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鸡λ干扰素在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达及其抗病毒作用研究

鸡λ干扰素在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达及其抗病毒作用研究

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作者：马莲扬州大学

学位级别：硕士

干扰素(Interferon, IFN)是脊椎动物病毒防御系统的重要组成部分,主要分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅲ型干扰素又称λ干扰素(IFN-λ),是2003年发现的一种新型干扰素家族。Ⅲ型干扰素不仅具有与Ⅰ型干扰素相似的抗病毒活性,而且具有与Ⅱ型... 详细信息

干扰素(Interferon, IFN)是脊椎动物病毒防御系统的重要组成部分,主要分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅲ型干扰素又称λ干扰素(IFN-λ),是2003年发现的一种新型干扰素家族。Ⅲ型干扰素不仅具有与Ⅰ型干扰素相似的抗病毒活性,而且具有与Ⅱ型干扰素相似的免疫调节功能。IFN-λ受体分布的特异性,表明IFN-Xλ能够在一些上皮细胞及免疫细胞上发挥相对独立和特异的抗病毒作用。本研究以ChIFN-λ为研究对象,利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达重组ChIFN-λ,初步开展了其抗病毒活性研究。本研究以鸡肾组织提取的总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增ChIFN-λ。序列分析表明ChIFN-λ全长561 bp,共编码186个氨基酸,其中前23个氨基酸构成ChIFN-λ,信号肽。亚克隆其成熟蛋白编码基因492 bp,将其克隆入pET-32a,构建原核表达载体pET-32a-ChIFN-λ,转化至大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析证实表达产物为36 KD左右的融合蛋白,并且主要以不溶性包涵体存在。利用高亲和Ni-NTA层析树脂纯化表达产物,将其作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备ChIFN-λ的多克隆抗体,ELISA检测血清抗体效价为1：16000。分别将此血清与抗His单克隆抗体作为-抗,通过Western-blot检测ChIFN-的原核表达产物,结果均在36 KD处出现特异性条带。为了使ChIFN-λ能够以分泌形式表达,利用重叠PCR在ChIFN-λ成熟肽序列前引入昆虫细胞可识别的gp67信号肽序列,将其克隆至载体pFastBacTM1中,构建转移载体pFastBac-gp67SP-ChIFN-λ,转化DH10ac感受态细胞,通过特异性位点转座,将ChIFN-λ整合到]Bacmid穿梭质粒中,经过筛选纯化得到穿梭质粒Bacmid-ChIFN-λ;用脂质体介导穿梭质粒转染Sf9细胞,得到重组杆状病毒AcMNPV-ChIFN-λ。间接免疫荧光和Western-blot试验证明带有gp67信号肽的重组ChIFN-λ在昆虫细胞中呈现分泌表达。在昆虫细胞感染96h后,分别收获细胞上清和细胞裂解液,并通过水泡性口炎病毒(VSV)感染鸡胚肾细胞(CEKC)的细胞病变抑制试验测定细胞上清和细胞裂解液的抗病毒效果,结果表明细胞培养上清中的重组蛋白表现出较高的抗病毒活性,上清的抗病毒效价为1.44×106U/mL,昆虫细胞裂解液的抗病毒效价为4.76×105U/mL。以重组ChIFN-λ进行对新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV)的抗病毒活性试验,发现重组ChIFN-λ对NDV和AIV有明显的抑制其致细胞病变作用,在CEK细胞上的抗病毒效果分别为1.82×106U/mL和1.94×106U/mL。综上所述,本研究成功克隆出ChIFN-λ全基因,利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达了具有分泌能力的重组ChIFN-λ,表达产物对VSV、AIV和NDV具有显著的抗病毒效果。本研究说明重组ChIFN-λ具有良好的应用前景,为体外大量制备高效廉价的重组ChIFN-λ奠定了基础。

关键词：鸡λ干扰素杆状病毒表达抗病毒作用

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鸡IFN-λ的原核表达及其生物学活性研究

鸡IFN-λ的原核表达及其生物学活性研究

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作者：丁诗月华南农业大学

学位级别：硕士

干扰素(interferon,IFN)是一种在特定诱导剂作用下,宿主细胞产生的一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤及增强免疫功能的本质为分泌性多功能糖蛋白的细胞因子。1957年在英国科学家Isaacs研究病毒间相互作用时首次被发现,由病毒诱导产生,干扰病... 详细信息

干扰素(interferon,IFN)是一种在特定诱导剂作用下,宿主细胞产生的一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤及增强免疫功能的本质为分泌性多功能糖蛋白的细胞因子。1957年在英国科学家Isaacs研究病毒间相互作用时首次被发现,由病毒诱导产生,干扰病毒复制,限制病毒感染。根据干扰素来源,氨基酸序列及生物活性不同,干扰素被分为三大类,分别为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型干扰素,Ⅲ型干扰素主要为λ干扰素。针对人λ干扰素的研究日益增多,但对鸡λ干扰素(Chicken interferon lambda,Ch IFN-λ)的研究尚浅,对Ch IFN-λ与其他干扰素的联合抗病毒作用机制尚不清楚,因此,本研究对Ch IFN-λ进行原核表达,探究其生物学活性;同时,将Ch IFN-λ与鸡α干扰素(Chicken interferon alpha,Ch IFN-α)融合表达,探索Ch IFN-λ与Ch IFN-α(Ch IFN-λ+α)的融合生物学活性。具体的研究有以下几个方面:根据Gen Bank提供的基因序列,分别设计出用以扩增Ch IFN-λ与Ch IFN-α的2对引物,最终,扩增出大小约为492 bp的去信号肽Ch IFN-λ目的基因及大小约为489 bp的去信号肽Ch IFN-α目的基因;使用重叠延伸PCR方法将Ch IFN-λ与Ch IFN-α基因融合,扩增出大小约为1023bp的Ch IFN-λ+α目的基因。最后,利用p ET-32a构建出Ch IFN-λ与Ch IFN-λ+α原核表达载体。将原核表达的重组质粒在BL21感受态细胞中诱导表达,结果显示,蛋白均以不溶性包涵体形式存在,经超声破碎、变性、复性和Ni柱纯化后,获得较高生物学活性的重组干扰素,经Western-Bolt鉴定Ch IFN-λ蛋白大小约为37.2 k D、Ch IFN-λ+α蛋白大小约为56.9 k D。在体外试验中,Ch IFN-λ与Ch IFN-λ+α在鸡胚成纤维细胞DF-1中均能良好的抑制水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)与禽流感病毒(Avian influenza viruses,AIV);此外,Ch IFN-λ+α能良好的抑制新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)。Ch IFN-λ体外DF-1细胞上抗VSV、NDV和AIV的抗病毒活性分别为:5.3×104 IU/mg、0和7.8×103 IU/mg;Ch IFN-λ+α体外DF-1细胞上抗VSV、NDV、AIV的抗病毒活性分别为:3.2×104 IU/mg、4.6×104 IU/mg和1.5×105IU/mg。其中,融合蛋白的抗病毒活性高于Ch IFN-λ。在体内试验中,Ch IFN-λ与Ch IFN-λ+α对感染新城疫的SPF鸡均具有一定程度的保护作用,能有效推迟发病时间与减少排毒。其中,Ch IFN-λ与攻毒对照组相比,排毒量减少,且推迟4 d开始排毒,保护率可达33%;Ch IFN-λ+α与攻毒对照组相比,排毒量减少,且推迟3 d开始排毒,保护率可达25%。在鸡胚试验中,Ch IFN-λ与Ch IFN-λ+α均能提供良好的保护作用,保护时间长达36小时,有效抑制病毒繁殖。在Ch IFN-λ与Ch IFN-λ+α作为鸡新城疫La Sota疫苗的免疫佐剂试验中,与疫苗对照组相比,有效保护期内提高抗体滴度速度快,提高抗体滴度,可达1:211以上,疫苗联合免疫佐剂抗病毒活性好。所以,重组干扰素作为疫苗佐剂可提高La Sota疫苗免疫作用。本研究通过扩增出Ch IFN-λ与Ch IFN-λ+α基因并对其原核表达,将纯化后的重组干扰素进行生物学活性研究。研究发现Ch IFN-λ与Ch IFN-λ+α具有良好的抗病毒活性,作为疫苗佐剂有良好的免疫增强作用,为临床研究干扰素生物学活性研究提供理论基础。

关键词：鸡λ干扰素鸡α干扰素免疫佐剂抗病毒活性新城疫

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