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无血清全悬浮MDCK细胞培养H9亚型禽流感病毒工艺研究

无血清全悬浮MDCK细胞培养H9亚型禽流感病毒工艺研究

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作者：方倪冉华南农业大学

学位级别：硕士

无血清全悬浮MDCK细胞培养H9亚型禽流感病毒是旨在克服鸡胚及贴壁细胞在禽流感疫苗生产中的缺陷而建立的一种培养方式,然而目前无血清全MDCK细胞培养H9亚型禽流感病毒工艺尚未成熟,因此本文对培养H9亚型禽流感病毒的工艺进行探究,为建... 详细信息

无血清全悬浮MDCK细胞培养H9亚型禽流感病毒是旨在克服鸡胚及贴壁细胞在禽流感疫苗生产中的缺陷而建立的一种培养方式,然而目前无血清全MDCK细胞培养H9亚型禽流感病毒工艺尚未成熟,因此本文对培养H9亚型禽流感病毒的工艺进行探究,为建立和优化细胞生物反应器大规模生产禽流感疫苗工艺提供试验数据支持和借鉴。本研究首先在摇瓶中探究MDCK-sus细胞无血清全悬浮培养生长特性,感染参数对病毒增殖的影响,AIV在MDCK-sus细胞增殖过程中营养物质代谢变化,补加不同比例新鲜培养基接种病毒后对不同时间活细胞密度及病毒增殖的影响。结果表明:以1.5×10cells/m L的接种密度培养细胞具有最优的效率;采用终浓度为7μg/m L的TPCK-胰酶、培养温度为33℃、MOI为0.01、TOI为60小时较为适宜,优化后禽流感病毒HA滴度值可达到10 log,病毒含量达到10EID/0.1 m L;禽流感病毒在细胞增殖过程中加快了葡萄糖和谷氨酰胺等营养物质的消耗,同时也加快了对乳酸和铵离子等代谢产物的生成;各比例组补加新鲜培养基并接种病毒后,按照3:2的细胞悬液与新鲜培养基的体积比补加新鲜培养基为最优。进一步尝试了不同规格的生物反应器的工艺,通过放大培养至3 L搅拌式生物反应器进行验证及探究p H值对AIV增殖的影响,继续放大培养至50 L激流式生物反应器进行验证。结果表明:当p H值为7.0时,感染后48小时AIV的HA滴度达到峰值11 log,病毒含量达到峰值10EID/0.1 m L;基于3 L搅拌式生物反应器的悬浮细胞及病毒培养工艺,继续放大培养至50 L生物反应器:感染后48小时HA滴度达到峰值11 log,病毒含量达到最高值10EID/0.1 m L,与3 L生物反应器培养特性基本一致。为了增加MDCK细胞表面受体丰度从而进一步提高禽流感病毒的滴度,本研究将鸡st3gal1基因插入到慢病毒载体中构建重组慢病毒,然后转导细胞,经嘌呤霉素筛选后,收集抗性细胞并命名为MDCK-adh-st3gal1细胞;MDCK-adh-st3gal1细胞传代培养至第10代,经q PCR法检测细胞鸡st3gal1基因的表达及流式细胞术检测细胞表面SAa-2,3gal和SAa-2,6Ga受体丰度,最后对比改造前后的细胞对H9亚型禽流感病毒增殖能力。结果表明:重组质粒转导细胞后,效果良好,荧光率达80%以上;MDCK-adh-st3gal1细胞传至第10代,目的基因鸡st3gal1仍有表达;稳定表达鸡st3galI基因的MDCK细胞,提高了细胞表面a-2,3连接型受体丰度,更适于H9亚型禽流感病毒的感染。本课题研究了生物反应器无血清全悬浮MDCK细胞培养H9亚型禽流感病毒的生产工艺及通过改造MDCK细胞系,为细胞生物反应器大规模生产禽流感疫苗工艺的建立和优化提供了参考和借鉴意义。

关键词： H9亚型禽流感病毒 MDCK细胞无血清全悬浮培养鸡st3gal1基因

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