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鱼腥藻pcc7120细胞液泡的初步研究

水生生物学报 1999年第4期23卷 363-367页

作者：郭厚良金传荫浦秋文宋文贞周云珍杨清平武汉大学生命科学学院武汉430072 中国科学院水生生物研究所武汉430072

从保存３个月以上的老化培养物中直接检查到游离液泡。液泡为标准圆球状，完全透明，大小相差极为悬殊，多数大型液泡吞噬了数个衰老藻细胞。采用低渗酶解，渗透冲击，低渗酶解和渗透冲击相结合，从培养３个月以上，２个月，１个月，１... 详细信息

从保存３个月以上的老化培养物中直接检查到游离液泡。液泡为标准圆球状，完全透明，大小相差极为悬殊，多数大型液泡吞噬了数个衰老藻细胞。采用低渗酶解，渗透冲击，低渗酶解和渗透冲击相结合，从培养３个月以上，２个月，１个月，１８ｄ，１０ｄ及３ｄ的藻丝细胞都分离到液泡。液泡略大于细胞，泡内无吞噬物。培养３ｄ的藻丝有１５％的细胞分离到液泡。其他多种蓝藻也分离到同样的液泡。

关键词：鱼腥藻pcc7120 液泡低渗酶解蓝藻细胞

鱼腥藻pcc7120染色体基因对asr0757/alr0758的表达优化及其鉴定

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华中师范大学学报（自然科学版） 2016年第2期50卷 263-268页

作者：陈洁陈思礼吴汇兰中南民族大学生命科学学院武汉430074

NCBI预测鱼腥藻pcc7120染色体上的基因对asr0757/alr0758可能构成一个毒素-抗毒素系统.为研究其是否属于毒素-抗毒素系统家族,分别构建这两个基因的表达载体.用1.0 mM IPTG诱导重组菌表达,优化表达条件,并对表达出的蛋白进行纯化与weste... 详细信息

NCBI预测鱼腥藻pcc7120染色体上的基因对asr0757/alr0758可能构成一个毒素-抗毒素系统.为研究其是否属于毒素-抗毒素系统家族,分别构建这两个基因的表达载体.用1.0 mM IPTG诱导重组菌表达,优化表达条件,并对表达出的蛋白进行纯化与western blot检测.SDSPAGE结果显示:asr0757与alr0758在37℃下诱导6h后,均成功诱导表达出目的蛋白asr0757(13.5KD)和alr0758(17.9KD).抗毒素表达量较好,毒素alr0758表达量较少.通过设置诱导时间梯度和IPTG浓度梯度优化毒素基因表达条件,优化结果显示:毒素基因alr0758在28℃,IPTG浓度为0.4mM,诱导10h时有最大表达量.蛋白纯化与western blot结果证实诱导表达的蛋白为目的蛋白.

关键词：鱼腥藻pcc7120 asr0757/alr0758 表达优化鉴定

鱼腥藻pcc7120染色体MazEF同源基因对asr0757/alr0758的初步研究

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中南民族大学学报（自然科学版） 2016年第1期35卷 29-33,54页

作者：陈思礼陈洁吴汇兰中南民族大学生命科学学院武汉430074

鱼腥藻pcc7120染色体上的基因对asr0757/alr0758,经NCBI比对显示其与大肠杆菌中的毒素-抗毒素基因Maz EF具有较高的同源性,且具有毒素-抗毒素系统基因的保守遗传结构,为研究其是否属于Maz EF家族系统基因,构建同时含有asr0757和alr0758... 详细信息

鱼腥藻pcc7120染色体上的基因对asr0757/alr0758,经NCBI比对显示其与大肠杆菌中的毒素-抗毒素基因Maz EF具有较高的同源性,且具有毒素-抗毒素系统基因的保守遗传结构,为研究其是否属于Maz EF家族系统基因,构建同时含有asr0757和alr0758基因的双启动子选择性表达载体,先选择性诱导了该基因对的表达,再验证了其表达产物对细菌生长的影响.结果显示:成功诱导表达出了目的蛋白asr0757(13.5KD)和alr0758(17.5KD),当单独诱导asr0757基因表达时,细菌生长状况不受影响,单独诱导alr0758表达时细菌生长明显受到抑制,同时诱导asr0757和alr0758基因时细菌生长恢复正常,说明asr0757/alr0758构成具有生物功能的Maz EF家族系统基因对,具有毒性与抗毒性功能.

关键词：鱼腥藻pcc7120 毒素-抗毒素系统 MazEF asr0757/alr0758

鱼腥藻pcc7120质粒上毒素-抗毒素基因对alr9029/asr9028的初步研究

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中南民族大学学报（自然科学版） 2016年第2期35卷 26-30页

作者：陈思礼吴汇兰陈洁中南民族大学生命科学学院武汉430074

指出了大肠杆菌的毒素-抗毒素系统(TAs)能介导解离后致死机制维持细菌质粒的稳定性和参与环境胁迫诱导细菌生长抑制或死亡,在鱼腥藻pcc7120质粒上的基因对alr9029/asr9028具有与TA系统较高的同源性.为了证实该基因对属于TA系统,通过生... 详细信息

指出了大肠杆菌的毒素-抗毒素系统(TAs)能介导解离后致死机制维持细菌质粒的稳定性和参与环境胁迫诱导细菌生长抑制或死亡,在鱼腥藻pcc7120质粒上的基因对alr9029/asr9028具有与TA系统较高的同源性.为了证实该基因对属于TA系统,通过生物信息学分析了alr9029/asr9028的遗传结构,设计特异性引物,扩增得到大小为198 bp的asr9028和387 bp的***产物经Bam H I和HindШ双酶切后被插入p MD18-T和p ET-30a中,依次构建克隆载体和表达载体.经SDS-PAGE电泳检测,含有His6标签的表达蛋白相对分子量分别为12.4k Da和19.2 k Da,且为可溶性蛋白.故初步认定asr9028为抗毒素基因,alr9029为毒素基因,二者共同构成一个TA系统.

关键词：鱼腥藻pcc7120 TA系统 alr9029 asr9028

鱼腥藻pcc7120生物转化体系的初步构建及对三种中药有效成分的转化研究

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鱼腥藻PCC7120生物转化体系的初步构建及对三种中药有效成分的转...

作者：段玉龙北京中医药大学

学位级别：硕士

本课题通过鱼腥藻pcc7120对中药有效成分进行生物转化研究,旨在探讨鱼腥藻pcc7120的生物转化能力及转化特点,为蓝藻生物转化体系的建立提供依据。首先建立稳定的鱼腥藻pcc7120培养体系,包括蓝藻的分离纯化、液体及固体培养、藻种的保藏... 详细信息

本课题通过鱼腥藻pcc7120对中药有效成分进行生物转化研究,旨在探讨鱼腥藻pcc7120的生物转化能力及转化特点,为蓝藻生物转化体系的建立提供依据。首先建立稳定的鱼腥藻pcc7120培养体系,包括蓝藻的分离纯化、液体及固体培养、藻种的保藏、测定生长曲线等。待蓝藻纯化并规模培养后,考察比较两种蓝藻破碎方法,即反复冻融法和超声破碎法,结果表明反复冻融法可以大规模制备样品,适于本实验需要。通过研究不同浓度的常用有机溶剂对蓝藻细胞毒,保证让转化底物充分溶解的前提下使有机溶剂对藻的毒害作用最低。本课题选择鱼腥藻pcc7120体系对芦丁、薯蓣皂苷和山奈酚苷进行生物转化研究。芦丁经分离纯化,并利用薄层色谱法和高效液相色谱法检测的芦丁纯度在98%以上。对芦丁进行生物转化研究,发现芦丁在pH=7.2的BG11+N中稳定性差,在24h之内降解率达到50%;当在pH=5.5时,芦丁可以稳定存在,且没有检测到转化产物。薯蓣皂苷和山奈酚苷的转化液经薄层检识后没有新的斑点出现,表明鱼腥藻pcc 7120对这两种化合物无明显转化,需做进一步研究探讨。

关键词：生物转化鱼腥藻pcc7120 芦丁薯蓣皂苷山奈酚-7-O-L-鼠李糖-3-O-D-葡糖糖苷

鱼腥藻pcc7120毒素—抗毒素基因all7155/asl7156的初步研究

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鱼腥藻PCC7120毒素—抗毒素基因all7155/asl7156的初步研究

作者：张磊中南民族大学

学位级别：硕士

最早发现的毒素-抗毒素系统是在大肠杆菌中,多数存在于染色体上,也有少数存在于细菌的低拷贝质粒上。通过深入研究其相互作用的机理,发现毒素-抗毒素基因通常是成对出现,常常是由一个编码毒素蛋白的毒素基因,和一个编码解毒蛋白的抗毒... 详细信息

最早发现的毒素-抗毒素系统是在大肠杆菌中,多数存在于染色体上,也有少数存在于细菌的低拷贝质粒上。通过深入研究其相互作用的机理,发现毒素-抗毒素基因通常是成对出现,常常是由一个编码毒素蛋白的毒素基因,和一个编码解毒蛋白的抗毒素基因构成。毒素基因对于宿主菌所起的作用主要是在一些不利于生长的外界环境因素影响下对部分细菌产生过隔离杀灭,介导细菌的程序性死亡,或者在细菌体内的毒素因子被激活时介导毒素蛋白的产生而使菌体死亡。本实验的实验对象是鱼腥藻pcc7120的α质粒上的一对基因all7155/asl7156。它们在TADB中的描述为与毒素-抗毒素系统parD/E具有同源性,根据细菌染色体上TA系统基因的遗传结构特征,通过在NCBI中对其基因序列、编码产物的BLAST比对,以及蛋白理化和结构域等二级结构预测,初步确定all7155/asl7156为parD/E毒素-抗毒素系统同源基因。在生物信息学分析的理论基础上,运用分子生物学的实验方法,根据目的基因设计引物,并添加特异性的酶切位点,以pMD18-T作为克隆载体,利用蓝白斑筛选出阳性单克隆菌落,并且送检测序以保证重组克隆载体没有发生碱基的缺失和突变。以pET-30a(+)为表达载体,构建重组表达质粒pET-30a-7155和pET-30a-7156,在大肠杆菌中利用IPTG诱导表达,并对蛋白表达的条件进行优化,结果表明:IPTG诱导基因all7155/asl7156在大肠杆菌BL21中的最佳诱导表达条件为IPTG浓度0.8 mM、诱导时间为8 h。因重组表达载体带有HIS标签,所以可以使用NI柱对含有HIS标签的融合蛋白进行纯化和Western-blot实验,结果表明NI柱对HIS标签融合蛋白具有一定的纯化效果。目前在毒素-抗毒素系统的研究中,对于II型毒素-抗毒素系统的研究较多,其中对mazE/F和relB/E家族研究比较深入,而对于其他的毒素抗毒素系统,特别是质粒上的毒素抗毒素系统研究较少,本实验对于进一步完善parD/E毒素-抗毒素系统和细菌质粒上的毒素-抗毒素系统的研究具有一定的意义。

关键词：鱼腥藻pcc7120 毒素-抗毒素系统 parD/E 组氨酸标签

鱼腥藻pcc7120染色体毒素—抗毒系统基因all2402/asl2401的研究

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鱼腥藻PCC7120染色体毒素—抗毒系统基因all2402/asl2401的研究

作者：刘炳君中南民族大学

学位级别：硕士

毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system,TAS)由两个共同表达的基因组成,其中一个编码不稳定的毒素蛋白,另外一个编码稳定的毒素蛋白。TA系统通过共同表达的基因产物的相互作用参与介导胁迫环境下的细胞生长抑制或者死亡的生理活动。毒... 详细信息

毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system,TAS)由两个共同表达的基因组成,其中一个编码不稳定的毒素蛋白,另外一个编码稳定的毒素蛋白。TA系统通过共同表达的基因产物的相互作用参与介导胁迫环境下的细胞生长抑制或者死亡的生理活动。毒素-抗毒素系统广泛存在于原核生物中,通过生物信息学分析,在已测序的原核生物中发现了671个可能的毒素-抗毒素位点,隶属于7个经典的毒素-抗毒素基因家族,分别是:ccdAB,relBE,parDE,higBA,mazEF,phd/doc和vapBC/vag。目前研究较多的是relBE和mazEF家族,正常生长条件下,relBE和mazEF连续合成毒素和过量的抗毒素,通过形成异源六聚体抑制毒素蛋白的毒性作用,而当细胞遭遇外界胁迫时,蛋白酶降解抗毒素并释放复合体中的毒素,通过毒素蛋白特异性地切割mRNA来阻断蛋白质的合成,从而引起细菌的生长抑制。本实验通过构建双启动子表达载体对鱼腥藻pcc7120染色体上一对基因asl2401和all2402进行研究,通过控制单独和同时诱导表达来分析毒素蛋白和抗毒素蛋白对细胞生长的影响,进而确定其蛋白产物的毒素-抗毒素作用。主要包括以下几方面的内容及结论:1)通过生物信息学分析基因asl2401和all2402的序列,对其编码产物、蛋白性质和高级结构的预测,进而确定他们所属的毒素-抗毒素基因家族是higBA,目前对该家族的TA系统研究较少,毒素作用机理不明确,因此本实验的研究对丰富TA系统有一定的作用。2)将基因asl2401和all2402分别单独构建克隆载体和表达载体,对其诱导表达,经SDS-PAGE检测后,看到抗毒素基因asl2401很容易构建成功且能够高效诱导表达,而毒素基因all2402的表达载体却很难构建,极少数构建成功后诱导蛋白的表达量不高。将构建成功的表达载体保存一段时间后测序显示无结果,推测毒素基因表达出了毒素蛋白而使细胞死亡,导致实验无法继续下去,因此构建双启动子诱导表达载体,以验证推测是否正确,从而进行下一步实验,确定目的基因在鱼腥藻pcc7120体内生理调控功能。3)将毒素基因all2402置于PBAD启动子之下,抗毒素基因asl2401置于PLAC启动子构建双启动子诱导表达载体,经诱导表达后,分析蛋白产物对细胞的毒素和抗毒素作用:毒素基因all2402在L-(+)-阿拉伯糖的诱导下产生毒素蛋白,对细胞产生毒素作用;抗毒素基因asl2401在L-(+)-阿拉伯糖和IPTG同时诱导下表达出抗毒素蛋白,与毒素蛋白相互作用后从而解除毒素蛋白的毒性,从而确定目的基因在鱼腥藻pcc7120体内生理调控功能。4)TA系统作为原核细胞应对营养缺乏时的调控机制,是对细菌代谢调控的重要补充;且目前我国湖泊和水库因为藻类爆发而污染,期待蓝细菌染色体上TA系统的研究也能够为环境中除藻提供思路。

关键词：鱼腥藻pcc7120 双启动子表达毒素-抗毒素系统基因对asl2401/all2402

鱼腥藻pcc7120铁摄取调节基因alr0957的克隆、体外表达和功能的初步研究

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鱼腥藻PCC7120铁摄取调节基因alr0957的克隆、体外表达和功能的初...

作者：尤隽丹中南民族大学

学位级别：硕士

蓝藻是一类光合自养型浮游微生物，在合适的营养盐、温度和光照条件下即可大量繁殖，容易爆发赤潮或水华;另一方面，藻类做为可再生能源日益受到重视，在环境保护和资源开发领域有重要的研究价值。本实验以水华优势藻鱼腥藻Anabaena sp... 详细信息

蓝藻是一类光合自养型浮游微生物，在合适的营养盐、温度和光照条件下即可大量繁殖，容易爆发赤潮或水华;另一方面，藻类做为可再生能源日益受到重视，在环境保护和资源开发领域有重要的研究价值。本实验以水华优势藻鱼腥藻Anabaena sp. pcc7120为对象，研究铁元素对其生长状况的影响以及铁摄取调节基因alr0957(ferric uptake regulator，fur)的表达调控作用。首先依据CyanoBase数据库提供的鱼腥藻pcc7120fur C基因(alr0957)的序列信息设计特异性引物，用Touch-down PCR扩增得到大小约450bp的目的片段;T-A克隆得到pcc7120alr0957基因的完整片段，并构建表达载体pET-alr0957，转化原核表达宿主菌*** BL21(DE3)，IPTG诱导体外表达，检测出分子量大小约19kD的带有T7-tag和His-tag的融合蛋白pET-Fur。经过对IPTG浓度、表达时间和诱导温度的调整，结果表明，重组菌在37℃、0.8mmol/L IPTG浓度条件下诱导8小时表达量最佳。但目前重组蛋白在细胞破碎液上清中的量很少，蛋白的表达量也有待进一步提高，需要从引物序列设计上使用偏好密码子或改变SD序列长度上改进以增加表达效率。另一方面，通过设计不同Fe浓度对鱼腥藻pcc7120的生长影响实验，研究了藻细胞在生长过程中叶绿素、蛋白质和可溶性糖含量的变化规律。结果表明：低浓度Fe(藻生长起促进作用，表现在叶绿素含量和蛋白质含量随Fe浓度升高而增大;高浓度Fe(>0.9mg/L)抑制藻生长，表现在叶绿素含量和蛋白质含量随Fe浓度增加而明显下降;藻的生长状况表现在颜色上随Fe浓度的增加也发生了明显的变化，当Fe浓度增大到一定程度时，某些基因关闭表达，生长受到明显抑制作用;Fe浓度在0.5-0.9mg/L的范围内最适合藻类生长。该结果说明Fe浓度改变确实影响到藻细胞内正常的代谢途径，尤其是对参与光合作用的酶类产生了很大的影响，导致藻液的颜色产生了明显差异。选取其中长势有明显差异的3组Fe浓度(L:0mg/L、M:0.5mg/L、H:2.0mg/L)的藻液，用Trizol法提取总RNA以分析表达情况。与M组相比较，从H组(Fe浓度2.0mg/L)可清楚判断出23S rRNA、16S rRNA和5S rRNA的位置和条带亮度，只是在提取过程中有所降解;L组(缺铁)培养的藻生长近乎停滞，RNA呈弥散状，转录和翻译水平都很低，说明铁的缺失严重干扰了藻的重要生理代谢活动。目前对藻类铁代谢调控的研究主要集中在海洋藻，淡水藻类铁摄取基因的体外表达及突变体构建较少。本实验成功将fur基因在体外表达出带纯化标签的融合蛋白，为纯化及构建突变株奠定了良好的基础，有助于深入研究鱼腥藻pcc7120维持铁在细胞内稳态的趋利避害的调控机制。本实验的创新点还在于从微量元素铁的角度切入，分析Fe浓度对鱼腥藻生长、代谢以及基因表达的差异，确定Fe浓度在0.5-0.9mg/L的范围内最适合藻类生长，4.0mg/L的高浓度已超出藻细胞的承受范围。无论Fe元素缺乏还是过剩，都将导致代谢失衡，转录效率降低，某些蛋白表达量发生变化，生长停滞。

关键词：鱼腥藻pcc7120 铁摄取调节基因原核表达铁元素

鱼腥藻pcc7120基因all3211/asl3212和asl4561/asl4562的初步研究

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鱼腥藻PCC7120基因all3211/asl3212和asl4561/asl4562的初步研究

作者：梅菊中南民族大学

学位级别：硕士

毒素-抗毒素系统广泛存在于原核生物体内，通过系统中一对共表达的基因产物相互作用参与介导外界环境胁迫条件下细胞生长抑制或死亡的生理活动。目前，只是对于大肠杆菌染色体上毒素-抗毒素系统mazEF和relBE研究相对深入，仅有少量的实... 详细信息

毒素-抗毒素系统广泛存在于原核生物体内，通过系统中一对共表达的基因产物相互作用参与介导外界环境胁迫条件下细胞生长抑制或死亡的生理活动。目前，只是对于大肠杆菌染色体上毒素-抗毒素系统mazEF和relBE研究相对深入，仅有少量的实验报导进行蓝细菌染色体TA系统的研究。本实验是首次对鱼腥藻pcc7120体内的TA系统同源基因进行探索研究，在生物信息学理论分析的基础上，借助双启动子表达载体可单独和同时诱导表达的特性，分别控制预测的毒素基因和抗毒素基因表达，分析对细胞生长影响，从而鉴定出目的基因的毒素-抗毒素作用;并且通过基因敲除原理构建缺失突变株，确定目的基因在鱼腥藻pcc7120体内生理调节功能。主要包括以下几方面内容： 1)根据细菌染色体上TA系统基因的遗传结构特征，保守序列、编码产物同源性及蛋白等电点等理化性质预测和结构域等二级结构预测初步确定鱼腥藻pcc7120染色体上两对基因：all3211/asl3212为mazEF毒素-抗毒素系统同源基因，asl4561/asl4562为relBE毒素-抗毒素系统同源基因;2)构建双启动子诱导表达载体，分别将毒素基因all3211置于PBAD启动子之下、抗毒素基因asl3212置于Plac启动子之下，诱导表达，鉴定这对mazEF同源基因各自对大肠杆菌细胞的毒素-抗毒素作用：all3211基因在L-（+）-阿拉伯糖单独诱导下对大肠杆菌细胞产生毒性，当L-（+）-阿拉伯糖和IPTG同时诱导all3211/asl3212基因表达时，可解除all3211表达产物对对大肠杆菌细胞的毒性，证明all3211和asl3212构成一对毒素-抗毒素系统，all3211为毒素基因，asl3212为抗毒素基因;3)构建重组表达质粒pET28a-asl4561和pET28a-asl4562，在大肠杆菌中诱导asl4561和asl4562表达，鉴定这一对relBE同源基因的生理功能，并对asl4561-asl4562合基因蛋白表达条件进行优化，结果表明：IPTG诱导asl4561表达产物对大肠杆菌有抑制作用，说明asl4561编码蛋白产物作用于大肠杆菌生命调节系统，造成损害;两基因共表达时，对大肠杆菌毒性作用减少，说明两基因的表达产物发生相互作用，解除asl4561表达产物对大肠杆菌的毒性;asl4561-asl4562合基因最佳诱导表达条件为IPTG浓度0.8mM、Kan浓度100μg/mL、在接种后培养1-1.5h后加入诱导剂，28℃诱导6h;4)用Kan抗性片段代替all3211-asl3212或asl4561-asl4562基因对构建的all3211-asl3212或asl4561-asl4562基因缺失突变株，在常规培养条件下构建的鱼腥藻缺失突变株生长正常，没有显著影响细胞生理功能，为进一步深入确定这两对基因功能机理奠定基础;5)根据之前在大肠杆菌中实验结果，将毒素基因和合基因置于铜离子结合蛋白启动子PPetE之下，构建铜离子诱导表达载体，转化鱼腥藻pcc7120all3211-asl3212和asl4561-asl4562基因对缺失突变株，铜离子诱导all3211、asl4561表达产物对鱼腥藻pcc7120细胞具有毒性作用，当铜离子诱导all3211/asl3212、asl4561/asl4562共表达时，毒素蛋白对鱼腥藻pcc7120细胞的毒性作用被抑制。并且在不同铜离子浓度培养条件下，随着铜离子浓度加大，诱导毒素蛋白表达的突变株生长量相应减少，说明毒素蛋白导致大部分藻细胞死亡，一部分藻细胞生长受抑制。根据上述结果在鱼腥藻pcc7120体内all3211、asl4561基因为毒素基因，上游的asl3212、 asl4562基因为抗毒素基因，all3211/asl3212、asl4561/asl4562这两对基因各自构成鱼腥藻pcc7120染色体上毒素-抗毒素系统基因。

关键词：鱼腥藻pcc7120 染色体TA系统 all3211/asl3212 asl4561/asl4562