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雪胆素甲生物合成相关基因克隆及体外功能研究

雪胆素甲生物合成相关基因克隆及体外功能研究

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作者：曾悦西南大学

学位级别：硕士

雪胆素甲(CucurbitacinⅡa)主要存在于葫芦科雪胆属植物的块茎中,是一种四环三萜类化合物,具有抗炎、体外抗HIV、抗肿瘤等药理活性,同时有着抗菌效价高,无耐药性的优点,具有良好的临床应用前景。但因雪胆生长周期长导致其药用资源紧缺... 详细信息

雪胆素甲(CucurbitacinⅡa)主要存在于葫芦科雪胆属植物的块茎中,是一种四环三萜类化合物,具有抗炎、体外抗HIV、抗肿瘤等药理活性,同时有着抗菌效价高,无耐药性的优点,具有良好的临床应用前景。但因雪胆生长周期长导致其药用资源紧缺、雪胆素甲含量较低、化学合成困难等因素制约着雪胆素甲的开发与应用,亟需寻找一种获取雪胆素甲成分的方法,合成生物学技术则提供一条新思路。葫芦科四环三萜类化合物的生物合成途径现已在多种药用植物中得到广泛研究与开发,但雪胆中雪胆素甲的生物合成途径仍未被完全解析,尤其是雪胆中催化生成重要中间前体的角鲨烯环氧化酶(Squalene epoxidase,SE),以及完成进一步催化修饰的鲨烯环化酶(Recombinant oxidosqualene cyclase,OSC)中环阿屯醇合酶(Cycloartenol synthase,CAS)以及β-香树脂醇合酶(Beta-amyrin synthase,β-AS)未见研究。因此,深入研究雪胆素甲生物合成相关酶基因,为完整解析并构建雪胆素甲生物合成途径奠定基础,同时为最终实现合成生物学生产雪胆素甲,进而缓解雪胆药材资源紧缺问题提供依据。本论文以雪胆属罗锅底(Hemsleya macrosperma *** ex *** et ***)为实验材料,通过比较转录组测序结果筛选出雪胆素甲生物合成通路的候选基因,并对重要的功能基因如SE、OSC、CYP450羟化酶、乙酰基转移酶(Acetyltransferase,AT)基因进行了基因克隆;利用生物信息学分析各个基因编码氨基酸的组成、结构域、二级和三级结构等蛋白质性质;最后分别采用大肠杆菌以及酿酒酵母两种异源表达系统研究基因的催化功能。研究结果如下:1.基于雪胆转录组数据库,利用基因功能注释以及同源序列比对等方法,从雪胆本地基因组数据库中筛选得到56个可能与雪胆素甲合成有关的功能基因;其中10个基因参与雪胆素甲生物合成的中下游路径,SE基因有3个HmSE1、HmSE2、HmSE3;1个葫芦二烯醇合酶(Cucurbitadienol synthase,CS)基因HmCS;1个HmCAS基因;1个Hmβ-AS基因;3个CYP450酶基因,分别是HmCYP87、HmCYP81、HmCYP705;1个HmAT基因。基于各基因在雪胆植物不同组织中的相对表达量,选择雪胆块茎RNA反转录的c DNA为模板,成功克隆了除HmCS外的9个基因。2.生物信息学分析结果显示HmSE的3个基因编码的蛋白为疏水性蛋白,其余为亲水性蛋白;HmSE1、HmCYP705、HmAT编码相对稳定的蛋白。预测的三级结构显示所有蛋白均以α-螺旋和无规则卷曲为主,与二级结构预测结果较为一致。根据稀有密码子比例,HmSE1、HmAT蛋白原核表达选择大肠杆菌BL21(DE3),或是所有基因均采用Transetta(DE3)大肠杆菌感受态。HmCAS、Hmβ-AS、HmAT蛋白无跨膜结构,均为位于细胞表面的膜外蛋白,其余蛋白均有跨膜结构。系统发育树结果表明HmSE1、HmSE2等10个基因分别与其他葫芦科植物的相应功能基因聚为一类。3.通过无缝克隆构建原核表达载体p ET-32a(+)-HmSE1,成功在Transetta(DE3)宿主菌中诱导表达,诱导条件为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)终浓度为0.5-1.0 m M,37℃条件下培养4 h。重组蛋白分子量为76.74 k Da。加入底物角鲨烯进行体外酶促,产物用GC-MS分析,结果显示HmSE1蛋白能够催化角鲨烯合成2,3-氧化鲨烯。4.采用无缝克隆构建了HmSE1、HmSE2、HmSE3、HmCAS、Hmβ-AS、HmCYP87、HmAT基因的真核表达载体p ESC-TRP-目的基因,将其转化至酿酒酵母WATⅡ菌株,用2%半乳糖诱导目的蛋白表达,直接加入底物或是利用酿酒酵母内源底物2,3-氧化鲨烯成分进行体外酶促,最后纯化产物用GC-MS或LC-MS检测。结果显示,检测的HmSE1、HmSE2、HmSE3体外酶促产物与酿酒酵母自身内源途径生成的2,3-氧化鲨烯相同,产物检测受到影响,因而选择原核表达的方法;HmCAS催化合成麦角甾醇的产量提高约2倍,说明HmCAS蛋白具有催化2,3-氧化鲨烯合成环阿屯醇的功能,在酿酒酵母中环阿屯醇会进一步生成麦角甾醇;Hmβ-AS蛋白催化的新产物与预期不相符,推测其在酿酒酵母中不具有催化2,3-氧化鲨烯生成β-香树脂醇的活性;HmCYP87蛋白催化的新产物难以确定为葫芦二烯醇羟化物,还需进一步扩大培养体系,纯化产物后用核磁共振进行结构鉴定;HmAT蛋白在酿酒酵母中具有催化雪胆素乙生成雪

关键词：雪胆雪胆素甲生物合成途径角鲨烯环氧化酶鲨烯环化酶

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