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鳖甲水提物对人大细胞肺癌H460细胞的抑制作用研究

鳖甲水提物对人大细胞肺癌H460细胞的抑制作用研究

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作者：柳金可阜阳师范大学

学位级别：硕士

为探讨鳖甲水提物(TS)对人大细胞肺癌(LCLC)H460细胞株的影响作用,本研究选择了H460和BEAS-2B(人正常肺部上皮细胞)细胞株进行体外细胞学实验,选择具有胸腺免疫缺陷特性的BALB/c裸雄鼠进行动物荷瘤实验,并利用网络药理学来筛选鳖甲已知... 详细信息

为探讨鳖甲水提物(TS)对人大细胞肺癌(LCLC)H460细胞株的影响作用,本研究选择了H460和BEAS-2B(人正常肺部上皮细胞)细胞株进行体外细胞学实验,选择具有胸腺免疫缺陷特性的BALB/c裸雄鼠进行动物荷瘤实验,并利用网络药理学来筛选鳖甲已知成分作用于LCLC的相关靶点,同时对TS处理后的H460细胞株进行mRNA转录组测序,寻找TS可能发生作用的相关通路。1.体外研究TS对H460细胞株增殖、形态、迁移、侵袭以及凋亡的影响:选用H460和BEAS-2B细胞株进行MTT实验,来检测TS处理细胞后的细胞活性,得出TS对H460细胞株的生长抑制作用,结合TS对BEAS-2B细胞株的毒理作用,进而选择出合适的给药浓度;进行平板克隆实验,六孔板每孔加入1×10个细胞,培养两周后固定染色,观察细胞成团状态,进一步确定TS对H460细胞株的增殖抑制作用;配制1.5×10个/mL的H460细胞悬浮液,接种在24孔培养板之中,按照24 h、48 h的时间段来观察不同浓度TS对H460细胞形态的影响;将2×10个/mL的H460细胞液接种于12孔培养板中,细胞长满后于中间划痕,同一位置进行拍照,检测不同浓度的TS处理24 h、48 h后H460细胞划痕的愈合速度;将细胞接种在Transwell小室内,TS处理48 h后进行固定染色,观察聚碳酸酯膜下的细胞数量,从而检测细胞侵袭方面的变化;选择一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光),观察药物处理后细胞的荧光强度,从而检测不同时间段下TS对细胞凋亡的影响。2.体内实验验证TS对H460细胞的影响:将细胞悬液皮下注射到实验用鼠腋下,构建荷瘤小鼠模型,肿瘤长到合适大小(100-120 mm)后,进行分组:空白对照(CK)组、阳性药物(5-Fu)组、鳖甲水提物(TS)组。分组完毕后进行灌胃:CK组灌胃生理盐水,5-Fu以25 mg/kg(药物量/小鼠体重)的浓度进行灌胃,TS组以9 g/kg(生药量/小鼠体重)的浓度进行灌胃,每天每只鼠灌胃0.1 mL,间隔两天测量一次肿瘤体积并对荷瘤小鼠进行称重,周期15天。将CK组、TS组、5-Fu组肿瘤大小进行对照处理,并将所得肿瘤组织进行石蜡包埋切片,对其进行HE染色以及免疫组化分析。3.通过文献及结合Chemsrc、SwissADME等多种数据库对TS已知成分和相应靶点进行搜索,并利用NCBI基因数据库筛选LCLC相关基因;进行蛋白质互作(PPI)分析,并构建鳖甲“成分-靶点-疾病”网络,预测TS作用于LCLC的相关机制。对H460细胞株进行药物处理,提取mRNA,进行转录组测序,获得各组差异基因并对其进行基因本体(GO)富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析,找到TS可能发生作用的相关通路。MTT、集落形成结果显示,随着TS浓度的提高,对H460细胞株的抑制作用逐渐增强,但对正常细胞的影响较小;TS处理24 h、48 h后,细胞形状随着时间和TS浓度的增加,开始发生变化,相比于CK组,TS组细胞数明显变少;随着TS浓度的提高,划痕愈合率逐渐减小,穿透聚碳酸酯膜的侵袭细胞数量逐渐减少;倒置荧光显微镜下显示CK组绿色荧光几乎没有,随着药物浓度的升高荧光强度就越强烈,其凋亡程度越高。荷瘤小鼠取材后,CK组肿瘤平均值达到了1857.17 mm,5-Fu组平均值达到1352.73 mm,TS组平均值达到了1200.54mm。由HE染色结果可知,鳖甲水提物组细胞核染色较浅且核有缩小和破碎现象,说明其能对肿瘤组织带来杀伤作用。免疫组化实验分析表明:TS组Ki67的表达量有所降低,E-钙粘蛋白的表达量有所增加。通过NCBI等多个数据库的检索,找到LCLC1857个基因,将搜索到的TS有效成分映射其中,发现其有21个交集位点;PPI分析可知TS作用于雌激素受体(ESR1)基因、表皮生长因子受体(EGFR)基因等靶点,预测TS是可以对LCLC产生作用的。为了解TS对H460细胞产生作用的具体机制,进行m RNA转录组测序。GO数据表明,TS与CK组差异基因主要侧重于蛋白激酶结合方面;KEGG通路分析表明,两组差异基因主要集中在糖胺聚糖生物合成-硫酸软骨素/硫酸皮素、类固醇生物合成、嘧啶代谢、铁死亡等靶点通路上,同时结合CK、5-Fu、TS三组的差异基因,从而推断TS发挥作用的相关通路。以上研究结果表明:TS可通过抑制细胞的增殖、降低H460细胞的迁移和侵袭潜能以及促进细胞发生凋亡来发挥对人大细胞肺癌H460细胞株的抑制作用。荷瘤小鼠实验表明,TS能有效抑制BALB/c裸鼠体内肿瘤的生长,并结合测序结果来预测其发挥作用的通路。以期为治疗LCLC的药物研发,提供进一步的实验参考数据。

关键词：人大细胞肺癌鳖甲水提物网络药理学转录组测序

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