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中国动物传染病学报 2024年

作者：殷俊磊赵敏胡静文柏俞彤张贺婧阙可冰郭迅羽新乡学院医学院

为建立一种快速检测沙门菌与鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR方法。分析GenBank中不同菌株的全基因组序列，筛选出1段鸡白痢/鸡伤寒沙门菌与其它血清型沙门菌有差异的特异性序列，设计1对特异性引物，建立PCR检测方法，并进行初步临床应用。... 详细信息

为建立一种快速检测沙门菌与鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR方法。分析GenBank中不同菌株的全基因组序列，筛选出1段鸡白痢/鸡伤寒沙门菌与其它血清型沙门菌有差异的特异性序列，设计1对特异性引物，建立PCR检测方法，并进行初步临床应用。结果显示，鸡白痢/鸡伤寒沙门菌扩增出了139 bp的特异性条带，其它血清型沙门菌扩增出了181 bp的特异性条带，非沙门菌未扩增出条带；该方法检测鸡白痢沙门菌和肠炎沙门菌的最低限度均为10 CFU/μL；临床分离菌株检测结果显示，该方法与传统的鉴定方法相比较，符合率达100％。结果表明，建立的PCR方法能够快速检测沙门菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒沙门菌。

关键词：鸡白痢/鸡伤寒沙门菌沙门菌 PCR 检测

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鸡白痢/鸡伤寒诊断方法的建立与初步应用

鸡白痢/鸡伤寒诊断方法的建立与初步应用

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作者：许莹扬州大学

学位级别：硕士

鸡白痢(PullorumDisease,PD)是由鸡白痢沙门菌(Salmnnella enterica serovar Pullorum,SSlmonellaPullorum)引起的一种急性全身性疾病,多见于雏鸡和较大的青年鸡,成年鸡亦可被感染。鸡伤寒(Fowl Typhoid,FT)是由鸡伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Gallinarum,Salmonella Gallinarum)引起的一类急性或慢性的败血性传染病,通常影响成年鸡,且各年龄段的鸡都易感。鸡白痢和鸡伤寒严重影响着我国禽养殖业的发展,并在2012年被列入《国家中长期动物疫病防治规划》中国家强制规定净化的细菌病。玻板凝集试验是目前最常用且最简便的诊断禽类是否感染鸡白痢沙门菌或鸡伤寒沙门菌的方法,但往往会与D群沙门菌的其他血清型(如肠炎沙门菌)发生交叉反应。因此,本研究目的:(1)基于鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌中的特异性基因SPUL693、SPUL694分别建立快速检测鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR新方法。(2)基于鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌鞭毛缺失这一特性,制备针对肠炎沙门菌鞭毛蛋白的单克隆抗体,初步建立检测肠炎沙门菌抗体的竞争ELISA方法,与实验室建立的基于沙门菌09单克隆抗体竞争ELISA方法联用可检测鸡白痢/鸡伤寒沙门菌抗体,为今后鸡白痢和鸡伤寒的诊断提供技术储备。1.鸡白痢/鸡伤寒沙门菌PCR检测方法的建立及初步应用本研究以特异性存在于鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌中的SPUL693、SPUL694作为靶基因,分别建立快速检测鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的一步PCR方法。对沙门菌属的27种血清型菌株以及6种非沙门菌菌株进行特异性检测,结果显示鸡白痢/鸡伤寒沙门菌可于SPUL693-PCR、SPUL694-PCR中分别扩增出2160bp、2619bp单一目的条带,其他细菌均无特异性条带出现,表明两种PCR方法特异性良好。灵敏性结果显示,SPUL693-PCR方法最低检测限为2.143pg/μL、6 CFU。SPUL694-PCR方法最低检测限为4.03pg/μL、24CFU。将两种PCR方法分别用于禽场临床样品检测,两种PCR方法均可直接从样品增菌液中检出鸡白痢沙门菌,PCR结果与常规沙门菌分离鉴定结果一致。本研究建立的检测鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的SPUL693-PCR、SPUL694-PCR方法具有特异性好、灵敏性高等特点,为鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的检测提供了新方法。2.沙门菌鞭毛蛋白H:g抗原单克隆抗体的制备与初步应用本研究使用改良培养基M-broth培养肠炎沙门菌C50041,使用酸裂解法提取鞭毛蛋白。SDS-PAGE鉴定目的条带大小约为57 kDa。Western Blot结果显示目的条带具有良好的免疫反应性。将鞭毛蛋白免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合。以鞭毛蛋白作为检测原,建立间接ELISA方法对阳性细胞克隆进行筛选。经4次亚克隆,最终获取7株稳定分泌针对鞭毛蛋白单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为 9E3、12F5、12G3、12E3、7E9、7D7、7E2,亚型均为 IgGl 型。Western B1ot试验结果显示,7株单抗与目标抗原鞭毛蛋白均具有较好的免疫反应性。7株单抗的杂交瘤细胞培养上清效价均在l×104以上,部分达到2×105以上;7株单抗的腹水效价均较高,在4×106以上,其中12E3和7E2的腹水效价达到1×107以上。特异性结果显示7株单抗均特异性与含有H:g鞭毛蛋白抗原的血清型沙门菌反应,包括肠炎沙门菌(***,H:g,m)、都柏林沙门菌(***,H:g,p)、阿贡纳沙门菌(***,H:f,g,s)、蒙得维的亚沙门菌(***,H:g,m,[p],s)、里森沙门菌(***,H:f,g)以及德尔卑沙门菌(***,H:f,g),与其他沙门菌血清型及其他细菌均不反应,表明它们是针对沙门菌H:g抗原的特异性单抗。阻断ELISA测定结果显示7株单抗均具有识别天然抗原的能力。首先使用实验室建立的09竞争ELISA方法对鸡白痢沙门菌阳性血清、肠炎沙门菌阳性血清以及SPF鸡血清进行检测,再使用12E3株单抗初步建立的竞争ELISA方法进行检测,结合两种竞争ELISA结果可鉴别鸡白痢/鹏伤寒沙门菌阳性血清(09抑制率:88%-95%;H:g抑制率:8%-23%)与肠炎沙门菌阳性血清(09抑制率:72%-92%;H:g抑制率:65%-73%)。以上初步结果表明本研究制备的7株单抗具有良好的应用前景,为鸡白痢/鸡伤寒的诊断与防控提供了重要的生物材料。

关键词：鸡白痢/鸡伤寒沙门菌 PCR 肠炎沙门菌鞭毛蛋白单克隆抗体

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