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畜牧兽医学报 2024年

作者：孙雨点宋紫玥张洪亮秦志华单虎杨瑞梅青岛农业大学动物医学院

山东某樱桃谷鸭场出现以患鸭短喙、长舌、生长不良为主要特征的疾病，疑似感染鸭短喙与侏儒综合征病毒（duckling short beak and dwarfism syndrome virus ， SBDSV）。本研究旨在分离鉴定该病毒，并检测其对樱桃谷鸭的致病性。首先，... 详细信息

山东某樱桃谷鸭场出现以患鸭短喙、长舌、生长不良为主要特征的疾病，疑似感染鸭短喙与侏儒综合征病毒（duckling short beak and dwarfism syndrome virus ， SBDSV）。本研究旨在分离鉴定该病毒，并检测其对樱桃谷鸭的致病性。首先，通过临床症状、病理变化、病料PCR检测，确定感染鸭短喙侏儒综合征病毒。其次，用SPF鸭胚分离培养病毒后，对其电镜观察和同源性与系统发育树分析，再检测病毒尿囊液EID50。最后，动物回归试验中，对2日龄樱桃谷鸭口服尿囊液，观察致病特点，以及用PCR和间接免疫荧光试验检测病毒分布。结果显示：SPF鸭胚接毒后96～120 h鸭胚死亡，电镜观察病毒粒子大小20～50 nm，尿囊液 EID5010-4.85·0.2 mL-1。尿囊液PCR检测SBDSV为阳性，证明从鸭胚中成功分离培养SBDSV。该病例主要临床表现短喙和体重降低，感染后2周内持续排毒，VP2片段与鸭短喙侏儒综合征病毒序列的相似性为99.8%，表明是由鸭短喙与侏儒综合征病毒感染引起，命名为SBDS-SD株。动物回归试验中，出现短喙、腹泻、体重显著降低等与自然病例相似的临床症状。本试验成功分离到一株鸭短喙与侏儒综合征病毒，并验证其对樱桃谷鸭具有致病性，为该病的进一步研究提供基础。

关键词：鸭短喙与侏儒综合征致病性试验病毒增殖培养电镜观察

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致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒不同传代毒株基因组分析

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病毒学报 2022年第2期38卷 394-401页

作者：郝雪飘王璐瑶雷白时张武超苗天姿庞洪泽赵款袁万哲河北农业大学动物医学院保定071001 河北省兽医生物技术创新中心保定071001

由新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,N-GPV)引起的鸭短喙与侏儒综合征(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)给我国养鸭业带来了不可估量的经济损失,严重阻碍了我国养鸭业的发展。而目前N-GPV的毒力关键基因位点尚不清楚。本... 详细信息

由新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,N-GPV)引起的鸭短喙与侏儒综合征(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)给我国养鸭业带来了不可估量的经济损失,严重阻碍了我国养鸭业的发展。而目前N-GPV的毒力关键基因位点尚不清楚。本研究将N-GPV(SD株)在SPF鸭胚上进行多次传代,对SD株F10、F20、F30、F40和F50进行全基因组测序,并选择F50进行致病性试验,结果表明,F50感染组与对照组相比体重与喙长有明显差异,但F50感染组无典型临床症状,表明SD-F50的致病性明显降低;F50与F5序列分析显示,5’和3’的反向重复末端(ITR)中均有4个碱基突变和2个碱基插入,且突变位置相对应;在非结构蛋白Rep中有1个氨基酸位点突变,结构蛋白VP中共有2个氨基酸位点突变。综上所述,N-GPV SD株经过鸭胚连续传代后出现了毒力下降,并且病毒基因组序列也出现了规律性变化,这些突变位点可能是影响N-GPV毒力的关键位点,为N-GPV毒力关键位点的研究提供参考依据。

关键词：新型鹅细小病毒鸭短喙与侏儒综合征序列分析

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新型鹅细小病毒VP2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2023年第9期53卷 1145-1151页

作者：刘琳敏田甜郝雪飘庞洪泽雷白时赵款张武超袁万哲河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省兽医生物技术创新中心河北保定071001

为探究造成鸭短喙与侏儒综合征的病原即新型鹅细小病毒(NGPV) VP2蛋白的生物学功能,根据NGPV SD株序列,扩增VP2基因克隆至原核表达载体pET-32a,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白。将纯化的蛋白按照标准程序免疫7周龄BALB/c小鼠制... 详细信息

为探究造成鸭短喙与侏儒综合征的病原即新型鹅细小病毒(NGPV) VP2蛋白的生物学功能,根据NGPV SD株序列,扩增VP2基因克隆至原核表达载体pET-32a,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白。将纯化的蛋白按照标准程序免疫7周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,NGPV VP2基因全长为2 199 bp;通过大肠杆菌BL21(DE3)成功表达出大小约为83 ku的His-VP2融合蛋白。ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶204 800。Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别VP2蛋白。间接免疫荧光试验表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别受感染细胞中的NGPV和鹅细小病毒。综上所述,本研究成功表达并纯化了VP2蛋白,并成功制备了效价高反应性好的多克隆抗体,为进一步探究NGPV VP2蛋白生物学功能奠定了基础。

关键词：鸭短喙与侏儒综合征新型鹅细小病毒多克隆抗体 VP2

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鸭源新型鹅细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及应用

鸭源新型鹅细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及应用

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作者：刘琳敏河北农业大学

学位级别：硕士

鸭短喙与侏儒综合征(Short beak and dwarfism syndrome,BADS)是从 2015 年在我国河北、山东和江苏等地开始大规模爆发的具有传染性的疾病,其主要特征是造成了雏鸭的发育不良,喙变短而舌头外伸与肿胀,造成我国养鸭业肉鸭出栏率明显降低... 详细信息

鸭短喙与侏儒综合征(Short beak and dwarfism syndrome,BADS)是从 2015 年在我国河北、山东和江苏等地开始大规模爆发的具有传染性的疾病,其主要特征是造成了雏鸭的发育不良,喙变短而舌头外伸与肿胀,造成我国养鸭业肉鸭出栏率明显降低和巨大经济损失。该病的病原被鉴定为新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV),也称为鸭源鹅细小病毒、新型鸭细小病毒等。近几年,虽然国内许多学者开展了针对鸭短喙与侏儒综合征的相关研究,但关于此病以及NGPV相关研究基础少之又少。本研究根据NGPV VP2基因序列,设计了一对引物用于特异性扩增VP2序列。VP2基因片段利用PCR技术进行体外扩增,纯化后克隆到原核表达载体pET-32a中,将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中进行诱导。通过SDS-PAGE鉴定蛋白表达、蛋白可溶性和纯化效果。实验结果表明,His-VP2蛋白的分子量约为83kDa,主要以包涵体形式表达。纯化后的蛋白没有明显的杂带,表明该蛋白被成功纯化,并作为后续制备单克隆抗体提供基础材料。按照标准免疫程序,经过颈背部皮下注射VP2蛋白于BALB/c小鼠。取出小鼠脾脏制成细胞悬液,与SP2/0进行细胞融合,利用间接ELISA鉴定生长的杂交瘤细胞株。单克隆抗体与VP2蛋白和病毒的反应性分别利用Western blot和IFA方法进一步鉴定。通过体外和体内的方法大量生产单克隆抗体,并通过间接ELISA测定单克隆抗体的效价。在本研究中,成功地获得了 6株阳性杂交瘤细胞系,将其分别命名为2C4,4B12,4G6,6H1,7C8和7C10。其中4B12、4G6和7C8的抗体效价较高,并且这3株单克隆抗体都属于IgG1型,轻链为kappa链,Western blot与IFA结果显示这3株单克隆抗体与蛋白质和病毒都表现出良好的结合反应性。表明单克隆抗体制备成功,并为后续的研究提供重要工具。针对VP2蛋白设计截短肽,利用单克隆抗体4B12、4G6和7C8作为一抗,通过Western blot鉴定截短蛋白与单克隆抗体的结合情况,再根据鉴定结果设计引物,以与上述相同的方法制备和鉴定进一步截短的蛋白,直至确定最小抗原表位。结果显示,共确定了三个针对VP2 的抗原表位"38DGGATAE44"、"546WNPEIQF552"和"461RDIYLQGPIWAK472"。这三个表位在水禽细小病毒中较为保守,"38DGGATAE44"和"546WNPEIQF552"位于VP2蛋白表面且亲水性良好,而"461RDIYLQGPIWAK472"大部分氨基酸位于蛋白内部,亲水性也最差。表明三个抗原表位鉴定成功,可为NGPV分子结构与功能以及致病机制的进一步研究提供参考。利用单克隆抗体初步建立NGPV抗体检测阻断ELISA方法,经过条件优化后,将程序确定为:抗原以4μg/mL的量于4℃包被过夜,以5%FBS作为封闭液于37℃封闭1h,待测血清以1:2比例稀释后于37℃孵育1.5h,单克隆抗体以1:25600比例稀释后于37℃孵育0.5h,酶标二抗以1:8000比例稀释后于37℃孵育0.5h,双组分TMB避光显色15min。判定标准为:当样本阻断率大于33.53%时可判定为阳性,当样本阻断率小于26.39%时可判定为阴性,当样本阻断率介于33.53%与26.39%之间时判定为可疑。特异性实验结果显示,此方法特异性识别NGPV阳性鸭血清;敏感性实验结果显示,当阳性血清样本稀释至1:160时,此方法阻断率仍可达40.55%,敏感性良好。此方法的批内、批间重复性实验结果显示,变异系数均小于10%,重复性好。符合率实验结果显示,此方法符合率可达96%。用建立的方法对临床收集的143份血清进行抗体检测,共检测出26份阳性样本,11份可疑样本以及106份阴性样本。建立的该检测方法为国内NGPV抗体的检测提供了重要工具。综上所述,本研究成功制备了 6株抗NGPV VP2单克隆抗体,利用单克隆抗体成功鉴定出位于VP2蛋白上的三个抗原表位;并且基于单克隆抗体成功建立了 NGPV抗体检测阻断ELISA方法,为鸭短喙与侏儒综合征流行病学调查以及疫苗免疫效果的评价提供重要检测手段。

关键词：新型鹅细小病毒鸭短喙与侏儒综合征单克隆抗体表位阻断ELISA

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基于16SrRNA与转录组学测序分析新型鹅细小病毒对雏鸭的致病性

基于16SrRNA与转录组学测序分析新型鹅细小病毒对雏鸭的致病性

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作者：王璐瑶河北农业大学

学位级别：硕士

新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)的感染对我国养鸭业造成巨大经济损失,目前对其相关致病机制的研究鲜有报道。本研究用NGPV感染3日龄雏鸭,建立鸭短喙与侏儒综合征(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)动物模型。在NGP... 详细信息

新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)的感染对我国养鸭业造成巨大经济损失,目前对其相关致病机制的研究鲜有报道。本研究用NGPV感染3日龄雏鸭,建立鸭短喙与侏儒综合征(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)动物模型。在NGPV感染第2d左右雏鸭出现扎堆、精神萎靡的现象;在感染第4 d左右观察到有个别雏鸭出现站立困难、拉稀现象;在感染第14 d时感染组雏鸭喙长显著低于对照组(P鸭精神状态逐渐转好;在感染第21 d时感染组雏鸭体重显著低于对照组(P鸭脾脏肿大、胸腺点状出血;通过组织HE染色,感染组可观察到胸腺淤血、出血、淋巴细胞坏死、巨噬细胞增多、血栓;脾脏红髓增多、淤血、淋巴细胞减少;肠道绒毛断裂。通过绝对荧光定量PCR检测NGPV感染后胸腺、脾脏、肝脏、十二指肠、盲肠的病毒载量,结果显示:在NGPV感染第2d时病毒载量在各组织达到高峰,感染第28 d时各组织仍带毒,且各组织病毒载量在感染同一时间点均无显著差异,表明NGPV具有泛嗜性。利用16SrRNA测序技术和气相色谱法对感染NGPV 14 d、21 d、28 d后的雏鸭盲肠内容物进行检测分析,探究NGPV感染对雏鸭盲肠微生物群的影响。结果显示:雏鸭感染NGPV14 d时盲肠微生物多样性显著降低(P鸭的盲肠微生物群多样性与对照组无显著差异;感染后盲肠内容物中SCFAs含量总体水平下降,在感染14 d时雏鸭盲肠内容物中乙酸含量显著降低(P鸭盲肠内容物中丁酸、丙酸含量差异极显著降低(P鸭在感染NGPV后会引起短暂性的盲肠微生物失调,还会降低盲肠微生物代谢产物SCFAs的含量。通过相对荧光定量PCR方法检测胸腺和盲肠中IFN和促炎因子TNF-α、IL-6、IL-17,结果显示:在胸腺和盲肠中IFN-α、IFN-β、IFN-γ在感染早期表达量就达到峰值,促炎因子TNF-α、IL-6、IL-17也均有升高,表明:NGPV感染后可以迅速的激发机体的免疫反应。对感染后14 d雏鸭的胸腺和回肠进行转录组学分析,结果显示:感染组回肠中共有109个基因发生变化,上调基因有78个,下调基因有31个;感染组胸腺中共有189个基因发生变化,上调基因有111个,下调基因有78个。胸腺中差异基因富集于NF-κB信号通路、B细胞受体信号通路等,回肠中差异基因富集于Toll样受体信号通路、JAK-STAT信号通路、Th1和Th2细胞分化等。表明NGPV感染激发了机体免疫反应和宿主细胞的相关抗病毒信号通路。本研究探讨了雏鸭感染NGPV后盲肠微生物失调与形成侏儒、短喙、易骨折等临床症状可能存在的内在联系及激活宿主免疫反应的相关信号通路。以上试验结果以期为NGPV的致病机制的研究提供一定理论基础。

关键词：新型鹅细小病毒鸭短喙与侏儒综合征 16SrRNA测序转录组测序盲肠微生物短链脂肪酸

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新型鹅细小病毒鸭胚传代毒全基因组序列分析及其感染性克隆的构建

新型鹅细小病毒鸭胚传代毒全基因组序列分析及其感染性克隆的构建

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作者：郝雪飘河北农业大学

学位级别：硕士

自2014年以来,我国江苏、山东、河北等地商品肉鸭群出现了以雏鸭发育迟缓,上下喙萎缩,舌头外伸、肿胀、向下弯曲为主要特征的疾病,俗称为“鸭短喙与侏儒综合征”(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS),给我国养鸭业造成了巨大经济损... 详细信息

自2014年以来,我国江苏、山东、河北等地商品肉鸭群出现了以雏鸭发育迟缓,上下喙萎缩,舌头外伸、肿胀、向下弯曲为主要特征的疾病,俗称为“鸭短喙与侏儒综合征”(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS),给我国养鸭业造成了巨大经济损失。该病的病原为新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV),也称为鸭源鹅细小病毒、新型鸭细小病毒等。目前,决定NGPV毒力的关键基因和NGPV跨种传播的原因尚不明确。为获得一株NGPV减毒毒株,本研究将NGPV SD株在鸭胚上连续传至F50代,将F5代尿囊液与F50代尿囊液分别感染3日龄樱桃谷鸭进行致病性试验,观察感染后鸭的体重、喙长与排毒情况。与对照组相比,F5感染组体重在14 dpi时呈极显著差异,喙长在7 dpi时呈显著差异,14 dpi时呈极显著差异,在3 dpi时10只雏鸭均出现排毒;而F50感染组体重在14 dpi时呈显著差异,21 dpi时呈极显著差异,喙长在7 dpi时呈显著差异,14 dpi时呈极显著差异,在5 dpi时10只雏鸭均出现排毒;综上所述,与F5代相比,F50代毒力明显减弱。为探究影响NGPV毒力的基因位点,本研究对SD株F10、F20、F30、F40和F50进行了全基因组测序,经序列比对发现SD-F50突变的碱基位点涵盖了之前所有代次中突变的位点,将SD-F50与SD株进行碱基序列对比,发现在ITR区域中发生G26A、C61T、G320A、C355T突变,并于72、309位分别插入了碱基A和碱基T;在NS基F50与SD株的NS蛋白与VP蛋白氨基酸序列进行比较,在NS基因中,SD-F50相比较于SD株的突变为N225T,在VP基因,SD-F50相比较于SD株的突变为T465A、N703K;以上位点的改变或许会影响NGPV的毒力。为进一步探究这些突变位点与致病力之间的关系,本研究构建了 SD株的全长感染性克隆质粒。通过同义突变在基因组3807位引入遗传分子标记,消除Nco Ⅰ酶切位点,可后续用于区分拯救病毒与亲本病毒。将重组质粒同时转染鸭胚尿囊腔与卵黄囊途径拯救病毒,然后对其进行鉴定,将其命名为rSD。本研究通过对NGPV SD株传代株进行全基因组序列分析,发现SD株基因组序列在鸭胚传代过程中发生了一些适应性突变,这些突变或许与NGPV的致病性和NGPV对鸭的适应性有关,为NGPV毒力的关键基因的研究提供了参考依据。同时NGPV SD株感染性克隆的成功构建也可为NGPV毒力因素与跨种传播研究提供技术支持。

关键词：新型鹅细小病毒鸭短喙与侏儒综合征全基因组分析毒力基因感染性克隆

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