酶(maltotetraohydrolase或maltotetraose amylase,EC 3.***.1.60)具有外切酶活性,属于GH13家族的淀粉水解酶类,从淀粉的非还原末端,特异的依次切割第4个α-1,4糖苷键,生成以麦芽四糖为主的麦芽低聚糖。麦芽四糖是由4个α-D型葡萄糖基以α-1,4糖苷键连接成的直链麦芽低聚糖,是一种功能性食品,其甜度低、保湿性好,具有易消化吸收、低渗透压等特点和抑制肠内腐败菌、保持肠道健康、促进人体对Ca吸收等功能,主要应用于食品与医疗领域。本研究首先将嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)来源的麦芽四糖淀粉酶在食品安全菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WS11)中重组表达。接着对重组酶进行分离纯化并考察了酶学性质。然后对重组菌在摇瓶和3-L罐中的发酵培养基进行优化,实现了麦芽四糖淀粉酶的高效表达。最后对利用重组酶制备麦芽四糖的工艺条件进行了优化,并考察了重组酶在延缓面包老化中的应用效果,为麦芽四糖淀粉酶工业化生产和应用奠定了基础。主要研究结果如下:(1)构建了重组菌***/pHY300PLK-g4,在33℃条件下,摇瓶发酵48 h后,麦芽四糖淀粉酶的胞外酶活力为147 U·mL,SDS-PAGE结果显示分别在57 kDa(定义为I型麦芽四糖淀粉酶)和47 kDa(定义为II型麦芽四糖淀粉酶)处各有一条蛋白条带,结果表明Pseudomonas saccharophila来源的麦芽四糖淀粉酶在*** WS11中成功表达。对重组酶进行硫酸铵沉淀并用Mono Q阴离子交换柱进行纯化,然后考察了重组酶的酶学性质。结果表明,以可溶性淀粉为底物,I型酶的最大反应速率(V)、米氏常数(K)、催化常数(k)和催化效率(k/K)分别为1739.24μmol·min·mg、0.13 mg·mL、1673.73s和12434.84 mL·mg·s;II型酶的分别为1390.67μmol·min·mg、0.42 mg·mL、1097.70 s和2638.70 mL·mg·s。I型酶和II型酶的最适温度均为55℃,I型酶的最适pH为7.5,II型酶的最适pH为7.0。(2)对重组菌进行发酵优化,首先在摇瓶水平优化重组菌产麦芽四糖淀粉酶的发酵培养基组成,结果表明最佳氮源和碳源成分分别为:25 g·L豆粕粉和25 g·L工业蛋白胨、5 g·L甘油。在此条件下,摇瓶发酵48 h后麦芽四糖淀粉酶的酶活力为236 U·mL。以摇瓶发酵培养基为基础,在3-L罐水平上优化了重组菌发酵产酶的培养基组分并降低成本。结果表明,在37℃,pH 7.0下,使用12 g·L葡萄糖,25 g·L工业蛋白胨和25 g·L豆粕粉作为初始培养基,以250 g·L葡萄糖,180 g·L工业蛋白胨和70 g·L豆粕粉为补料培养基进行发酵,至78 h时,酶活力达到最高为1907 U·mL,是摇瓶优化前的13倍。然后,考察了重组菌在15-L发酵罐中的生长情况和产酶效果,发酵至96 h时,酶活力达到最高为1219 U·mL,具有一定的工业应用价值。(3)考察了反应温度、反应初始pH、加酶量、底物浓度和反应时间对重组麦芽四糖淀粉酶制备麦芽四糖的影响。最终确定了I型酶制备麦芽四糖的最佳转化条件:温度50℃、初始pH 7.5、加酶量30 U·g麦芽糊精(DE 5-7),底物浓度150 g·L,转化12 h,麦芽四糖最大转化率可以达到73.2%;II型酶制备麦芽四糖的最佳转化条件:温度50℃、初始pH 7.0、加酶量30 U·g麦芽糊精(DE 5-7),底物浓度250 g·L,转化12 h,麦芽四糖最大转化率可以达到73.0%,I型和II型酶在各自的最佳转化条件下,制备麦芽四糖的转化率接近。(4)研究了重组麦芽四糖淀粉酶在延缓面包老化中的应用效果,以高筋面粉、鸡蛋、牛奶、糖、盐和黄油制作吐司面包,以不加酶作空白对照,分别对添加I型酶和II型酶的实验组吐司面包进行质地剖面分析,各项指标显示,添加I型酶的吐司面包效果更好。然后对I型酶的加酶量进行优化并考察贮存期内面包的质地剖面分析参数变化,贮存7天后,添加0.45 U·g面团的I型酶的面包的主要参数硬度(g)、粘度(g)和弹性分别为6058.008、-83.419和1.082,而对照组分别为8685.562、-268.709和0.805,表明了重组酶可以延缓面包老化。

关键词：麦芽四糖淀粉酶枯草芽孢杆菌发酵优化麦芽四糖面包

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用麦芽四糖淀粉酶生产麦芽四糖

无锡轻工大学学报（食品与生物技术） 1997年第4期16卷 34-37页

作者：朱明无锡轻工大学中央研究所

采用麦芽四糖淀粉酶，以可溶性淀粉为底物进行了包括温度、ｐＨ值、反应时间、加酶量等多种产糖条件的试验，得到了较理想的反应参数。所得产品麦芽四糖占总糖的比例达８０％以上，转化率为５５％左右。

关键词：麦芽四糖麦芽四糖淀粉酶可溶性淀粉生产

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麦芽四糖淀粉酶晶体的分子堆积学研究

生物物理学报 2000年第1期16卷 19-24页

作者：方国强马建华李平卫严自正毕汝昌中国科学院生物物理研究所北京100101 中国科学院微生物研究所北京100080

用悬滴汽相扩散法生长了从产碱菌中分离纯化得到的麦芽四糖淀粉酶的晶体 ,并在MarRe search面探测器上收集了一套2.7埃分辨率的衍射强度数据。用分子置换法解得了该种晶体的结构。在此基础上 ,分析和比较了两种不同麦芽四糖淀粉酶晶体... 详细信息

用悬滴汽相扩散法生长了从产碱菌中分离纯化得到的麦芽四糖淀粉酶的晶体 ,并在MarRe search面探测器上收集了一套2.7埃分辨率的衍射强度数据。用分子置换法解得了该种晶体的结构。在此基础上 ,分析和比较了两种不同麦芽四糖淀粉酶晶体中的分子堆积和作用 ,对影响蛋白质晶体分子堆积的一些因素进行了讨论。

关键词：麦芽四糖淀粉酶结晶分子堆积 X-射线晶体学