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昆虫FKBP12蛋白和鱼尼丁受体SPRY1结构域的结构与功能研究

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昆虫FKBP12蛋白和鱼尼丁受体SPRY1结构域的结构与功能研究

作者：李浩岑天津大学

学位级别：硕士

鱼尼丁受体(Ryanodine receptor,Ry R)是一种位于肌肉肌浆网膜上的大型同源四聚体钙离子释放通道,是杀虫剂的主要靶标。目前市场上最畅销的双酰胺类杀虫剂能够高效且选择性地激活昆虫鱼尼丁受体。但近年来,由于大量使用双酰胺类杀虫剂,... 详细信息

鱼尼丁受体(Ryanodine receptor,Ry R)是一种位于肌肉肌浆网膜上的大型同源四聚体钙离子释放通道,是杀虫剂的主要靶标。目前市场上最畅销的双酰胺类杀虫剂能够高效且选择性地激活昆虫鱼尼丁受体。但近年来,由于大量使用双酰胺类杀虫剂,在鱼尼丁受体离子通道跨膜结构域中发现了新的抗性突变,从而降低了其功效。因此,迫切需要开发出能够解决抗药性问题的新型杀虫剂。针对害虫鱼尼丁受体上的可以被具有物种选择性化合物调控的特定位点是一种很好的替代策略。FKBP12是12 k Da大小的FK506结合蛋白,是细胞内钙释放通道鱼尼丁受体的调节蛋白。FKBP12通过与鱼尼丁受体直接相互作用从而负向调控其功能,因此昆虫FKBP12蛋白与鱼尼丁受体相互作用的界面是杀虫化合物的潜在新靶向位点。鱼尼丁受体和FKBP12之间的相互作用是由鱼尼丁受体的几个结构域介导的,其中SPRY1结构域起主要作用。由于FKBP12是鱼尼丁受体的负向调节亚基,开发任何小分子以减少或消除FKBP12蛋白和鱼尼丁受体的相互作用,都可以促进通道开放以及持续的钙离子泄漏。因此,开发能够破坏FKBP12和鱼尼丁受体相互作用的有效分子,可能是具有替代作用方式的潜在杀虫剂候选物,从而有望解决目前遇到的杀虫剂抗性问题。然而,昆虫FKBP12以及鱼尼丁受体的SPRY1结构域的蛋白结构目前都仍缺失,阻碍了对昆虫特异性调控机制的理解和昆虫特异性调节剂的开发。在这项研究中,我们使用大肠杆菌表达系统进行蛋白表达,并且通过X射线晶体学方法解析了家蚕FKBP12蛋白(SW FKBP12)和小菜蛾鱼尼丁受体SPRY1结构域(DBM Ry R SPRY1)的晶体结构。小菜蛾鱼尼丁受体SPRY1结构域和家蚕FKBP12蛋白的晶体分辨率分别为1.85?和2.00?。小菜蛾鱼尼丁受体SPRY1的核心结构由10个β链形成的两个反平行β片层组成。两条额外的链β4和β5形成从核心突出的发夹结构,就像“手指”一样。此外,在SPRY1结构域的中间部分和C端部分的β链之间插入了三个3螺旋。小菜蛾鱼尼丁受体SPRY1与其哺乳动物对应物具有相似的整体折叠。家蚕FKBP12蛋白结构由一层由5条β链形成的β片层组成,该层由β4链形成的“盖子”覆盖,两侧为ɑ螺旋和31螺旋。家蚕FKBP12蛋白与人类FKBP12(h FKBP)蛋白具有高度序列一致性(77%)和结构相似性。与SPRY1相比,这两种FKBP结构的局部结构差异也更小。主要区别在于分别连接链β2和β3以及链β5和β6的两个相对灵活的环。将这些结构与全长小菜蛾鱼尼丁受体的冷冻电镜结构模型对接,我们发现了SPRY1和FKBP12蛋白之间的昆虫特异性界面。与FKBP12蛋白结合相关的两个重要的SPRY1环在昆虫和哺乳动物之间是非保守的,并且与哺乳动物SPRY1的对应物相比具有不同的构象。我们进一步通过下拉实验发现,人FKBP12.6蛋白只能选择性地下拉兔子鱼尼丁受体1(r Ry R1)蛋白,而不能结合草地贪夜蛾鱼尼丁受体(sf Ry R)蛋白,表明FKBP和鱼尼丁受体之间存在物种特异性相互作用。基于荧光的热位移测定实验结果也证实了这一可能存在的物种特异性相互作用。此外,等温滴定量热法(ITC)测定结果表明,与家蚕FKBP12相比,人FKBP12.6蛋白与FK506和雷帕霉素的亲和力更强。与FK506相比,雷帕霉素与FKBP蛋白亲和力更高。我们认为靶向鱼尼丁受体和FKBP12蛋白相互作用的界面是开发下一代杀虫剂的一种有前途的新策略。我们的研究结果揭示了FKBP12蛋白调控昆虫鱼尼丁受体的分子机制及其物种特异性。我们还发现了新型杀虫剂的潜在靶标。这为未来开发针对昆虫鱼尼丁受体新位点的特异性杀虫剂提供了结构基础。

关键词：鱼尼丁受体 FK506结合蛋白 SPRY1 杀虫剂抗性晶体结构

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鱼尼丁受体类杀虫剂的研究进展

四川师范大学学报（自然科学版） 2011年第3期34卷 427-434页

作者：王唤米娜范志金 Natalia P Belskaia Vasiliy A Bakulev 南开大学元素有机化学国家重点实验室天津300071 俄罗斯联邦叶利钦大学

介绍了鱼尼丁受体类新型杀虫剂的创制现状、作用机制、生物活性、毒性及合成方法,由于此类杀虫剂的结构独特、作用方式新颖、对鳞翅目害虫效果好、杀虫广谱,该类药剂对各种益虫和天敌安全,对现用的杀虫剂无交互抗性,具有良好的发展前景.

关键词：鱼尼丁受体杀虫剂综述

碳硫双手性邻苯二甲酰类鱼尼丁受体杀虫剂研究进展

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世界农药 2022年第3期44卷 21-26,52页

作者：李林珊谢伟彬郑占英李正名周莎南开大学元素有机化学研究所农药国家工程研究中心天津300110

近年来在开展具有新型作用机制的鱼尼丁受体杀虫剂创制研究中,笔者课题组首次报道了新型碳硫双手性邻苯二甲酰类鱼尼丁受体杀虫剂的设计合成以及其生物活性研究,所总结的构效关系对这类生态友好的杀虫剂的创制研究具有一定的指导意义。

关键词：碳硫双手性邻苯二甲酰鱼尼丁受体绿色杀虫剂

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小菜蛾鱼尼丁受体基因克隆及序列分析

植物保护 2012年第4期38卷 118-123页

作者：孙丽娜芮昌辉袁会珠中国农业科学院植物保护研究所农业部作物有害生物综合治理综合性重点实验室北京100193

利用RT-PCR和RACE技术克隆了小菜蛾(Plutella xylostella)鱼尼丁受体(Px-RyR)基因,其核苷酸序列全长15 748bp,5′非编码区267bp,3′端非编码区109bp,开放阅读区全长为15 372bp(GenBank登录号:JF927788),编码5 123个氨基酸残基。估测其蛋白分子量为579.39ku,等电点为5.45。该基因编码氨基酸序列和其他鳞翅目昆虫RyR氨基酸序列比对相似性较高(92%),与哺乳动物3种亚型RyRs的相似性为45%～47%。此外,二级结构预测,其C-末端存在6个跨膜区域;且Px-RyR中存在一个出现4次重复,长度为89～95个氨基酸的RyR结构域,平均相似性为33%。

关键词：小菜蛾鱼尼丁受体基因克隆

新型二酰胺类杀虫剂对鱼尼丁受体作用的分子机理

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昆虫学报 2008年第6期51卷 646-651页

作者：唐振华陶黎明中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所上海200032 上海市农药研究所上海200032

最近发现了一类新型二酰胺类杀虫剂——氟虫酰胺和氯虫酰胺,其作用靶标是鱼尼丁受体(ryanodine receptors,RyRs)。本文对RyR的结构与功能、电压门控钙离子通道和鱼尼丁受体钙离子释放通道对细胞质钙离子内环境稳定的调节以及二酰胺类杀... 详细信息

最近发现了一类新型二酰胺类杀虫剂——氟虫酰胺和氯虫酰胺,其作用靶标是鱼尼丁受体(ryanodine receptors,RyRs)。本文对RyR的结构与功能、电压门控钙离子通道和鱼尼丁受体钙离子释放通道对细胞质钙离子内环境稳定的调节以及二酰胺类杀虫剂对RyRs作用的分子机理进行综述。二酰胺类杀虫剂使昆虫RyR通道处于持续的开放状态,引发钙离子从肌质网腔内大量释放,破坏了细胞质钙离子内环境的稳定,从而产生不同的药物学特性。这些变化都是由一个不同于鱼尼丁在RyR上的结合部位介导的。该类杀虫剂的作用对昆虫RyRs是高度专一的,结果产生选择毒性。由于二酰胺类杀虫剂的结构独特,作用方式新颖,对鳞翅目害虫效果好、杀虫谱广,对各种益虫和天敌安全,并对现用的杀虫剂无交互抗性,故它们非常适合于抗性治理和IPM。

关键词：二酰胺类杀虫剂鱼尼丁受体钙离子内环境稳定钙离子通道分子机理

草地贪夜蛾鱼尼丁受体与双酰胺类杀虫剂的结合模式及抗性风险分析

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农药学学报 2021年第5期23卷 856-868页

作者：李康王凯博陶丽红李丽李佳俊吴文伟肖春叶敏云南农业大学云南生物资源保护与利用国家重点实验室昆明650201 云南省农业科学院农业环境资源研究所昆明650201

为研究草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(以下简称FAW)对双酰胺类杀虫剂的抗性机制,根据FAW鱼尼丁受体(ranodine receptor,RyR)跨膜区域的氨基酸序列,通过同源建模的方法构建其三维结构;通过对比FAW与小菜蛾Plutella xylostella(以下简... 详细信息

为研究草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(以下简称FAW)对双酰胺类杀虫剂的抗性机制,根据FAW鱼尼丁受体(ranodine receptor,RyR)跨膜区域的氨基酸序列,通过同源建模的方法构建其三维结构;通过对比FAW与小菜蛾Plutella xylostella(以下简称DBM)RyR跨膜区域的氨基酸序列,发现两者具有较高的同源度,进而根据已报道的FAWRyR的突变位点I4734M及DBMRyR的突变位点G4946E(对应FAWRyR的G4891),在FAWRyR中引入突变,采用分子对接的方法分别分析其突变前后与5种双酰胺类杀虫剂的结合模式。结果表明:FAWRyR的I4734M突变模型与5种双酰胺类杀虫剂的亲和力与野生型的无明显差别,均存在氢键、卤键、疏水作用、π-π相互作用及π-阳离子作用等非共价相互作用;但G4891E突变模型与5种双酰胺类杀虫剂的亲和力下降、形成的作用力方式减少,从而影响RyR与双酰胺类杀虫剂的结合稳定性。本研究分析发现,FAWRyR的G4891E突变可能导致其对双酰胺类杀虫剂产生抗性,需在今后的研究中关注该突变。该研究结果还可会为基于鱼尼丁受体设计杀虫剂提供参考。

关键词：草地贪夜蛾鱼尼丁受体双酰胺类杀虫剂同源建模突变位点结合模式抗性风险

以昆虫鱼尼丁受体为靶标的化合物活性筛选方法研究进展

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农药学学报 2010年第4期12卷 402-407页

作者：孙丽娜闫晓静芮昌辉袁会珠中国农业科学院植物保护研究所农业部农药化学与应用重点开放实验室北京100193

昆虫鱼尼丁受体(ryanodine receptor,RyR)是目前新型杀虫剂创制中备受关注的靶标之一。在以RyR为靶标的杀虫剂氟虫酰胺和氯虫酰胺商品化后,大量基于该靶标的新型化合物被设计并合成出来。为加速研发和快速准确筛选以昆虫RyR为靶标的药剂... 详细信息

昆虫鱼尼丁受体(ryanodine receptor,RyR)是目前新型杀虫剂创制中备受关注的靶标之一。在以RyR为靶标的杀虫剂氟虫酰胺和氯虫酰胺商品化后,大量基于该靶标的新型化合物被设计并合成出来。为加速研发和快速准确筛选以昆虫RyR为靶标的药剂,主要以氟虫酰胺和氯虫酰胺的活性筛选研究为例,对作用于RyR化合物的各种活体筛选方法和离体筛选方法进行了综述。其中活体筛选方法主要包括:点滴法、浸叶法、浸卵法、浸虫法、注射法和喷雾法;离体筛选方法主要包括MTT法、膜片钳技术、荧光技术、膜片钳技术与荧光技术结合以及计算机模拟筛选。通过对各种方法的分析比较,认为离体筛选方法快速、准确,在新型RyR杀虫剂活性的筛选研究中将进一步得到应用。

关键词：杀虫剂鱼尼丁受体化合物筛选综述

桃小食心虫鱼尼丁受体基因克隆及表达模式分析

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中国农业科学 2015年第10期48卷 1971-1981页

作者：孙丽娜张怀江闫文涛马春森仇贵生中国农业科学院果树研究所中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室

【目的】二酰胺类杀虫剂的作用靶标鱼尼丁受体(ryanodine receptor,Ry R)是目前所知的最大的离子通道蛋白,该受体可控制细胞内Ca2+的释放,对细胞内Ca2+的稳定起着关键作用。克隆获得桃小食心虫鱼尼丁受体基因(Cs Ry R)全长序列,进一步... 详细信息

【目的】二酰胺类杀虫剂的作用靶标鱼尼丁受体(ryanodine receptor,Ry R)是目前所知的最大的离子通道蛋白,该受体可控制细胞内Ca2+的释放,对细胞内Ca2+的稳定起着关键作用。克隆获得桃小食心虫鱼尼丁受体基因(Cs Ry R)全长序列,进一步解析该基因在桃小食心虫(Carposina sasakii)各发育阶段的表达模式。【方法】通过同源序列比对的方法,利用c DNA末端快速扩增技术(RACE)获得该基因的全长c DNA序列;应用生物信息学软件对该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列、功能结构域等信息进行预测分析,并基于最大似然法构建该基因与其他昆虫相关基因序列的系统发育树,明确其系统进化关系。分别提取桃小食心虫各发育阶段RNA,以GAPDH为内参基因,应用RT-q PCR技术,解析Cs Ry R在桃小食心虫各发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)的表达模式。【结果】桃小食心虫Cs Ry R的c DNA全序列长度为15 766 bp,开放阅读框15 405 bp,编码5 134个氨基酸。氨基酸序列比对结果显示,Cs Ry R与脊椎动物Ry Rs的一致度分别为45%—47%;与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)Ry R的一致度也为46%。在昆虫Ry Rs中,与鳞翅目一致度为91%—94%,与同翅目、双翅目昆虫一致度均为79%。系统发育树显示该基因编码的蛋白质与鳞翅目夜蛾科和螟蛾科害虫Ry Rs亲缘关系最近。结构域分析结果显示,Cs Ry R具有Ry R的典型结构域,如位于C-末端的6个跨膜结构域(AA 4 467-5 029)、释放Ca2+的通道形成基序GVRAGGGIGD、Ca2+结合位点EF-hand和3个ATP结合位点GXGXXG等。二酰胺类杀虫剂可能的作用位点AA 183-290(Bm Ry R),AA 4 610-4 655(Dm Ry R)和4 946G(Px Ry R)在Cs Ry R中无特殊性。此外,Cs Ry R中存在AA 2 490-2 496 TQAPRPG和5 131-5 134 SQAK两个基序,在其他物种中均没有发现。RT-q PCR分析结果表明,Cs Ry R在蛹期表达量最高,分别是1日龄卵、6日龄卵、初孵幼虫、老熟幼虫和成虫的25.19、7.73、6.48、4.74和3.58倍。【结论】克隆了Cs Ry R基因全长c DNA序列,证明其表达具有发育阶段特异性。

关键词：桃小食心虫鱼尼丁受体基因克隆发育阶段表达模式

昆虫鱼尼丁受体及以其为靶标的杀虫剂的研究进展

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农药学学报 2008年第2期10卷 178-185页

作者：董卫莉徐俊英刘幸海赵卫光李正名南开大学元素有机化学研究所元素有机化学国家重点实验室天津300071

植物保护领域以昆虫鱼尼丁受体(ryanodine receptor,RyR)为靶标的杀虫剂的研发取得了突破性进展。对近年来RyR在分子结构、功能调节,以及对以RyR为靶标的杀虫剂的作用机制方面的研究进展进行了综述。昆虫RyR与哺乳动物RyR仅有约47%的同... 详细信息

植物保护领域以昆虫鱼尼丁受体(ryanodine receptor,RyR)为靶标的杀虫剂的研发取得了突破性进展。对近年来RyR在分子结构、功能调节,以及对以RyR为靶标的杀虫剂的作用机制方面的研究进展进行了综述。昆虫RyR与哺乳动物RyR仅有约47%的同源性,因而是一个有效的杀虫剂靶标。昆虫RyR克隆与表达技术的成熟为新型杀虫剂的开发和作用机制的研究提供了有力的工具。昆虫RyR单通道、配体结合和免疫学特性的研究补充了RyR的电生理学数据。近年来开发的新型RyR杀虫剂通过激活害虫鱼尼丁敏感的细胞内钙离子释放通道来达到杀虫的效果。

关键词：鱼尼丁受体钙离子通道杀虫剂作用机制