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鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌致肺气虚证大鼠β-防御素的影响

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时珍国医国药 2014年第11期25卷 2585-2587页

作者：段强军黄卫锋吴大强濮燕屏邵菁程惠娟安徽中医药大学中西医结合临床学院安徽合肥230038

目的探究鱼腥草素钠(Sodium Houttuyfonate:SH)对呼吸道被膜菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa:PA)致肺气虚证大鼠肺部β-防御素的影响。方法采用呼吸道被膜菌铜绿假单胞菌滴鼻法致大鼠呼吸道慢性感染,辅以寒冷疲劳刺激,诱发大鼠... 详细信息

目的探究鱼腥草素钠(Sodium Houttuyfonate:SH)对呼吸道被膜菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa:PA)致肺气虚证大鼠肺部β-防御素的影响。方法采用呼吸道被膜菌铜绿假单胞菌滴鼻法致大鼠呼吸道慢性感染,辅以寒冷疲劳刺激,诱发大鼠肺气虚证模型,用鱼腥草素钠干预,设不给药组为模型组和未感染大鼠作为正常对照组,8周后观察证候表现,镜下观察肺部组织病理改变,酶联免疫吸附法测定支气管灌洗液中β-防御素含量。结果模型组符合肺气虚证候表现。鱼腥草素钠组、阿奇霉素(azithromycin:AZM)阳性对照组及正常对照组均无明显的肺气虚症候表现。病理学检查显示,模型组的大鼠支气管粘膜有大量的脱落、炎症细胞浸润和肺气肿的发生,而药物治疗组及正常对照组无炎症反应,肺部支气管粘膜完好;模型组肺部灌洗液β-防御素含量明显增高,药物治疗组β-防御素增高不明显,两组相比差异显著(P0.05)。结论β-防御素增高可以加剧肺部损伤,在铜绿假单胞菌感染大鼠过程中,鱼腥草素钠使大鼠气道β-防御素维持在正常水平,是抑制气道病变以及炎症反应从而干预肺气虚证的发生的重要因素之一。

关键词：肺气虚证铜绿假单胞菌鱼腥草素钠 β-防御素

鱼腥草素钠对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺组织PI3K、AKT1及mTOR mRNA表达的影响

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中国实验动物学报 2018年第1期26卷 8-12页

作者：吴中华闫玲玲杨爱东张海英符胜光杨云翔上海中医药大学上海201203 上海市位育中学上海200231

目的观察鱼腥草素钠对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺组织中PI3K、AKT1及mTOR mRNA表达的影响,并探讨其作用机制。方法选取Wistar雄性大鼠24只,体重(220±20)g,随机分为正常组、模型组、地塞米松组和鱼腥草素钠组(每组6只)。采用烟熏和脂... 详细信息

目的观察鱼腥草素钠对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺组织中PI3K、AKT1及mTOR mRNA表达的影响,并探讨其作用机制。方法选取Wistar雄性大鼠24只,体重(220±20)g,随机分为正常组、模型组、地塞米松组和鱼腥草素钠组(每组6只)。采用烟熏和脂多糖气管滴注联合方法建立慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)大鼠模型,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测PI3K、AKT1及mTOR mRNA表达,并观察大鼠肺组织病理变化。结果与正常组相比,模型组大鼠肺组织PI3K、AKT1 mRNA表达显著增高(P鱼腥草素钠组和地塞米松组肺组织PI3K、AKT1 mRNA表达显著降低(P鱼腥草素钠组肺组织mTOR mRNA表达显著增高(P鱼腥草素钠组和地塞米松组肺组织病理改变明显轻于模型组,鱼腥草素钠组和地塞米松组肺组织呈轻度间质性肺炎,仅见少量的纤维组织增生。结论鱼腥草素钠能够减轻慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺组织损伤,其机制可能与其能够下调PI3K、AKT1 mRNA的表达、上调mTORmRNA表达有关。

关键词：鱼腥草素钠慢性阻塞性肺疾病磷脂酰肌醇3激酶丝氨酸苏氨酸蛋白激酶雷帕霉素靶蛋白大鼠

亚抑菌浓度鱼腥草素钠及与红霉素联合对表皮葡萄球菌生物被膜的作用

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中国中药杂志 2013年第5期38卷 731-735页

作者：官妍李春石晶金周华娜刘丽王艳濮燕萍安徽中医学院安徽合肥230038 蚌埠医学院安徽蚌埠233030

目的:观察亚抑菌浓度(亚-MIC)的鱼腥草素钠及与红霉素联用对表皮葡萄球菌生物被膜的影响。方法:连续稀释法测定鱼腥草素钠和红霉素对表皮葡萄球菌的MIC;棋盘格法测定鱼腥草素钠和红霉素联用对表皮葡萄球菌悬浮菌的作用;体外构建表皮葡... 详细信息

目的:观察亚抑菌浓度(亚-MIC)的鱼腥草素钠及与红霉素联用对表皮葡萄球菌生物被膜的影响。方法:连续稀释法测定鱼腥草素钠和红霉素对表皮葡萄球菌的MIC;棋盘格法测定鱼腥草素钠和红霉素联用对表皮葡萄球菌悬浮菌的作用;体外构建表皮葡萄球菌生物被膜,XTT递减法评价亚抑菌浓度的鱼腥草素钠及与红霉素联用对表皮葡萄球菌黏附及对生物被膜内细菌代谢的影响;扫描电镜观察亚抑菌浓度下2药单独及联合用药后对表皮葡萄球菌生物被膜形态的影响情况。结果:鱼腥草素钠、红霉素对表皮葡萄球菌的MIC分别为62.5,7.812 5 mg.L-1;1/8MIC鱼腥草素钠、1/2MIC红霉素联用对表皮葡萄球菌悬浮菌的作用为协同,亚抑菌浓度的鱼腥草素钠、红霉素以及二者联用对表皮葡萄球菌生物被膜菌黏附和代谢均有抑制作用,对表皮葡萄球菌生物被膜的形态有影响。结论:亚抑菌浓度的鱼腥草素钠、红霉素对表皮葡萄球菌生物被膜有抑制作用;鱼腥草素钠和红霉素联合用药对表皮葡萄球菌悬浮菌和生物被膜的抑制具有协同作用,在对生物被膜菌代谢的抑制和对生物被膜形态的影响方面效果尤为显著。

关键词：表皮葡萄球菌生物被膜鱼腥草素钠红霉素亚抑菌浓度药物协同

鱼腥草素钠以表面活性作用方式抑制铜绿假单胞菌感染的机制研究

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鱼腥草素钠以表面活性作用方式抑制铜绿假单胞菌感染的机制研究

作者：梅龙飞安徽中医药大学

学位级别：硕士

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)又称绿脓杆菌,是一种机会致病菌,主要感染免疫力缺失的患者。***在临床上发病率和致死率很高,主要的原因是其产生致密而整齐的生物被膜,增强其耐药性,它是造成许多疾病的重要原因。比如败血症,... 详细信息

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)又称绿脓杆菌,是一种机会致病菌,主要感染免疫力缺失的患者。***在临床上发病率和致死率很高,主要的原因是其产生致密而整齐的生物被膜,增强其耐药性,它是造成许多疾病的重要原因。比如败血症,烧伤后伤口感染等。表面活性剂是指加入低剂量就能明显引起溶液体系界面状态改变的物质。其分子式中具有特定亲水疏水基团,可整齐的排列于溶液表面,能够降低物质的表面张力,减少两相间的摩擦,改变细胞膜的通透性。鱼腥草素钠(Sodium houttuyfonate,SH)化学名称为癸酰乙醛亚硫酸氢钠,是三白草科植物蕺菜中有效成分鱼腥草素与亚硫酸氢钠的人工化学合成物,已在我国广泛应用于抗感染的临床应用中。但SH的体外的抑菌浓度较高且无显著的杀菌作用,可能无法以常用抗生素类似的直接杀菌的机制起到抗病原微生物的作用,具体的抗病原微生物机制仍未阐明。根据SH的化学结构,发现其可能具有阴离子表面活性剂的化学特性,并且结合SH广泛的抗细菌和抗真菌,免疫调节的生物学活性,我们推测SH可能通过表面活性的作用方式,破坏病菌的膜结构,从而调节免疫细胞活性,起到抑制病原微生物的作用。因此,本论文主要通过SH以表面活性剂为作用方式,深入研究其抑制铜绿假单胞菌的机制。目的:基于体外物理特性实验、细胞实验、动物实验来探讨SH作为表面活性剂的抑制铜绿假单胞菌作用机制。方法:转录组测序测定经SH处理过的铜绿假单胞菌的基因的差异表达,体外物理特性实验:Krafft点测定SH的Krafft(超过一定值时,离子型表面活性剂溶解度急剧增加)点,排油圈实验检测不同浓度SH的亲水、疏水性能力,通过增溶实验检测SH对难溶性物质溶解度的影响,膜渗透性实验检测SH透过铜绿假单胞菌细胞膜能力,通过兔红细胞实验检测SH影响铜绿假单胞菌破坏红细胞效果,膜蛋白光谱实验检测SH对铜绿假单胞菌细菌膜蛋白的影响。细胞实验:体外构建铜绿假单胞菌诱导吞噬细胞炎症模型进一步验证SH作为表面活性剂抗炎症损伤的作用机制。MTT法检测药物最适浓度和铜绿假单胞菌最适浓度,MTT和倒置显微镜观察最适细胞种板密度,ELISA检测细胞上清液IL-17、TNF-α、IFN-γ水平,流式细胞术检测巨噬细胞表面标记物F4/80的表达,透射电镜检测巨噬细胞的吞噬能力。动物实验:本研究将BALB/C雄性小鼠平均分为正常组、模型组、SH组、SDBS(十二烷基苯磺酸钠,Sodium dodecyl benzenesulfonate)组,采用铜绿假单胞菌涂抹小鼠舌头建立菌感染口腔模型,通过小鼠舌头HE染色验证模型构建成功,通过ELISA检测血清中IL-17、TNF-α、IFN-γ水平,1%肝组织匀浆检测T-SOD酶、CAT酶、MDA含量表达,通过qRT-PCR检测肝脏和肾组织中IL-17、TNF-α、IFN-γ基因表达。结果:(1)转录组测定结果表明SH抑制铜绿假单胞菌的机制,不单是通过单一靶点,而是多靶点共同作用,并且结合SH结构式,我们推测SH可能存在表面活性的作用。体外物理特性实验结果表明SH的Krafft值为24℃,排油圈结果表明SH有明显的排油能力,增溶实验表明SH可以有效增加不溶物的溶解度,膜渗透结果表明随着SH浓度增加,膜渗透作用增强,红细胞实验表明SH浓度越大,铜绿假单胞菌对红细胞的破坏作用越小,膜蛋白实验表明高浓度SH可以降低铜绿假单胞菌膜蛋白荧光强度。以上结果提示SH可能具有阴离子表面活性剂的活性功能。(2)细胞实验中,MTT和倒置显微镜结果表明细胞种板密度为3x10/ml,MTT结果表明SH最适浓度为为60μg/ml,铜绿假单胞菌最适浓度为1.5x10CFU(Clonal Formation Unit)/ml。ELISA结果表明细胞上清液中IL-17、TNF-α、IFN-γ水平较正常组明显升高,而SH干预后较模型组明显减少。流式细胞术结果表明铜绿假单胞菌PAO1诱导组巨噬细胞F4/80表达较空白组明显增多,SH干预后明显减少;流式细胞术结果表明铜绿假单胞菌PAO1诱导组巨噬细胞吞噬能力较空白组增强,SH干预后吞噬能力明显增强。透射电镜结果表明SH干预后与模型组比较,巨噬细胞吞噬铜绿假单胞菌个数明显增加。我们发现SH处理过的铜绿假单胞菌,比未被处理的,更有利于巨噬细胞的吞噬。细胞实验结果表明SH可能通过表面活性的方式改变铜绿假单胞菌的表面结构,从而提高巨噬细胞的吞噬效率和功能,并且避免巨噬细胞的过度炎症反应,以起到体外清除铜绿假单胞菌的作用。(3)动物实验结果表明HE染色发现模型组舌组织黏膜受损严重,SH干预后受损舌组织黏膜得到改善。ELISA结果表明模型组血清中IL-17、TNF-α、IFN-γ水平较正常组明显升高,而SH干预后较模型组明显减少。肝组

关键词：鱼腥草素钠铜绿假单胞菌巨噬细胞细胞因子表面活性剂口腔感染

鱼腥草素钠联合补肺汤对铜绿假单胞菌致慢性支气管炎肺气虚证大鼠免疫功能的影响

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鱼腥草素钠联合补肺汤对铜绿假单胞菌致慢性支气管炎肺气虚证大鼠...

作者：段强军安徽中医药大学

学位级别：硕士

目的:研究鱼腥草素钠(Sodium Houttuyfonate,SH)联合补肺汤(Bufei decoction,BFT)对铜绿假单胞菌生物被膜致慢性支气管炎肺气虚证大鼠免疫功能的影响,为两药联合治疗感染致肺气虚证提供依据。方法:用呼吸道生物被膜菌铜绿假单胞菌,以滴... 详细信息

目的:研究鱼腥草素钠(Sodium Houttuyfonate,SH)联合补肺汤(Bufei decoction,BFT)对铜绿假单胞菌生物被膜致慢性支气管炎肺气虚证大鼠免疫功能的影响,为两药联合治疗感染致肺气虚证提供依据。方法:用呼吸道生物被膜菌铜绿假单胞菌,以滴鼻法辅寒冷疲劳刺激复制慢性支气管炎肺气虚证大鼠模型,观察药物干预后的大鼠症候表现,采用血液流变仪、血气分析仪分别检测血液流变学、血气的改变。光学显微镜下观察肺组织的病变改善情况,观察大鼠体重、器官指数的改变。ELSIA法检测大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、IL-10、β-D2、TNF-α、IFN-γ的含量;q RT-PCR法测定组织My D88、TLR4、NF-k B、Ik B、Gas6、Pros的m RNA的表达;Western blot法测定大鼠肺组织中My D88、TLR4、NF-κB、p-NF-κB、IκB、p-IκB、Gas6、Pros中蛋白的变化。体外实验建立人上皮细胞株A549感染模型,MTT法检测铜绿假单胞菌生物膜和药物对于细胞增殖的影响。药物干预后,Western blot法检测细胞中凋亡蛋白bcl-2和Bax蛋白的相对表达量。结果:铜绿假单胞菌滴鼻法同时加以寒冷刺激能够成功的复制出慢性支气管炎肺气虚证模型;大鼠肺气虚症候表现明显;与正常对照组比较,模型对照组大鼠体重增加缓慢,脏器指数均降低,全血黏度(高切、低切)、血浆黏度、红细胞聚集指数、红细胞比容、纤维蛋白原均有显著增高(P鱼腥草素钠联合补肺汤能够提高Bax蛋白的表达,促使Bcl-2/Bax的比值降低,进而抑制铜绿假单胞菌生物膜诱导A549细胞的凋亡。结论:铜绿假单胞菌生物被膜感染大鼠,辅以寒冷刺激能够成功的诱导大鼠慢性支气管炎肺气虚证的发生,鱼腥草素钠联合补肺汤能够显著改善大鼠脏器指数、血液流变学和血气的异常。通过抑制肺气虚证大鼠炎症正调控中TLR4—NF-κB信号通路引发的炎症因子的释放,并通过促进炎症负调控中Gas6/Pro S—TAM系统的表达干预肺气虚证,对治疗慢性支气管炎肺气虚证起到积极作用。

关键词：鱼腥草素钠补肺汤铜绿假单胞菌生物膜慢性支气管炎肺气虚证免疫调节

鱼腥草素钠对脊髓损伤后早期的神经保护作用及其机制初探

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鱼腥草素钠对脊髓损伤后早期的神经保护作用及其机制初探

作者：唐维重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:探究鱼腥草素钠(sodiumhouttuyfonate,SH)对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后早期神经元的影响,及其发挥此效应的可能机制。方法:(一)在探究鱼腥草素钠对脊髓损伤后早期神经元的保护作用及判定SH的最佳药物剂量中,利用大鼠... 详细信息

目的:探究鱼腥草素钠(sodiumhouttuyfonate,SH)对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后早期神经元的影响,及其发挥此效应的可能机制。方法:(一)在探究鱼腥草素钠对脊髓损伤后早期神经元的保护作用及判定SH的最佳药物剂量中,利用大鼠脊髓夹伤模型,将40只SD雌性大鼠,随机分为假手术组、模型组、实验组(根据SH给药剂量不同分为低剂量组0.06g/(Kg.d),中剂量组0.12g/(Kg.d),高剂量组0.24g/(Kg.d)),每组各八只;连续灌胃给药7天,余下各组则采用生理盐水刺激。BBB(Basso,Beattie and Bresnahan)评分评估各组大鼠的后肢运动功能,尼氏染色和免疫荧光用于观察脊髓前角神经元的结构和生理功能变化,并计数前角神经元数量变化;综合上述结果判定SH在本实验中的最佳药物剂量。(二)在判定SH对脊髓损伤早期神经保护作用的可能机制中,24只SD雌性大鼠被随机分为假手术组、模型组、SH最佳剂量组,各8只。West blot和免疫荧光用于检测炎症因子(肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factor-a,TNF-a)、白介素 1β(Interleukins-1 β,IL-1 β)),P-JNK(phosphorylation c-Jun N-terminal kinase,P-JNK)、JNK、P-ERK(phosphorylation extracellular signal regulated kinase,P-ERK)、ERK、P-P38MAPK(phosphorylation P38 mitogen-activated protein kinase,P-P38MAPK)以及小胶质/巨噬细胞极化标志物iNOS(M1型)和Argi1(M2型)相关指标的表达变化。结果:中、高剂量SH能无差别的改善SCI后大鼠的后肢运动功能,能保留SCI处前角神经元的正常结构和部分生理功能;同时,中、高剂量SH较低剂量SH和模型组明显减少脊髓前角神经元的丢失;综合以上结果我们判定本实验SH的最佳药物剂量为中剂量组,即0.12 g/(Kg.d)。在探究SH对脊髓损伤早期神经元的保护作用中,与模型组相比,中剂量组中iNOS+细胞数量和蛋白iNOS、TNF-a、IL-1β、P-JNK/JNK,P-ERK/ERK、P-P38MAPK/P38MAPK 的表达明显减少,而Argi+细胞数量和蛋白Argi的表达则增加。结论:SH对SCI大鼠脊髓损伤早期具有一定的神经保护作用,其保护作用可能是通过抑制SCI后MAPK信号通路的激活,促进M1型小胶质/巨噬细胞向M2型转化,减轻其所介导的神经炎症反应实现。

关键词：脊髓损伤鱼腥草素钠小胶质/巨噬细胞神经保护

鱼腥草素钠联合阿米卡星抗多重耐药鲍曼不动杆菌及机制探讨

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鱼腥草素钠联合阿米卡星抗多重耐药鲍曼不动杆菌及机制探讨

作者：毛建梅川北医学院

学位级别：硕士

目的:研究鱼腥草素钠（Sodiumhouttuyfonate,SH）与阿米卡星（Amikacin,AMK）联用对多重耐药鲍曼不动杆菌（Multi-drug resistant Acinetobacter baumannii,MDR-Ab）的生长影响,并探讨其可能的作用机制。方法:从川北医学院附属医院检验... 详细信息

目的:研究鱼腥草素钠（Sodiumhouttuyfonate,SH）与阿米卡星（Amikacin,AMK）联用对多重耐药鲍曼不动杆菌（Multi-drug resistant Acinetobacter baumannii,MDR-Ab）的生长影响,并探讨其可能的作用机制。方法:从川北医学院附属医院检验科微生物室收集40株鲍曼不动杆菌,选取10株MDR-Ab菌株进行实验;通过微量肉汤稀释法、琼脂稀释法分别测定SH、AMK单用对MDR-Ab的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration,MIC）,采用棋盘式稀释法测定两药联合对MDR-Ab 的 MIC,计算分级抑制浓度指数（Fractional inhibitoryconcentration index,FICI）判断两药的联合抑菌效果;检测SH（1/2MIC）处理MDR-Ab后细胞外液中的罗丹明6G的荧光强度,间接反映SH对MDR-Ab的外排作用的影响;采用RT-PCR检测SH（1/2MIC）处理MDR-Ab后外排泵基因（adeB）、氨基糖苷修饰酶基因（aph（3’）-Ia、aac（3’）-Ia、aac（6’）-Ib、ant（3"）-Ia）、16S rRNA 甲基化酶基因（armA）的表达水平变化。结果:微量肉汤稀释法结果显示SH、AMK单用时的MIC值分别为1200～2800μg/ml、8192μg/ml,两药联合时 SH、AMK 的 MIC 值分别为600～1400μg/ml、4096μg/ml。抑制率结果显示 SH 与 AMK（＜1024μg/ml）联用时的抑制率低于AMK单用,表明此状态下可能为促进细菌生长,SH与AMK（≥1024μg/ml）联用时抑制率高于AMK单用（P＜0.05）,表明此状态下抑菌作用可能为相加,结合所得FICI值为0.75～1,表明两药联合抑菌作用为相加。琼脂稀释法结果显示SH、AMK单用时的MIC值分别为2400μg/ml、16384μg/ml,两药联合时SH、AMK的MIC值分别为600μg/ml、8192μg/ml,FICI值为0.75,同样表现出相加抑菌作用。加入含5%葡萄糖PBS溶液后,所有实验菌株细胞外液中的罗丹明6G荧光强度均随时间变化逐渐升高,且在10min、30min、60min时SH用药组的荧光强度低于未用药组（P＜0.05）,而0min和120min时两组的荧光强度差异无统计学意义（P＞0.05）,表明SH可能有抑制MDR-Ab的药物外排作用。RT-PCR结果表明SH组与未用药组中adeB、aph（3’）-Ia、aac（3’）-Ia、aac 6（’）-Ib、ant（3"）-Ia、armA等基因的表达水平无明显差异。结论:SH能够体外抑制MDR-Ab菌株生长;SH与AMK（＜1024μg/ml）联用时可能存在促进细菌生长的作用,SH与AMK（≥1024μg/ml）联用时可能存在相加抗菌作用;SH可能有抑制MDR-Ab的药物外排作用,但具体作用机制不明。

关键词：鱼腥草素钠阿米卡星鲍曼不动杆菌分级抑菌浓度指数罗丹明6G

鱼腥草素钠对鸡BSA抗体及灭活菌苗免疫鸭的影响

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鱼腥草素钠对鸡BSA抗体及灭活菌苗免疫鸭的影响

作者：李清西南大学

学位级别：硕士

鱼腥草素(Houttuyfonate)是鱼腥草(俗称折耳根)挥发油中抗病微生物的有效成分,化学结构为癸酰乙醛。鱼腥草素与亚硫酸氢钠的加成物为鱼腥草素钠(Sodium houttuyfonate,SH)。王大勇等发现,SH与牛血清白蛋白(Bovin serum albumin,BSA)或... 详细信息

鱼腥草素(Houttuyfonate)是鱼腥草(俗称折耳根)挥发油中抗病微生物的有效成分,化学结构为癸酰乙醛。鱼腥草素与亚硫酸氢钠的加成物为鱼腥草素钠(Sodium houttuyfonate,SH)。王大勇等发现,SH与牛血清白蛋白(Bovin serum albumin,BSA)或红细胞混合注射后,小白鼠血清IgG、IgM类抗体效价明显增加,提出SH具有免疫佐剂效应。研究表明,SH可增强小白鼠巨噬细胞吞噬功能,增强巨噬细胞呼吸爆发,增加细胞内游离钙离子浓度及T细胞分泌白细胞介素-2。 SH对禽类体液免疫是否有增强作用?未见文献报道。本文报道SH对鸡、鸭抗体产生及菌苗接种后的攻毒保护试验的影响研究结果。 1 SH对BSA免疫鸡后抗体产生具有增强效应。以BSA为免疫原,比较10碳原子SH(SH-C)与白油(Mineral oil,MO)佐剂免疫雏鸡后,对BSA特异性抗体产生的影响。间接ELISA检测结果是,二次免疫后,SH-C组和MO组间抗体效价极显著高于BSA组(P＜0.01),SH-C组和MO组间抗体效价无显著差异(P＞0.05)。试验结果表明,SH对BSA免疫鸡后的抗体增强效应与MO佐剂相当。 2 SH对鸭疫里默氏杆菌(Rimerella anatipestifer,RA)灭活菌苗免疫小鸭后攻毒保护率具有增强效应。以灭活的鸭疫里默氏杆菌(Rimerella anatipestifer,RA)为抗原,免疫接种雏鸭,通过攻毒试验检测SH对细菌性颗粒抗原的免疫佐剂效应。试验选择医学临床上广泛应用的新鱼腥草素钠(十二酰乙醛亚硫酸钠,SH-C)为试验品,以AF株强毒RA为试验菌种制备灭活菌苗(Iactivated RA,iRA)。采用正交试验设计iRA与SH-C配合比率、免疫次数和首免日龄。结果是:iRA与SH-C混合物一次接种,4日龄和6日龄雏鸭在免疫后11～15天攻毒,相对保护率(Relative protection rate,RP)均低于40%。相反,iRA与SH-C混合物于2、4、6和8日龄雏鸭首免,间隔5～7天后进行二次(强化)免疫,然后在16～19日龄攻毒,iRA与SH-C的不同配合组中,有5个组的RP大于60%,其中甚至有一个组发病率死亡率为0,RP达到了100%。试验结果显示,iRA中加入SH-C,二次免疫接种雏鸭表现出良好的免疫佐剂效应。在获得上述结果后,我们选择iRA与SH-C(12)配合较佳组与MO佐剂进行对比试验。4日龄首免,11日龄二免,16日龄攻毒。结果是,攻毒对照组死亡率为53.3%(8/15),SH-C和MO组发病率均为0,RP均为100%(15/15)。比较试验鸭在攻毒7天后的增重,MO组平均增重数值上小于健康对照组,SH-C组平均增重数值上大于健康对照组,统计学检验,三组间不存在显著差异。 3 SH在体外试验中对鸭红细胞具有溶血作用。在试验二中发现,SH-C对照组(仅注射SH-C溶液)死亡率为81.8%(9/11),高于AF株强毒RA攻毒对照组死亡率(63.6%,7/11)。为解释这一现象,按照《中华人民共和国药典》(下简称药典)2000版二部质量标准要求。以十二酰乙醛亚硫酸钠(SH-C)标准品为参照,对试验品SH-C(10)、SH-C进行质量检测。结果是,三氯化铁反应、碘反应、二硝基苯肼反应以及紫外光谱最大吸收峰测定等检测项,SH-C样品均符合《药典》要求,含量为97.25%;SH-C样品中三氯化铁反应(检测羟基)项为阴性,其余各项符合《药典》要求,含量为94.23%。据报道,SH可引起人红细胞溶血,但SH是否引起鸭红细胞(Red blood cell,RBC)溶血,未见报道。为此,我们采集健康鸭血液,进行体外溶血试验,采用分光光度法测定溶血程度,结果是,包括标准品在内,三种SH样品,浓度为40μg/mL～200μg/mL时可致鸭RBC发生明显溶血,溶血率达到96.0%。显微镜观察,加入有SH溶液的鸭RBC涂片中,出现大量的无胞浆,只有胞核的RBC残片。SH溶液中含有吐温-80,相同浓度的吐温-80也可以引起鸭RBC溶解,但溶血率最高为30.1%。试验表明,SH溶液引起鸭RBC严重溶解,这可能是SH单独使用时引起鸭对RA强毒攻击敏感性增高的原因。综上研究认为,SH对鸡、鸭免疫有免疫佐剂效应,可以进行开发研究。但SH有效剂量、SH引起鸭RBC溶血等副作用值得高度重视和深入研究。

关键词：鱼腥草素钠免疫佐剂疫苗 BSA 鸭疫里默氏杆菌

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鱼腥草素钠抗白念珠菌的作用及机制研究

鱼腥草素钠抗白念珠菌的作用及机制研究

作者：商庆华福建中医药大学

学位级别：硕士

目的：研究鱼腥草素钠(Sodium Houttuyfonate,SH)抗白念珠菌的作用并探讨作用机制,试图发现具有新结构和新靶点的抗真菌先导化合物。方法：微量液基稀释法初步确定鱼腥草素钠的抗白念珠菌作用,生长曲线、时间-杀菌曲线、小鼠系统性真菌... 详细信息

目的：研究鱼腥草素钠(Sodium Houttuyfonate,SH)抗白念珠菌的作用并探讨作用机制,试图发现具有新结构和新靶点的抗真菌先导化合物。方法：微量液基稀释法初步确定鱼腥草素钠的抗白念珠菌作用,生长曲线、时间-杀菌曲线、小鼠系统性真菌感染实验等进一步验证该化合物在体内外抗白念珠菌的作用;XTT、细胞表面疏水性测定、激光共聚焦显微镜等测定鱼腥草素钠对白念珠菌生物被膜的作用。最后通过流式细胞术测定细胞周期、透射电子显微镜观察超微结构、细胞内活性氧水平检测、细胞膜甾醇成分分析、扫描电子显微镜观察生物被膜表面、细胞膜通透性测定、Real-time PCR测定相关基因的表达等探讨鱼腥草素钠抗白念珠菌的作用机制。结果：微量液基稀释法显示鱼腥草素钠对白念珠菌的MIC80在8-16μg/ml之间;生长曲线实验显示SH在高浓度时可抑制YPD培养基中白念珠菌的生长,;时间-杀菌曲线表明在RPMI1640培养基中SH≥16μg/ml时具有杀菌作用;小鼠系统性真菌感染实验结果表明SH在一定剂量时可以延长小鼠的存活时间,但高剂量时显示出毒副作用。XTT实验显示出SH对不同时期的被膜的作用,尤其对生物被膜的粘附有很大影响;SH同时降低生物被膜细胞表面疏水性;流式细胞术显示SH抑制白念珠菌细胞的增殖;SH作用后白念珠菌细胞内的活性氧(ROS)水平明显升高;扫描电镜显示生物被膜中白念珠菌细胞内容物似乎发生外泄,随后细胞通透性实验证实SH使细胞的通透性发生改变。Real-timePCR显示白念珠菌耐药相关基因及生物被膜相关基因的表达发生变化。结论：SH在体内外均具有一定抗白念珠菌活性,且更重要的是对耐药白念珠菌及生物被膜亦有作用,其作用机制初步认为是可引起白念珠菌细胞膜的损伤,改变细胞的通透性,引起内容物外泄导致。

关键词：白念珠菌鱼腥草素钠抗真菌生物被膜机制