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尾丝蛋白在噬菌体吸附鸭疫里默氏菌中的作用

福建农业学报 2024年第1期39卷 1-6页

作者：刘娜黄瑜陈红梅江南松刘荣昌傅光华傅秋玲梁齐章万春和李昂程龙飞福建农林大学动物科学学院福建福州350002 福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013 福建省畜禽疫病防控产业技术创新研究院福建福州350013 福建省禽病防治重点实验室福建福州350013

【目的】以鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer)噬菌体CRP2为对象,研究尾丝蛋白(Tail fiber protein,TFP)对噬菌体吸附功能的影响。【方法】克隆ORF70假定的TFP基因,构建重组表达载体pET28a(+)-TFP,在大肠杆菌*** BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化。酶联免疫吸附试验(ELISA)测定重组蛋白与CRP2噬菌体的宿主菌外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)的结合作用。竞争吸附试验测定重组蛋白对CRP2噬菌体吸附率的影响。【结果】构建了pET28a(+)-TFP重组表达质粒,在大肠杆菌中得到了可溶性表达。纯化的重组蛋白可以与宿主菌的OMP结合,也可以抑制CRP2对其宿主菌的吸附。【结论】ORF70编码的TFP是噬菌体CRP2的一种受体结合蛋白,其对应的受体是宿主菌的OMP。

关键词：鸭疫里默氏菌噬菌体尾丝蛋白吸附

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鸭疫里默氏菌感染对鸭生长发育及肠黏膜屏障功能的影响

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山西农业科学 2024年第3期52卷 153-158页

作者：陶志云徐文娟朱春红施祖灏刘宏祥宋卫涛章双杰王志成李慧芳江苏省家禽科学研究所江苏扬州225125 谱尼测试集团江苏有限公司江苏苏州215000

为了为鸭疫里默氏菌与机体的相互作用及作用机制研究提供基础数据,以雏鸭为研究对象,开展鸭人工感染鸭疫里默氏菌试验,分别测定感染组和对照组1、2、3、5、9、14 d等不同时间段的体质量、小肠各肠段的长度以及血浆中内毒素和血清中乳酸... 详细信息

为了为鸭疫里默氏菌与机体的相互作用及作用机制研究提供基础数据,以雏鸭为研究对象,开展鸭人工感染鸭疫里默氏菌试验,分别测定感染组和对照组1、2、3、5、9、14 d等不同时间段的体质量、小肠各肠段的长度以及血浆中内毒素和血清中乳酸脱氢酶含量;荧光定量PCR法检测肠黏膜屏障功能相关基因MUC2和MYLK的表达量,探讨鸭疫里默氏菌感染对鸭生长发育和肠黏膜屏障功能的影响。结果表明,与对照组相比,感染组5、9 d体质量显著降低;感染鸭疫里默氏菌5 d十二指肠和空肠的长度显著降低;感染鸭疫里默氏菌1 d血浆中内毒素和血清中乳酸脱氢酶的含量均显著增加;鸭人工感染鸭疫里默氏菌的MUC2和MYLK表达量在十二指肠和空肠主要表现为下调,而在回肠MUC2的表达量表现为先下降再上调,MYLK的表达量表现为先下调再恢复至对照水平。综上,鸭人工感染鸭疫里默氏菌会减缓鸭的体质量增长和小肠生长,引起鸭的肠黏膜屏障功能相关基因的表达发生变化。

关键词：鸭疫里默氏菌鸭小肠黏膜屏障

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鸭疫里默氏菌的分离和鉴定

畜禽业 2024年第3期35卷 26-30页

作者：张程沭阳县农业农村局江苏沐阳223600

为明确规模化鸭场病因,开展了鸭疫里默氏菌的分离和鉴定。通过采集病料进行实验室诊断,经细菌分离鉴定及PCR特异性扩增、产物测序鉴定方法,明确从规模化鸭场分离得到的细菌为鸭疫里默氏菌。检测结果为鸭场制定科学的预防和治疗方案提供... 详细信息

为明确规模化鸭场病因,开展了鸭疫里默氏菌的分离和鉴定。通过采集病料进行实验室诊断,经细菌分离鉴定及PCR特异性扩增、产物测序鉴定方法,明确从规模化鸭场分离得到的细菌为鸭疫里默氏菌。检测结果为鸭场制定科学的预防和治疗方案提供了参考,对及时治疗病鸭、防止疾病传播、减少养鸭场的经济损失具有重要意义。

关键词：鸭疫里默氏菌分离鉴定

鸭疫里默氏菌贵州分离株OmpA基因的克隆及生物信息学分析

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动物医学进展 2022年第9期43卷 12-19页

作者：马光强刘丽娟陈国权吴良涛杨均刘军泽李潇蒙潘成文周碧君黔南民族职业技术学院贵州都匀558000 都匀市农业农村局贵州都匀558000 贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025

为了解鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)贵州分离株OmpA基因遗传特性和用作基因工程亚单位疫苗开发的可能性,以13株RA贵州分离株(RA-SS-1~12株和RA-AS-1株)为研究对象,用RA OmpA基因特异性引物对13株RA贵州分离株进行PCR扩增... 详细信息

为了解鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)贵州分离株OmpA基因遗传特性和用作基因工程亚单位疫苗开发的可能性,以13株RA贵州分离株(RA-SS-1~12株和RA-AS-1株)为研究对象,用RA OmpA基因特异性引物对13株RA贵州分离株进行PCR扩增,将扩增得到的OmpA基因片段与pMD19-T载体连接,转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞,经PCR和双酶切鉴定为阳性克隆后进行测序;用生物信息学软件将13株RA贵州分离株与国内外15株参考株OmpA基因序列进行核苷酸同源性分析和遗传进化分析,并对RA OmpA蛋白进行理化性质分析、跨膜结构和信号肽预测、B细胞抗原表位预测、二级和三级结构预测。结果表明,13株RA贵州分离株OmpA基因全长均为1164 bp,可编码387个氨基酸,株间核苷酸同源性为100%,与参考株GZ-RA8、GZ-RA9、GZ060302、SD-RA2018和Yb2株的同源性达100%”;RA OmpA蛋白属亲水性蛋白,无跨膜和信号肽区域,含有较多的优势抗原表位结构,且OmpA基因高度保守并具有良好的抗原特性,其可作为制备RA基因工程亚单位疫苗的候选蛋白。

关键词：鸭疫里默氏菌 OmpA基因生物信息学分析

鸭疫里默氏菌流行病学调查及里默氏菌属新种的鉴定

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鸭疫里默氏菌流行病学调查及里默氏菌属新种的鉴定

作者：卢金号四川农业大学

学位级别：硕士

鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的主要感染鸭、鹅等禽类的传染病,发病率高,是影响全球养鸭业发展的重要疾病。如今已确认的鸭疫里默氏菌血清型至少21种,且不同血清型间基本无交叉保护,现有疫苗难以... 详细信息

鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的主要感染鸭、鹅等禽类的传染病,发病率高,是影响全球养鸭业发展的重要疾病。如今已确认的鸭疫里默氏菌血清型至少21种,且不同血清型间基本无交叉保护,现有疫苗难以针对性预防。目前暂无可靠的特异性PCR检测方法可用于检测该病。基于此本研究利用92株鸭疫里默氏菌全基因组数据筛选靶序列进而建立特异性PCR检测方法,同时调查2019年至2021年全国范围内鸭疫里默氏菌流行情况,为疾病防控提供参考。在调查过程中发现了一株里默氏菌属新种,菌株编号为RCAD0985。首先,利用ATCC 11845基因组作为查询对象,与美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)参考基因组数据库(Refseq genome database)中收录的92条鸭疫里默氏菌全基因组序列比对,筛选保守片段。再将所得保守序列与去冗余核酸数据库(Nucleotide collection,NT)比对,排除非鸭疫里默氏菌特异序列,得到候选靶序列。利用oligo 7在候选序列中设计引物。对引物进行特异性、保守性、灵敏度和准确率评价。引物扩增产物长334 bp,位于J6M13S09305基因,能特异性鉴定鸭疫里默氏菌。对不同稀释度的鸭疫里默氏菌DNA样品进行扩增,最小检出量为1×10-5 ng/μL和100 CFU/m L。本研究建立的鸭疫里默氏菌特异性检测方法准确率为99.0%(510/515)。与细菌分离鉴定方法的一致性好(kappa=0.884,P菌分离和鉴定,采用玻片凝集试验鉴定鸭疫里默氏菌分离株血清型。共分离到鸭疫里默氏菌450株,其中2型77株(17.1%),5型50株(11.1%),6型59株(13.1%),11型87株(19.3%)。调查结果显示近三年我国主要流行血清型为2、5、6、11型,优势血清型为11型。在调查过程中发现了一株里默氏菌属新种。该菌形态特征和生化特性与鸭疫里默氏菌较为相似,基因组全长2.5 Mb,G+C含量为39.57%,在16S r DNA系统发育树中与里默氏菌属菌株位于同一进化枝。与里默氏菌属种内细菌全基因组比对得到Ortho ANIu值的范围为72.72%5.48%,DNA-DNA杂交值为20.22.1%。结合形态学观察、生理生化鉴定证实RCAD0985为里默氏菌属新种,命名为Riemerella ***.。

关键词：鸭疫里默氏菌全基因组特异性PCR 血清型里默氏菌属新种

鸭疫里默氏菌CH-2株荚膜多糖与血清分型的关系

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鸭疫里默氏菌CH-2株荚膜多糖与血清分型的关系

作者：刘燕玲四川农业大学

学位级别：硕士

鸭传染性浆膜炎给水禽养殖业带来了巨大的经济损失,经病原的分离与鉴定确定引起该病的病原为鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)。RA在感染动物机体时,最先与机体免疫系统相遇的一种细菌结构是存在于该菌最外层的荚膜多糖(Capsu... 详细信息

鸭传染性浆膜炎给水禽养殖业带来了巨大的经济损失,经病原的分离与鉴定确定引起该病的病原为鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)。RA在感染动物机体时,最先与机体免疫系统相遇的一种细菌结构是存在于该菌最外层的荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)。CPS广泛用于细菌血清分型。目前,已报道了21种RA的血清型,但目前尚不清楚决定RA血清分型的多糖抗原,且各种血清型间基本无交叉保护,这导致了用商品化疫苗预防鸭疫里默氏菌传染病的效果不佳。本实验室以往的研究中对RA CH-2荚膜合成基因簇上进行了预测。该基因簇上的基因G148＿RS04400、G148＿RS04405均参与基酸(D-Qui NAc4Nac)的合成。基酸是组成荚膜多糖的一种单糖。我们以此为突破口探究荚膜多糖与鸭疫里默氏菌血清分型的关系。本研究首先通过自然转化方法构建基因G148＿RS04400和G148＿RS04405缺失株。实时荧光定量PCR结果表明基因G148＿RS04400和G148＿RS04405被成功缺失且不影响其下游基因的表达。然后本研究利用接合转移构建相应基因的回补菌株。荚膜染色结果表明,两个缺失株菌体表面的荚膜消失,亲本株和两个回补株菌体表面具有荚膜;透射电镜结果与荚膜染色结果一致,说明这两个基因的缺失会引起荚膜缺陷。提取亲本株RA CH-2和缺失株的荚膜多糖并可视化的结果说明,阿尔新蓝染色而不是银染可以使荚膜多糖可视化,此外缺失株仍能够提取出荚膜多糖说明细菌内部荚膜多糖的合成没有终止。提取脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)并进行银染的结果表明RA CH-2的脂多糖不含有O抗原长链。玻片凝集试验的结果表明,亲本株仅能与2型血清凝集,但这2个基因的缺失株都能与1-13型血清发生凝集;琼脂扩散试验说明脂多糖与血清的结合不具有特异性,RA CH-2荚膜多糖与2型血清的结合具有特异性。RA CH-2荚膜多糖免疫小鼠得到特异性血清说明提取的荚膜多糖还具有免疫原性,该血清与荚膜多糖的琼脂扩散实验结果进一步证明了荚膜多糖与血清的结合具有特异性。综上,本研究证明了基因G148＿RS04400和G148＿RS04405与荚膜多糖的合成有关,它的缺失会导致鸭疫里默氏菌表面的荚膜消失,会导致菌株的血清型发生改变。阿尔新蓝染色法是检测鸭疫里默氏菌荚膜多糖的有效方法。通过提取荚膜多糖和脂多糖进行琼脂扩散实验表明荚膜多糖是决定鸭疫里默氏菌血清分型的特异性抗原。

关键词：鸭疫里默氏菌荚膜血清分型荚膜多糖脂多糖

鸭疫里默氏菌对β-内酰胺类药物耐药机制的研究

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鸭疫里默氏菌对β-内酰胺类药物耐药机制的研究

作者：魏心怡四川农业大学

学位级别：硕士

鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)是一种细菌性病原体,可感染鸭、鹅、火鸡及其他禽类,是危害养鸭业发展的重要因素。β-内酰胺类药物是目前临床大量使用的药物之一。根据近些年的报道,鸭疫里默氏菌对β-内酰胺类药物的耐药水... 详细信息

鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)是一种细菌性病原体,可感染鸭、鹅、火鸡及其他禽类,是危害养鸭业发展的重要因素。β-内酰胺类药物是目前临床大量使用的药物之一。根据近些年的报道,鸭疫里默氏菌对β-内酰胺类药物的耐药水平不断增高,耐药谱不断变广,耐药情况日渐加重。本研究基于RA分离株对β-内酰胺类耐药表型,结合菌株基因组信息,探究了RA对β-内酰胺类药物的耐药机制,主要得到以下结果:1.鸭疫里默氏菌对β-内酰胺类药物的耐药表型检测首先测定分离自2010～2020年、来自17个地区的376株鸭疫里默氏菌对青霉素类药物氨苄青霉素、第一代头孢菌素类药物头孢噻吩、第三代头孢菌素类药物头孢噻肟及第四代头孢菌素类药物头孢吡肟和头霉素类抗生素头孢西丁五种抗生素的MIC值。对以上菌株进行β-内酰胺类耐药分析,结果表明,376株鸭疫里默氏菌对上述5种β-内酰胺药物的耐药比率分别为4.3%(16/376)、4.5%(17/376)、23.1%(87/376)、6.4%(24/376)、0.5%(2/376)。RA对β-内酰胺类的抗性呈上升趋势。2.耐药基因在鸭疫里默氏菌对β-内酰胺类药物耐药性中的影响通过将NCBI上RA的基因组序列在CARD与Resfinder进行耐药基因的比对预测,在RA-CH-1、RA-CH-2、RCAD0121、RCAD0122、RCAD179等19株菌株中检测到D类β-内酰胺酶基因bla。RCAD0416是一株对β-内酰胺类高度耐药的多重耐药菌株,在该菌检出D类β-内酰胺酶基因bla。通过Prometh ION测序仪对RCAD0416进行全基因组测序,结果显示bla位于RCAD0416携带的野生质粒p RCAD0416RA-1上。该质粒全长37356bp,携带四环素类、氟苯尼考、氨基糖苷类和大环内酯类抗性基因。将以上耐药基因克隆至p BAD24,表达至DH5α,bla介导DH5α对β-内酰胺类药物的耐药水平增加4-8倍。bla不介导细菌对β-内酰胺类的耐药水平产生影响。将bla克隆至p ET28a,转到BL21中,使用诱导剂诱导该基因过表达后,bla介导BL21对β-内酰胺类药物的耐药水平增加8-64倍。将p RCAD0416RA-1通过电转化转到大肠杆菌K-12 X7232中,引起受体菌对β-内酰胺类药物氨苄西林、头孢西丁、头孢吡肟的MIC值提高8倍。3.鸭疫里默氏菌对β-内酰胺类药物外排作用研究选择对β-内酰胺类高度耐药且不携带相关抗性基因的菌株RCAD0589、RCAD0651和多重耐药株RCAD0416进行外排作用的分析。对以上菌株进行基因组分析,三株菌株均携带ABC相关转运蛋白Ran A、Ran B。除此之外,RCAD0589、RCAD0651还携带RND家族外排泵相关基因。RCAD0416携带RND、MATE、SMR家族外排泵。通过加入外排泵抑制剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)和维拉帕米(VP)两种抑制质子能驱动型外排泵,结合对外排泵基因信息的分析,证实了RA中质子能型外排泵RND能够外排β-内酰胺类药物,使RA对β-内酰胺类产生抗性。综上所述,本研究检测了RA对β-内酰胺类药物的耐药情况,并证明质粒携带的耐药基因bla及质子能驱动型外排泵RND介导鸭疫里默氏菌对β-内酰胺类药物的抗性。

关键词：鸭疫里默氏菌 β-内酰胺类耐药外排泵 blaOXA 质粒

宽谱鸭疫里默氏菌噬菌体筛选及生物学特性研究

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中国畜牧兽医 2023年第3期50卷 1169-1176页

作者：程龙飞廖维连陈红梅江南松傅秋玲万春和刘荣昌施少华黄瑜傅光华福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州350013 将乐县动物疫病预防控制中心将乐353300

【目的】筛选宽谱鸭疫里默氏菌噬菌体,作为治疗用噬菌体组合的候选毒株。【方法】以不同含量的噬菌体进行噬斑分析测定35株噬菌体的噬菌谱;利用透射电镜观察、热与酸碱稳定性评估、最佳感染复数(MOI)测定、一步生长试验、杀菌试验分析... 详细信息

【目的】筛选宽谱鸭疫里默氏菌噬菌体,作为治疗用噬菌体组合的候选毒株。【方法】以不同含量的噬菌体进行噬斑分析测定35株噬菌体的噬菌谱;利用透射电镜观察、热与酸碱稳定性评估、最佳感染复数(MOI)测定、一步生长试验、杀菌试验分析噬菌体的形态结构和部分生物学特性。【结果】35株噬菌体中vB_RanS_202的裂解谱最宽,能裂解42%(42/100)的鸭疫里默氏菌,包括血清1、2、6、10、11和13型共6种血清型菌株。该噬菌体由直径约60 nm的截面为六边形的头部和长约220 nm的尾部组成,不耐热,效价为1.0×10^(7)PFU/mL的噬菌体,经50℃水浴80 min或60℃水浴20 min,即降为1.8×10^(7)~2.6×10^(7)PFU/mL。在pH 5.0~9.0的环境中能维持活性。以RAf488为宿主菌测得其最佳MOI为0.01。一步生长曲线显示,其潜伏期和暴发期分别为60和75 min,平均裂解量约为150 PFU/cell。在宿主菌RAf488中的杀菌试验结果显示,MOI在0.004~0.016时,vB_RanS_202均具有杀菌作用。【结论】噬菌体vB_RanS_202具有宽裂解谱的特点,具备在液体培养基中的杀菌能力。本研究结果为后续噬菌体治疗用毒株的筛选提供参考。

关键词：鸭疫里默氏菌噬菌体噬菌谱生物学特性

氨苄青霉素与鸭疫里默氏菌噬菌体协同作用的研究

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中国动物传染病学报 2022年第4期30卷 48-53页

作者：程龙飞刘荣昌陈红梅万春和傅光华施少华傅秋玲黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建省禽病防治重点实验室福州350013

为研究氨苄青霉素(AMP)和鸭疫里默氏菌噬菌体的协同作用,在亚MIC浓度AMP下,测定噬菌体RAP15对鸭疫里默氏菌RAf63生长的影响、RAP15形成的噬菌斑大小、增殖效果、不同噬菌体株对RAf63的裂解情况。动物试验比较噬菌体、AMP、二者合用对RA... 详细信息

为研究氨苄青霉素(AMP)和鸭疫里默氏菌噬菌体的协同作用,在亚MIC浓度AMP下,测定噬菌体RAP15对鸭疫里默氏菌RAf63生长的影响、RAP15形成的噬菌斑大小、增殖效果、不同噬菌体株对RAf63的裂解情况。动物试验比较噬菌体、AMP、二者合用对RAf63攻击的治疗效果。结果,亚MIC浓度的AMP下,RAP15对RAf63生长的抑制作用提高了4倍、RAP15噬菌斑的大小没有发生变化、RAP15培养后子代噬菌体增加,部分噬菌体株表现出裂解RAf63的能力。RAf63人工感染番鸭后,AMP和RAP15联合治疗组,比单用其中任何一种的效果都更好。研究表明,在体外抑制鸭疫里默氏菌的生长或体内治疗其感染,AMP和噬菌体都具有协同作用。该研究为应用AMP和噬菌体联合制剂来防控传染性浆膜炎提供了理论依据。

关键词：鸭疫里默氏菌噬菌体氨苄青霉素协同作用

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