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鸽痘病毒PGPV/SX-20分离株的致弱及免疫效力研究

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鸽痘病毒PGPV/SX-20分离株的致弱及免疫效力研究

作者：王婧雅西北农林科技大学

学位级别：硕士

鸽痘是由鸽痘病毒(Pigeonpox virus,PGPV)引起的一种具有较强传染性的接触性病毒疾病,其发病率约为30%左右,死亡率为50%,尤其是幼鸽,当伴有继发感染时,死亡率会更高。感染PGPV鸽主要临床症状为在表皮羽毛稀疏或黏膜部位发生痘肿,影响鸽... 详细信息

鸽痘是由鸽痘病毒(Pigeonpox virus,PGPV)引起的一种具有较强传染性的接触性病毒疾病,其发病率约为30%左右,死亡率为50%,尤其是幼鸽,当伴有继发感染时,死亡率会更高。感染PGPV鸽主要临床症状为在表皮羽毛稀疏或黏膜部位发生痘肿,影响鸽子健康和胴体品质,对鸽养殖业造成了严重的经济损失。而目前国内PGPV的防治主要通过综合防控、药物治疗及鸡痘病毒(Fowlpox virus,FWPV)弱毒苗的接种,始终未能对PGPV达到很好的防治效果。本研究通过对实验室保存的一株PGPV分离株进行鸡胚传代致弱,以望获得安全性高、免疫保护性较强的PGPV制苗弱毒株。本实验室前期研究已从西安某赛鸽公棚分离得到了PGPV毒株,命名为PGPV/SX-20。对此分离株建立1月龄鸽攻毒模型,并测得最小发痘量为50 EID50。将此分离株接种于11日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜(Chorioallantoic membrane,CAM)连续传代,发现第14代的CAM开始出现水肿减轻,并产生典型痘斑,表明14代可能出现毒株致弱,在第14代基础上连续传至第23代。取第14、17、20和23代病毒接种于1月龄幼鸽以研究毒株的致弱效果,动物试验结果显示,与强毒株PGPV/SX-20相比,第14、17、20和23代病毒仅于接种部位出现轻微痘肿且很快结痂、脱落和恢复,且未出现其他部位继发痘,说明致弱成功,将其命名为PGPV/SX-20P14-P23致弱株。将健康1月龄鸽与接种过PGPV/SX-20P14-P23致弱株鸽同笼饲养,观察发现接种致弱株鸽不感染周围健康鸽,并通过将致弱株感染鸽病变组织制成悬液继续接种1月龄实验鸽的方式,分别于实验鸽体连续接种5代,均未出现典型继发痘,表明毒力稳定,不易反强,判定致弱株安全性较高;进一步分别测定PGPV/SX-20P14、P17、P20和P23致弱株鸡胚半数感染量(EID50)发现,PGPV/SX-20-P20-P23与PGPV/SX-20-P14-P17致弱株相比,毒力明显降低,安全性更高。故选择PGPV/SX-20-P20-P23致弱株研制鸽痘病毒弱毒冻干疫苗,测定其免疫保护效力。PGPV/SX-20-P20和PGPV/SX-20-P23致弱株接种幼鸽后均出现典型免疫接种反应,接种后第30 d以PGPV/SX-20的最小发痘量感染免疫鸽,测得PGPV/SX-20-P20和PGPV/SX-20-P23致弱株对1月龄鸽保护率可达100%,最小免疫剂量可稀释至1:500稀释度,免疫保护期长达9个月以上。为验证PGPV/SX-20-P20-P23致弱株对其他PGPV毒株是否具有免疫交叉保护力,对接种PGPV/SX-20-P23致弱株的实验鸽,于免疫后第30 d感染另外6种PGPV毒株,均未发生皮肤型或黏膜型鸽痘临床病变,达到预期保护效果。为制备高免血清,每隔14 d分别接种PGPV/SX-20-P14、PGPV/SX-20-P17、PGPV/SX-20-P20和PGPV/SX-20-P23致弱株,最后一次接种PGPV/SX-20分离株,共免疫4次,成功制备获得了AGP测定抗体效价超过1:64的高免血清。综上所述,本研究制备的PGPV/SX-20-P20-P23弱毒苗具有较高的安全性和较强免疫保护效力,且对其他PGPV毒株具有一定免疫交叉保护性,有望成为新型的PGPV弱毒疫苗。高免血清的制备也对PGPV治疗的研究提供了新思路。为鸽养殖业PGPV的防治提供了更多选择。

关键词：鸽痘病毒分离株致弱安全性免疫效力高免血清

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鸽痘病毒的分离鉴定及病理组织学观察

中国兽医学报 2018年第11期38卷 2078-2083页

作者：池雪林陈珍珍曾显成张翔罗树红黄小红福建农林大学动物科学学院中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室福建福州350002 佛山科学技术学院口腔医学院医学检验系广东佛山528000

为确诊福建省某规模肉鸽养殖场疑似鸽痘疫情,采集病鸽皮肤痘痂组织,经处理后接种11日龄SPF鸡胚,培养7d后观察到鸡胚尿囊膜增厚,出现典型的白色痘斑。组织学观察可见皮肤表皮增生,形成厚的网状结构,上皮细胞呈不同程度的空泡变性,胞浆内... 详细信息

为确诊福建省某规模肉鸽养殖场疑似鸽痘疫情,采集病鸽皮肤痘痂组织,经处理后接种11日龄SPF鸡胚,培养7d后观察到鸡胚尿囊膜增厚,出现典型的白色痘斑。组织学观察可见皮肤表皮增生,形成厚的网状结构,上皮细胞呈不同程度的空泡变性,胞浆内有嗜酸性包涵体,呈红色、圆形或椭圆形;肺脏淤血,肺泡破裂及增殖性支气管炎。待检样本进行鸽痘病毒P4b基因PCR检测,得到特异性条带;根据P4b基因核酸序列构建系统发育树,结果显示分离株与来自美国（KC017965）和南非（KJ801920）的2株鸽痘病毒聚在一起,同源性为100%,与企鹅痘病毒、鹌鹑痘病毒和鸡痘病毒的同源性分别为99.6%,99.6%和91.1%;与金丝雀痘病毒和火鸡痘病毒同源性最低,为73.3%～75.0%。结果表明,本次暴发为鸽痘病毒感染所致,为鸽痘防控及致病机理研究奠定了理论基础。

关键词：鸽痘病毒分离鉴定病理观察进化树分析

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鸽痘病毒的分离鉴定及4b基因序列分析

中国兽医科学 2020年第11期50卷 1389-1395页

作者：孙炎戊王占新曾凡桂翁亚彪鲁俊鹏覃健萍林瑞庆华南农业大学兽医学院广东广州510642 温氏食品集团股份有限公司广东云浮527439 广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室广东广州510462

对广东省某规模化肉鸽养殖场暴发的疑似鸽痘进行了临床观察、病毒分离鉴定、动物回归试验和4b核心蛋白基因序列分析。成功分离得到1株皮肤型鸽痘病毒KP3-PPV。将KP3-PPV接种7日龄乳鸽后发现乳鸽从接种后第5天在翼膜接种部位开始出现黄... 详细信息

对广东省某规模化肉鸽养殖场暴发的疑似鸽痘进行了临床观察、病毒分离鉴定、动物回归试验和4b核心蛋白基因序列分析。成功分离得到1株皮肤型鸽痘病毒KP3-PPV。将KP3-PPV接种7日龄乳鸽后发现乳鸽从接种后第5天在翼膜接种部位开始出现黄色增生性结节,在接种后第18天在鼻翼、嘴角周围开始出现黄色增生性结节。扩增KP3-PPV的4b基因序列并进行比较分析,结果显示该分离株与南非FeP2株鸽痘病毒的同源性达100%,与2株企鹅痘病毒和火烈鸟痘病毒的同源性分别为99.36%、99.11%和98.05%,与鸡痘病毒的同源性为92.6%~93.09%,与其他禽痘病毒的同源性仅为76.03%~77.78%。本研究为鸽痘病理学研究、禽痘病毒间种属鉴定、鸽痘致弱疫苗开发提供了重要参考依据。

关键词：鸽痘病毒鸡痘病毒分离鉴定致弱疫苗 4b基因动物回归试验

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鸽痘病毒的分离鉴定

中国兽医杂志 2000年第4期26卷 15-17页

作者：刘伟王东卫唐蔚东史光华佘锐萍天津实验动物中心东丽200201 中国农业大学北京海淀100094

鸽痘是由鸽痘病毒(PPV)引起的鸽的主要传染病.PPV为痘病毒科禽痘病毒属成员,是体积最大的一类DNA病毒.PPV主要侵害鸽的局部无毛部位,呈现结节状黄白色痘斑病变,分皮肤型、白喉型和混合型3种[1～3].

关键词：鸽痘病毒分离鉴定致病性免疫机理

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鸽痘病毒TK基因的扩增、克隆及序列分析

动物医学进展 2004年第5期25卷 71-74页

作者：黄爱芳王林川广东省家禽科学研究所广州石井510430 华南农业大学兽医学院广东广州510642

根据3个鸡痘病毒株的TK基因序列,借助基因分析软件设计合成了引物H1+、H2一。对PPV地方分离弱毒株PPVR的3个型PPVD(大)、PPVZ(中)、PPVX(小)和强毒株PPVY及鸽痘病毒疫苗株VVG、鸡痘病毒疫苗株VVJ进行TK基因的PCR,均成功地扩增出预期大... 详细信息

根据3个鸡痘病毒株的TK基因序列,借助基因分析软件设计合成了引物H1+、H2一。对PPV地方分离弱毒株PPVR的3个型PPVD(大)、PPVZ(中)、PPVX(小)和强毒株PPVY及鸽痘病毒疫苗株VVG、鸡痘病毒疫苗株VVJ进行TK基因的PCR,均成功地扩增出预期大小的目的片段。对PCR产物用限制性内切酶NcoI进行酶切分析,结果酶切产物得到两条条带,大小分别为628 bp和732 bp,与3个已发表的TK基因分析结果一致。分别将6个禽痘病毒TK基因克隆至pGEM-T Easy载体中,重组质粒经PCR和酶切鉴定后,进行测序。结果表明,本试验获得的TK基因长1 360 bp,存在一个NcoI酶切位点,两个XbaI酶切位点。序列分析表明:PPVD和PPVX同VVG和VVJ的TK基因同源性为100％;在TK基因的编码区内PPVY有一个碱基与其它毒株不同;各毒株TK基因的侧翼都存在15 bp的正向重复序列和8 bp的倒转重复序列;PPVD、PPVX和PPVZ虽然来源于同一个毒株,但TK基因存在差异。

关键词：鸽痘病毒 TK基因基因克隆序列分析 PCR 鸽痘

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鸽痘病毒插入载体的构建

动物医学进展 2005年第10期26卷 89-92页

作者：黄爱芳王林川黄毓茂广东省家禽科学研究所广东广州510430 华南农业大学兽医学院广东广州510642

经PCR、克隆鉴定、酶切获得PPVZ带有PvuⅡ酶切位点的TK1基因片段。将带有PvuⅡ酶切位点的TK1基因片段与经相同酶切的PUC19载体片段连接,获得重组质粒PUC19-Z。用限制性内切酶NcoⅠ对阳性重组质粒PUC19-Z进行单酶切(TK基因内存在一个Nco... 详细信息

经PCR、克隆鉴定、酶切获得PPVZ带有PvuⅡ酶切位点的TK1基因片段。将带有PvuⅡ酶切位点的TK1基因片段与经相同酶切的PUC19载体片段连接,获得重组质粒PUC19-Z。用限制性内切酶NcoⅠ对阳性重组质粒PUC19-Z进行单酶切(TK基因内存在一个NcoⅠ位点),经PCR、克隆鉴定、酶切获得质粒pGJP-5带有NcoⅠ酶切位点的P7.5基因片段,将此片段与经同样酶切的PUC19-Z连接,经酶切和PCR鉴定,筛选出正向插入的重组质粒即为鸽痘病毒插入载体。

关键词：鸽痘病毒插入载体

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鸽痘病毒分离株鉴定、致弱及免疫效力研究

鸽痘病毒分离株鉴定、致弱及免疫效力研究

作者：佘晓彬扬州大学

学位级别：硕士

鸽痘是由鸽痘病毒(Pigeonpox virus, PPV)引起的一种接触性的常发传染病。PPV为痘病毒科禽痘病毒属,是体积最大的一类DNA病毒。鸽痘通常分为皮肤型和黏膜型两种,前者以体表无羽毛部位出现散在的、结节状的增生性皮肤病灶;后者以上呼吸... 详细信息

鸽痘是由鸽痘病毒(Pigeonpox virus, PPV)引起的一种接触性的常发传染病。PPV为痘病毒科禽痘病毒属,是体积最大的一类DNA病毒。鸽痘通常分为皮肤型和黏膜型两种,前者以体表无羽毛部位出现散在的、结节状的增生性皮肤病灶;后者以上呼吸道、口腔和食管部黏膜出现纤维素性坏死和增生性病灶。从南京市及周边肉鸽饲养场疑似患鸽痘的皮肤中分离到两株病毒,命名为NJ-18和ZJ。通过对其进行病毒分离、负染透射电镜、包涵体检查、理化特性、血清特异性、4b核心蛋白序列和动物致病性各项指标测定。结果表明:电镜下病毒粒子椭圆形,具有囊膜,大小24030nm,表面呈桑椹样,为典型痘病毒科病毒结构特征;细胞浆中有包涵体,红色、圆形或椭圆形;两株病毒均对乙醚、氯仿、pH3.0、pH11.0均敏感、56℃30min病毒均丧失活力;血凝效价为1:16和1:32;NJ-18 EID50为10-6.67 /0.2mL,ZJ EID50为10-7.32/0.2mL;鸽痘血清对NJ-18和ZJ中和效价都为1:126,鸡痘血清对NJ-18和ZJ中和效价分别为1:4和1:8;4b核心蛋白核苷酸序列同源性比较中,NJ-18 4b核心蛋白序列与ZJ同源性为93.4%,与India株同源性最高为99.6%,与CVL950株同源性最低为71.5%。NJ-18、ZJ 4b核心蛋白序列与已公开发表的其他禽痘病毒4b核心蛋白比较发现:NJ-18与FPV Diftosec CT同源性最高为90.9%,与CPV V同源性最低为66.8%。ZJ与FPV Diftosec CT同源性最高为90.9%,与CPVGB724-01-02同源性最低为66.9%。两株病毒都能引起1月龄鸽全身性痘疹,雏鸡致局部轻微痘疹,对金丝雀完全没有致病性;攻毒用毒株ZJ最小发痘量为50 EID50。以上结果综合证明两株病毒为鸽痘病毒。采用鸡胚连续传代方法,使PPVNJ-18分离株致弱,获得了一株具有良好免疫原性、安全且纯净的鸽痘弱毒株,命名为PPVNJ-18F1-E1。结果表明:PPVNJ-18经过连传16代,CAM出现水肿和痘斑典型的鸽痘病变,且对1月龄鸽丧失致病性,说明毒力减弱;在F16代的基础上连续传E16代,鸡胚绒毛尿囊膜病变和EID50均稳定;E1、E5、E10和E16代病毒,经鸽体传5代,其毒力稳定,不返强;E1、E5、E10和E16代病毒接种鸽后,均于接种部位出现轻微痘肿,为典型免疫接种反应;对30、45、60日龄鸽保护率为100%;病毒纯净,无细菌和外源病毒污染。利用PPVNJ-18F1-E1致弱株研制鸽痘病毒弱毒冻干疫苗。该疫苗最小免疫剂量为0.5×10EID;无细菌和霉菌污染;一次单剂量接种、单剂量重复接、一次大剂量接种对鸽均安全;对30、45、60日龄的鸽子,免疫保护率为100%,且免疫期长达7个月以上。

关键词：鉴定致弱分离鸽痘病毒免疫效力

鸽新城疫病毒及鸽痘病毒血凝特性及HA试验技术参数研究

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西北农业学报 2006年第1期15卷 1-5页

作者：沈文正张曼席爱利黄晓玲杨凌职业技术学院动物工程系

为研究鸽新城疫病毒（PNDV）和鸽痘病毒（PPV）的血凝特性，同时为2种病毒的血凝试验（HA试验）提出技术参数，分别采用鸡和鸽红血细胞（RBC），在不同反应介质和条件下进行病毒血凝试验。结果表明：①PNDV既能凝集鸡RBC，又能凝集鸽RB... 详细信息

为研究鸽新城疫病毒（PNDV）和鸽痘病毒（PPV）的血凝特性，同时为2种病毒的血凝试验（HA试验）提出技术参数，分别采用鸡和鸽红血细胞（RBC），在不同反应介质和条件下进行病毒血凝试验。结果表明：①PNDV既能凝集鸡RBC，又能凝集鸽RBC，而PPV只凝集鸡RBC；②PNDV对0．5％鸡RBC血凝价比对1％鸡RBC血凝价高1～2个稀释度，而PPV对0．5％鸡RBC血凝价比对1％鸡RBC血凝价高5个稀释度；③PNDV和PPV对鸡RBC的HA凝集强度呈线性变化，而PNDV对鸽RBC的HA凝集强度墨非线性变化；④进行PNDV和PPV的HA试验的理想技术参数为：用0．5％鸡RBC，以0．89％生理盐水或pH7．4PBS为反应介质，PNDV于37℃作用30min时转至室温观察，重复观察应于35min内结束，而PPV应于37C作用30min观察，观察后迅速放回37℃，重复观察应于10min内结束。

关键词：鸽新城疫病毒鸽痘病毒血凝特性 HA试验参数

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鸽痘病毒的分离与鉴定

中国家禽 2009年第7期31卷 45-46页

作者：佘晓彬邵冬冬戴鼎震广东温氏食品集团有限公司研究院广东新兴527439 苏州高新区畜牧兽医站江苏苏州215004 金陵科技学院江苏南京210001

鸽痘是由鸽痘病毒（Pigeonpox virus，PPV）引起的鸽的主要传染病。为研究PPV的致病性和免疫机理，更好的防制鸽痘，我们对南京市及周边地区感染鸽痘的鸽群进行了病原分离，得到了2株病毒，本试验对2个分离株作了详细的鉴定。

关键词：鸽痘病毒病原分离鉴定 virus 免疫机理周边地区传染病致病性