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鹿结核病流行株融合基因Rv3872-Rv3874-Rv3875的原核表达

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中国兽医科学 2014年第5期44卷 515-520页

作者：王文玉宋纪伟曾范利时坤李健明张云刘东旭俊伟杜锐吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 吉林市人民医院吉林吉林132001 吉林农业大学中药材学院吉林长春130118 吉林农业大学研究生学院教育部动物生产及产品质量安全重点实验室吉林省药用动物二级实验室吉林长春130118

以本实验室保存的鹿体内分离并鉴定的结核病流行株为模板,利用重叠延伸剪接技术设计融合基因的引物,扩增融合基因Rv3872-Rv3874-Rv3875,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3872-Rv3874-Rv3875;重组表达质粒被转化入大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG... 详细信息

以本实验室保存的鹿体内分离并鉴定的结核病流行株为模板,利用重叠延伸剪接技术设计融合基因的引物,扩增融合基因Rv3872-Rv3874-Rv3875,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3872-Rv3874-Rv3875;重组表达质粒被转化入大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导表达,并采用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法对目的蛋白进行纯化。基因测序结果显示,融合基因Rv3872-Rv3874-Rv3875的序列与GenBank中序列的符合率为99.89%。SDS-PAGE分析显示,融合基因在大肠杆菌中成功被诱导表达,获得以可溶形式表达的融合蛋白,该蛋白的分子质量约为60ku。Western-blot鉴定结果显示,纯化好的融合蛋白能与鹿结核病的阳性血清发生反应,说明该融合蛋白具有良好的反应原性,这一结果为它在鹿结核病血清学诊断中的应用奠定了试验基础。

关键词：鹿结核病融合基因原核表达反应原性

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鹿结核病的流行及防控进展

中国兽医学报 2018年第2期38卷 428-432页

作者：葛盼王洁茹王杰赖金伦陈颖钰郭爱珍华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070 华中农业大学动物科技学院湖北武汉430070 华中农业大学动物医学院湖北武汉480070 湖北省兽医流行病学国际科技合作基地湖北武汉430070

鹿结核病是由牛分枝杆菌引起的鹿的慢性、消耗性传染病，广泛流行于世界各地，严重危害着养鹿业的发展，同时也威胁着人类健康和其他动物的安全。为保证养鹿业的发展和人类的健康，对该病进行有效防控显得十分重要。美国、新西兰等国家... 详细信息

鹿结核病是由牛分枝杆菌引起的鹿的慢性、消耗性传染病，广泛流行于世界各地，严重危害着养鹿业的发展，同时也威胁着人类健康和其他动物的安全。为保证养鹿业的发展和人类的健康，对该病进行有效防控显得十分重要。美国、新西兰等国家通过对可疑感染的鹿群进行持续性监测和利用捕猎季节减少感染鹿群的数量等策略，成功实现了对鹿结核的控制。现对国内外鹿结核病的流行现状、诊断技术及疫苗研究进行综述，以期为鹿结核病的防控提供借鉴。

关键词：鹿结核病牛分枝杆菌防控

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鹿结核病分子诊断技术的研究进展

黑龙江畜牧兽医 2017年第1期 89-91页

作者：翟晶苏凤艳张爱武吉林农业大学中药材学院长春130118

鹿结核病是一种由结核分枝杆菌引发的慢性、消耗性传染病,多年来世界各国均受到结核病的困扰。结核病通常以结核杆菌形式感染人类及以牛结核杆菌形式感染奶牛,与其他同属结核菌相比,牛分枝杆菌可感染更多种类动物致病,如牛、羊、鹿等动... 详细信息

鹿结核病是一种由结核分枝杆菌引发的慢性、消耗性传染病,多年来世界各国均受到结核病的困扰。结核病通常以结核杆菌形式感染人类及以牛结核杆菌形式感染奶牛,与其他同属结核菌相比,牛分枝杆菌可感染更多种类动物致病,如牛、羊、鹿等动物。由于鹿结核病目前尚无规定性的诊断方法,同时鹿结核病主要是牛型结核分枝杆菌感染所致,一般参照牛结核病的部分诊断方法进行诊断。分子诊断技术能快速高效地诊断结核分枝杆菌,对进一步治疗、扑灭结核病起至关重要的作用。因此,文章对近年来鹿常见的结核病分子诊断技术的研究进展进行综述。

关键词：鹿结核病结核分枝杆菌分子诊断 PCR DNA探针技术基因芯片

鹿结核病流行株与卡介苗差异基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

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鹿结核病流行株与卡介苗差异基因的原核表达及间接ELISA检测方法...

作者：王文玉吉林农业大学

学位级别：硕士

鹿结核病是在全球范围内广泛传播的一种慢性、消耗性人畜共患传染病，它主要是由牛分枝杆菌和结核分枝杆菌引起的一种细菌性疾病，严重威胁着养鹿业的健康发展。卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）是可用于防治鹿结核病的减毒活... 详细信息

鹿结核病是在全球范围内广泛传播的一种慢性、消耗性人畜共患传染病，它主要是由牛分枝杆菌和结核分枝杆菌引起的一种细菌性疾病，严重威胁着养鹿业的健康发展。卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）是可用于防治鹿结核病的减毒活疫苗，但其免疫保护效果不稳定，缺少主要的保护性抗原，动物机体接种BCG后会对皮内结核菌素反应的特异性产生严重干扰，因此用PPD皮试无法将疫苗接种鹿与自然感染鹿区分开来。本研究旨在寻找能够鉴别诊断疫苗接种鹿与自然感染鹿的特异性抗原，进而建立起检测鹿结核病的间接酶联免疫吸附试验。主要内容包括以下三个方面：（1）鹿结核病流行株与卡介苗差异基因及融合基因的克隆以实验室保存的鹿体内分离并鉴定的结核病流行株为模板，设计特异性引物，从实验室已构建的鹿结核病流行株与卡介苗差异基因文库中扩增RD1区的五段差异基因Rv3872、Rv3873、Rv3874、Rv3875和Rv3878，并利用重叠延伸剪接技术（splicing by overlapextension， SOE）设计融合引物将其中的几段基因进行融合，得到两段融合基因Rv3874-Rv3875和Rv3872-Rv3874-Rv3875。将克隆得到的这七段基因分别与pMD18-TSimple Vector连接，经PCR、酶切及测序鉴定，结果显示，七个目的片段均成功克隆到pMD18-T载体中。（2）鹿结核病流行株与卡介苗差异基因及融合基因的原核表达与反应原性分析将七个阳性重组克隆质粒分别与原核表达载体pGEX-4T-1连接，构建出这七段基因的阳性重组表达质粒并转化入大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导后摸索出最优表达条件，采用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法对目的蛋白进行纯化，通过SDS-PAGE和Westernblot对表达产物及纯化产物进行初步分析，结果均能与鹿结核病的阳性血清发生反应，说明目的蛋白具有良好的反应原性。（3）鉴别鹿结核病自然感染与卡介苗免疫的间接ELISA检测方法的建立分别以纯化的七段目的蛋白为包被抗原，通过摸索各项参数，包括抗原抗体的工作浓度和各项反应条件的优化，初步建立了七种抗原的间接ELISA检测方法，并确定其阴阳性临界值，经特异性、敏感性和重复性试验分析，表明建立的七种抗原检测方法均具有良好的特异性、敏感性和重复性。本研究克隆并表达了鹿结核病流行株与卡介苗之间的五段差异基因和两段融合基因，为建立鉴别疫苗接种鹿与自然感染鹿的诊断方法提供了多种候选抗原，并以表达纯化后的蛋白为抗原建立间接ELISA检测方法，为其在鹿结核病血清诊断学中的应用奠定了实验基础。

关键词：鹿结核病 RD1区差异基因原核表达间接ELISA

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吉林省鹿结核病的流行病学调查

中国畜牧兽医 2010年第10期37卷 204-206页

作者：王春雨杨莉王全凯宋占昀刘金华周亮赵全民幺乃全王振国吉林农业大学长春130118 吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心长春130062

为掌握结核病在吉林省鹿群中的流行传播状况,从吉林省养鹿业富有代表性地区的18个鹿场随机采集血清样本1856份作为研究对象,利用结核杆菌Ag85-East6-mpt70抗原多联表达蛋白作为检测抗原,进行酶联免疫检测,调查吉林省鹿结核病流行情况,... 详细信息

为掌握结核病在吉林省鹿群中的流行传播状况,从吉林省养鹿业富有代表性地区的18个鹿场随机采集血清样本1856份作为研究对象,利用结核杆菌Ag85-East6-mpt70抗原多联表达蛋白作为检测抗原,进行酶联免疫检测,调查吉林省鹿结核病流行情况,结果发现,吉林省地区鹿群中存在结核病病例,且各地区间阳性率差异显著或极显著(P病扩散。

关键词：鹿结核病流行病学酶联免疫吸附试验

PCR技术检测鹿结核病及HSP65基因的克隆与表达

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PCR技术检测鹿结核病及HSP65基因的克隆与表达

作者：杨雷东北林业大学

学位级别：硕士

鹿结核病是一种人畜共患性传染病,广泛流行于世界各地。为确定我国鹿群的结核病的流行情况,应用聚合酶链反应(PCR)对采自国内某一地区鹿场屠宰点的79份鹿全血样品进行检测,结果表明鹿群的结核病阳性率为43.0%,其中还有结核分枝杆菌的感... 详细信息

鹿结核病是一种人畜共患性传染病,广泛流行于世界各地。为确定我国鹿群的结核病的流行情况,应用聚合酶链反应(PCR)对采自国内某一地区鹿场屠宰点的79份鹿全血样品进行检测,结果表明鹿群的结核病阳性率为43.0%,其中还有结核分枝杆菌的感染,证明鹿群中仍然高发结核病。为了有效预防和治疗鹿结核病,以PCR检测鹿结核病阳性分离菌株基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增热休克蛋白65(Hsp65)基因,PCR产物经纯化与测序载体PMD18-T进行连接,转化克隆宿主菌E.coli DH5a中测序鉴定,结果碱基序列与GenBank上结核分枝杆菌HSP65碱基序列100%一致。将连接有HSP65基因的PMD18-T载体和原核表达载体pGEX-6P-1分别用EcoR I/SaL I双酶切处理,回收纯化后,连接构建重组表达载体,转化克隆宿主菌E.coli DH5a中,经酶切及PCR鉴定为阳性克隆后进一步测序鉴定,结果碱基、预测氨基酸序列均与HSP65完全一致,并具有正确的读码框,获得的重组表达质粒pGEX-HSP65可用于下步表达。大量提取重组质粒pGEX-HSP65,将其转化到表达宿主菌E.coli BL21中,鉴定为阳性克隆后,以1mMol/L终浓度的IPTG37℃诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,表达的蛋白条带大小约86kDa,与预期的结果相符,经薄层扫描表达外源蛋白量占全菌体蛋白总量的30.7%。HSP65基因表达的融合蛋白GST-HSP65经过Western blot检测,在86kDa处显示了特异蛋白结合带,表达的蛋白能被PCR检测鹿结核呈阳性的血清特异地识别,具有良好的抗原性,为进一步研究其在结核病诊断和防治中的应用打下了基础。

关键词：鹿结核病 PCR HSP65基因分子克隆原核表达

鉴别鹿结核病野毒感染与卡介苗免疫间接ELISA方法的建立及初步验证

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鉴别鹿结核病野毒感染与卡介苗免疫间接ELISA方法的建立及初步验证

作者：刘杨吉林农业大学

学位级别：硕士

鹿结核病主要是由牛分枝杆菌引起的一种慢性、消耗性人畜共患病,该病程世界分布,严重威胁人类的健康和畜牧业的发展。随着鹿养殖数量的不断增加,饲养员因接触病畜而感染结核的病例也逐年攀升,因此,控制鹿结核病的蔓延不但有助于降低养... 详细信息

鹿结核病主要是由牛分枝杆菌引起的一种慢性、消耗性人畜共患病,该病程世界分布,严重威胁人类的健康和畜牧业的发展。随着鹿养殖数量的不断增加,饲养员因接触病畜而感染结核的病例也逐年攀升,因此,控制鹿结核病的蔓延不但有助于降低养鹿业的经济损失,也降低了饲养员的患病风险。目前,卡介苗(BCG)可以预防鹿结核病。动物接种BCG一段时间内结核菌素皮内试验结果呈假阳性,严重影响结核菌素的皮内试验检测结果。RD1区和RD5区均在结核分枝杆菌中存在,在卡介苗中缺失。有资料证实RD5区的Rv3117基因能够区分动物结核病是自然感染还是卡介苗免疫,且其敏感性和特异性均高于ESAT-6蛋白。本研究克隆、表达并纯化了Rv3117蛋白,诱导表达了实验室保存的RD-1区基因的重组表达质粒并对其进行纯化获得Rv3117、Rv3872、Rv3873、Rv3874、Rv3875、Rv3878、Rv3874-3875和Rv3872-3874-3875蛋白。利用ELISA方法综合评价各蛋白作为鹿结核病ELISA检测方法的候选抗原的敏感性和特异性,筛选出最优抗原Rv3872-3874-3875蛋白,建立一种能够鉴别鹿结核病野毒株感染与卡介苗免疫的方法,从而降低鹿结核病ELISA检测的假阳性。本研究主要包括以下几方面内容:(1)Rv3117基因的克隆与表达载体的构建以结核分枝杆菌标准菌H37Rv为模板,设计特异性引物,扩增只在结核分枝杆菌中存在,而在卡介苗中缺失的RD5区的基因Rv3117。将目的基因Rv3117与克隆载体pMD18-T连接,经鉴定结果显示已将Rv3117基因成功克隆至克隆载体上。将Rv3117基因片段连接至表达载体pGEX-4T-1上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,筛取阳性克隆。(2)结核分枝杆菌野毒株与卡介苗差异基因的诱导表达及纯化对前期制备的pGEX-4T-1-Rv3117的菌种进行诱导表达,用Western blot方法检验其是否具有结核分枝杆菌的反应原性。大量诱导表达Rv3117蛋白和实验室保存的结核分枝杆菌RD1区特异性基因的菌种。用亲和层析的方法对其进行纯化,并对纯化结果进行SDS-PAGE分析。(3)鉴别鹿结核病野毒感染与卡介苗免疫间接ELISA检测方法最优抗原的筛选本试验制备兔人工感染结核分枝杆菌、卡介苗和副结核分枝杆菌的阳性血清,以差异基因蛋白为包被抗原,分别建立间接ELISA方法,比较各包被抗原建立的间接ELISA方法的重复性、敏感性和特异性。结果表明Rv3872-74-75蛋白具有较高的重复性、敏感性和特异性,可以区分野毒感染和卡介苗免疫,为后期建立鉴别鹿结核病野毒株与卡介苗免疫ELISA检测方法做准备。(4)鉴别鹿结核病野毒感染与卡介苗免疫间接ELISA方法的建立及初步应用建立检测鹿结核病的Rv3872-74-75-ELISA方法,并用PPD-ELISA作为对照。对采集的鹿血样进行批量检测,结果表明Rv3872-74-75-ELISA能够鉴别鹿结核病的野毒感染与卡介苗免疫,从而降低了接种卡介苗引起的假阳性结果。本研究利用分子生物学的方法,成功克隆并诱导表达结核分枝杆菌的差异基因蛋白,通过ELISA方法比较各蛋白作为包被抗原的优越性,最终确立Rv3872-74-75蛋白可作为包被抗原建立鉴别鹿结核病野毒株与卡介苗免疫ELISA检测方法,为鹿结核病的血清学诊断奠定基础。

关键词：鹿结核病野毒株卡介苗间接ELISA方法

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聚合酶链反应技术检测鹿结核病

中国兽医杂志 2007年第9期43卷 37-38页

作者：杨雷华育平东北林业大学野生动物资源学院黑龙江哈尔滨150040

为了确定我国屠宰鹿中结核病的流行情况,我们应用PCR法对国内某地屠宰鹿群的结核分枝杆菌感染情况进行调查.

关键词：鹿结核病聚合酶链反应技术检测结核分枝杆菌流行情况感染情况 PCR法屠宰

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鹿结核病诊断技术研究进展

现代畜牧兽医 2019年第8期 55-58页

作者：胡卉琪延边大学农学院动物医学系

近些年来,时常发生的鹿结核病威胁到了养鹿业的正常发展,这种疾病的产生主要与牛分枝杆菌有关,具有易传染、危害大的特点。因此,各个国家已经开始重视对鹿结核病的研究和预防,并积极采取了有效地防治措施。其中,美国等国家通过多种监测... 详细信息

近些年来,时常发生的鹿结核病威胁到了养鹿业的正常发展,这种疾病的产生主要与牛分枝杆菌有关,具有易传染、危害大的特点。因此,各个国家已经开始重视对鹿结核病的研究和预防,并积极采取了有效地防治措施。其中,美国等国家通过多种监测技术获取疑似感染鹿结核病的鹿群信息,有效地控制了疾病的发展。文章将对鹿结核病的研究现状以及诊断技术等进行概述,从而为鹿结核病的防治工作提供更多的依据。

关键词：鹿结核病诊断技术研究进展