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食品与发酵工业 2023年第24期49卷 125-131页

作者：徐小烽李树红钱邓帆郭淇羽李冉李龙飞岑永好段志豪韩学艳米辰四川农业大学食品学院四川雅安625014

cystatins是一类天然抗菌蛋白,广泛分布于鱼类加工废弃组织。采用滤纸片扩散法和二倍稀释法,评价了鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)重组cystatin c(Hmcystatin c)对6株常见的水产品腐败菌的抑菌活性;并以铜绿假单胞菌和腐生葡萄球菌... 详细信息

cystatins是一类天然抗菌蛋白,广泛分布于鱼类加工废弃组织。采用滤纸片扩散法和二倍稀释法,评价了鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)重组cystatin c(Hmcystatin c)对6株常见的水产品腐败菌的抑菌活性;并以铜绿假单胞菌和腐生葡萄球菌为典型受试菌,测定Hmcystatin c与菌体及其细胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)和肽聚糖(peptidoglycan,PGN)的结合情况,及对受试菌生长曲线、细胞壁、细胞质膜通透性的影响,初步探讨其抑菌机制。结果表明,Hmcystatin c对除枯草芽孢杆菌外的5株腐败菌均具抑制作用,对典型受试菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIc)及最低杀菌浓度(minimal bactericide concentration,MBc)均为3.5 mg/mL;Hmcystatin c能与典型受试菌结合,并且对LPS和PGN表现出亲和性。此外典型受试菌的细胞壁和细胞质膜被破坏,胞内物质渗出。因此推测Hmcystatin c可能首先吸附到菌体表面并与细胞壁成分结合,进而破坏细胞完整性,导致内容物外泄后菌体死亡。该结果为阐明鱼类cystatins抑菌机制奠定实验基础,也为综合利用鱼源cystatins提供理论参考。

关键词：鲢鱼重组cystatin c 抗菌蛋白水产品腐败菌抑菌活性抑菌机理

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鲢鱼重组cystatin c及其酶解物的抑菌活性和机制研究

鲢鱼重组cystatin C及其酶解物的抑菌活性和机制研究

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作者：徐小烽四川农业大学

学位级别：硕士

半胱氨酸蛋白酶抑制因子(cysteine proteinase inhibitors,cPIs)广泛分布于鱼类各组织,而在水产品加工中,脏器、鱼皮、碎肉等常作为下脚料或废弃物被丢弃。研究发现陆生动植物源的cPIs超家族成员cystatins(家族Ⅱ)具有潜在的抑菌活性。... 详细信息

半胱氨酸蛋白酶抑制因子(cysteine proteinase inhibitors,cPIs)广泛分布于鱼类各组织,而在水产品加工中,脏器、鱼皮、碎肉等常作为下脚料或废弃物被丢弃。研究发现陆生动植物源的cPIs超家族成员cystatins(家族Ⅱ)具有潜在的抑菌活性。为此,本文对比研究了鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)重组cystatin c(Hmcystatin c)及以其制备的酶解物,对水产品中9株常见腐败菌的抑菌活性。并将G铜绿假单胞菌和G腐生葡萄球菌,G草莓假单胞菌和G枯草芽孢杆菌分别作为Hmcystatin c及其酶解物的典型受试菌,从与菌体表面作用、破坏细胞完整性、影响胞内蛋白质合成和受试菌的半胱氨酸蛋白酶活性的角度,探究了其可能的抑菌机制。该结果为阐明鱼源cystatins抑菌活性及潜在机制奠定实验基础,也为综合利用鱼源cystatins开发高效的水产品天然防腐剂提供理论参考。研究结果如下:(1)Hmcystatin c酶解物的制备以铜绿假单胞菌和草莓假单胞菌的抑菌圈直径(Diameter of inhibition zone,DIZ)为指标,对蛋白酶的种类和酶解条件进行单因素试验筛选,结果表明:以碱性蛋白酶作为酶源,当酶:Hmcystatin c(w/w)为1:3,酶解6 h制得的产物抗菌活性最强。酶解物分子量主要分布在14.4和3.3 KDa左右,在3.18 KDa处呈现一条高浓度条带。(2)Hmcystatin c及其酶解物的抑菌活性Hmcystatin c对革兰氏阴性菌(G),即腐败希瓦氏菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、中间气单胞菌、草莓假单胞菌,以及革兰氏阳性菌(G)腐生葡萄球菌有抑菌效果,其DIZ与Hmcystatin c浓度呈正相关。铜绿假单胞菌、中间气单胞菌、腐生葡萄球菌对Hmcystatin c最敏感,最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIc)和最低杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBc)均为3.5 mg/m L。在3/4×MIc的Hmcystatin c作用下,其典型受试菌存活率仅在15%左右。生长曲线监测表明,在1×MIc下典型受试菌的生长均极显著(Pcystatin c酶解后部分抑菌谱发生改变,对腐败希瓦氏菌、腐生葡萄球菌失去抑制作用,但对完整蛋白不能抑制的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌呈现抑制效果;酶解物对草莓假单胞菌抑制活性明显增强,对金黄色葡萄球菌仍无抑制活性;铜绿假单胞菌和中间气单胞菌对酶解前后的Hmcystatin c敏感性相同。3/4×MIc的Hmcystatin c酶解物作用下,其典型受试菌存活率分别为15.36%和23.98%;且在1×MIc浓度下受试菌生长曲线均极显著(Pcystatin c及其酶解物的抑菌机制Western blot和ELISA分析表明,Hmcystatin c能与G和G典型受试菌表面结合,是Hmcystatin c发挥抑菌作用的前提。此外,Hmcystatin c及其酶解物增加了典型受试菌的表面电负性和疏水性,促使受试菌凝聚沉积。在Hmcystatin c或酶解物的作用下,外源的N-苯基-1-萘胺(NPN)进入细菌,且壁膜间的碱性磷酸酶(AKP)渗出,说明细胞壁被破坏。而典型受试菌菌悬液的电导率、OD、OD、OD值均升高,表明胞内的电解质、核酸、蛋白质和β-半乳糖苷酶泄露,细胞膜破损。扫描电镜亦观察到受试菌形态明显变化,菌体细胞表面出现凹陷、破损,内容物溢出。SDS-PAGE检测Hmcystatin c及其酶解物对胞内蛋白质合成的影响,实验组中典型受试菌蛋白图谱均有变化,尤其草莓假单胞菌约66 KDa和45 KDa处蛋白明显减少,蛋白合成受阻。通过测定Hmcystatin c及其酶解物对典型受试菌半胱氨酸蛋白酶的体外抑制活性,发现两种抗菌物质在相同的浓度(0.005 mg/m L)下,仅Hmcystatin c对4种受试菌的半胱氨酸蛋白酶体现58%-77%抑制活性,而酶解物浓度需达到700倍,才对4株典型受试菌的半胱氨酸蛋白酶体现相似的抑制活性,说明酶解物中的部分组分保留了Hmcystatin c抑制活性中心。综上说明Hmcystatin c及其酶解物抑制细菌生长,是通过作用于细菌的多个靶点,协同发挥抑菌作用。

关键词：鲢鱼重组cystatin c 碱性蛋白酶酶解物腐败菌抑菌活性抑菌机制

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