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中国兽医科学 2024年第6期54卷 749-756页

作者：张景辉武景琦房立春刘涛吴家强于可响徐怀英吕俊峰艾武郭慧君邱建华亓丽红宋玲玲山东省农业科学院畜牧兽医研究所山东济南250131 山东农业大学动物科技学院山东济南250131 山东省农业科学院家禽研究所山东泰安271017

根据鹅星状病毒(GAstV)ORF1b基因与鹅源新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)σC基因的保守序列设计特异性引物,建立GAstV与NDRV双重RT-PCR检测方法,该方法具有较高的特异性,在903 bp(GAstV)和226 bp(NDRV)可检测到特异性条带,最低灵敏度为1.0×10^(3... 详细信息

根据鹅星状病毒(GAstV)ORF1b基因与鹅源新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)σC基因的保守序列设计特异性引物,建立GAstV与NDRV双重RT-PCR检测方法,该方法具有较高的特异性,在903 bp(GAstV)和226 bp(NDRV)可检测到特异性条带,最低灵敏度为1.0×10^(3)copies/μL。在鲁中、鲁西北及鲁南地区不同规模的养鹅场中随机采取320份样本,GAstV的阳性率为21.56%(69/320),NDRV的阳性率为3.44%(11/320),混合感染阳性率为2.81%(9/320),单一RT-PCR结果与双重RT-PCR方法一致。该方法的建立为快速诊断GAstV和NDRV提供了可靠的手段。

关键词：鹅星状病毒鹅源新型鸭呼肠孤病毒双重RT-PCR

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鹅星状病毒与新型鸭呼肠孤病毒双重RT-PCR检测方法的建立及应用

鹅星状病毒与新型鸭呼肠孤病毒双重RT-PCR检测方法的建立及应用

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作者：张景辉山东农业大学

学位级别：硕士

2020年我国肉鹅出栏量在5亿只左右,作为鹅养殖业大省,山东省肉鹅出栏量在6720万只左右,随着养鹅业的蓬勃发展,规模化和集约化的养殖导致疫病发生越来越多,自2017年以来,我国部分地区开始陆续出现鹅星状病毒和新型鸭呼肠孤病毒,随后在全... 详细信息

2020年我国肉鹅出栏量在5亿只左右,作为鹅养殖业大省,山东省肉鹅出栏量在6720万只左右,随着养鹅业的蓬勃发展,规模化和集约化的养殖导致疫病发生越来越多,自2017年以来,我国部分地区开始陆续出现鹅星状病毒和新型鸭呼肠孤病毒,随后在全国范围内开始流行爆发,且临床上经常发生混合感染的现象,严重威胁了鹅养殖业的健康发展;为了快速简便的检测鹅星状病毒与新型鸭呼肠孤病毒的单一或混合感染,本研究建立了双重RT-PCR检测方法,为疾病的快速诊断与早期预警提供有效的技术支持。根据鹅星状病毒ORF1b基因、新型鸭呼肠孤病毒σC基因的保守序列设计特异性引物,通过退火温度、特异性、灵敏性及重复性试验等条件的优化进行分析,建立检测鹅星状病毒与新型鸭呼肠孤病毒的双重RT-PCR检测方法;对山东省内滨州市、济宁市、菏泽市、聊城市和潍坊市等地区收集到的病死雏鹅和不同规模养鹅场内随机采取的临床样本开展检测,并用单一RT-PCR方法进行验证,并将检测到的阳性样本进行遗传进化分析。结果显示,本研究建立的双重RT-PCR方法扩增出两种病毒核酸的片段,大小分别为903 bp(鹅星状病毒)和226 bp(鹅源新型鸭呼肠孤病毒),确定该方法的最佳退火温度为54℃;而对鸭肝炎-1型、鸭肝炎-3型、番鸭呼肠孤病毒及鹅圆环病毒等RNA或DNA的病毒核酸无特异性扩增,该方法检出最低灵敏度为1.0×10拷贝/μL,且重复性稳定可行。对收集到的256份疑似病料应用建立的双重RT-PCR方法开展检测,检出鹅星状病毒单一感染94份,新型鸭呼肠孤病毒单一感染71份,鹅星状病毒和新型鸭呼肠孤病毒混合感染63份;应用建立的该方法对不同规模鹅养殖场进行随机采取的320份临床样品检测发现,鹅星状病毒单一感染检出率为21.56%(69/320),新型鸭呼肠孤病毒单一感染检出率为3.44%(11/320),鹅星状病毒与新型鸭呼肠孤病毒混合感染检出率为2.81%(9/320);经单一RT-PCR检测验证后,两种检测方法检出阳性率完全一致。获得的9个鹅星状病毒RT-PCR阳性产物的核苷酸序列与鹅源SDPY株、GD株、GTF-07株及HBXG株的核苷酸同源性在97.1%～98.2%之间。经遗传进化分析发现,该阳性产物与鹅源星状病毒亲缘关系较近;获得的2个鹅源新型呼肠孤病毒σC全长基因RT-PCR阳性产物与已公布的NDRV 091和HN5d等病毒株的核苷酸同源性在89.4%～96.2%之间,所检测到的病毒与新型鸭呼肠孤病毒亲缘关系最近,但与番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒在遗传进化上有一定的距离。综上所述,本研究成功建立了鹅星状病毒与新型鸭呼肠孤病毒双重RT-PCR检测方法,该方法为快速诊断鹅星状病毒和鹅源新型鸭呼肠孤病毒提供了依据。

关键词：鹅星状病毒 ORF1b基因鹅源新型鸭呼肠孤病毒 σC基因双重RT-PCR

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