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高温厌氧菌Rx1乙酸生成途径的阻断对碳中心代谢的影响

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高温厌氧菌Rx1乙酸生成途径的阻断对碳中心代谢的影响

作者：申冬玲昆明理工大学

学位级别：硕士

以来源丰富的木质纤维素为原料的第二代生物乙醇,已经成为当前研究者的主要研发热点。利用高温菌进行纤维素乙醇发酵具有诸多潜在优势。阻断其与乙醇代谢途径竞争碳源和还原力的乳酸和乙酸生成途径的代谢工程方法是当前提高乙醇产率的... 详细信息

以来源丰富的木质纤维素为原料的第二代生物乙醇,已经成为当前研究者的主要研发热点。利用高温菌进行纤维素乙醇发酵具有诸多潜在优势。阻断其与乙醇代谢途径竞争碳源和还原力的乳酸和乙酸生成途径的代谢工程方法是当前提高乙醇产率的主要策略。但由于ldh和pta在高温厌氧菌中的生理功能及代谢调控机制尚不清楚,导致该策略的改进缺乏理论指导,工程菌株的乙醇产量仍然很低。本文以实验室分离保存的嗜热厌氧菌Rx1为出发菌株,在敲除乙酸生成途径的关键酶基因ack的基础上,分析了ack对碳中心代谢关键酶的活性、基因表达和代谢通量水平上的影响,研究了ack对糖酵解和乙醇发酵途径的代谢调控作用,再通过分析突变株细胞内NADH/NAD+、ATP/ADP比率与代谢调控作用的关系,进而探索了ack基因的代谢调控机理。获得了如下结果:*** Rx1乙酸激酶基因的敲除以实验室筛选到的高效降解半纤维素产乙醇的革兰氏阳性严格厌氧嗜热菌*** Rx1为研究对象,首先构建了用于敲除乙酸激酶的重组载体pBSkpa,并将其导入*** Rx1细胞中,并初步筛选到4株突变菌株。分别通过PCR验证、测序验证和代谢产物分析验证成功得到一株生长速率较快的工程突变菌株Δack。并且通过传代培养实验验证了突变株的遗传特性的稳定性。2.乙酸激酶基因的敲除对***1生长和发酵的影响对Δack突变菌株进行生长特性分析发现其延滞期增长,野生菌株接种2h后就进入指数生长期,而突变菌株要进过4h的适应才能快速生长。野生菌株乙醇耐受性为4%,而突变菌株乙醇耐受性增加至6%。分别对*** Rx1和Δack突变菌株进行发酵实验,以葡萄糖、纤维二糖、木糖和玉米芯酸水解液为底物,结果与野生菌株相比,突变菌株生长减慢,细胞的干重都有所降低,且底物消耗量增加,但是乳酸或乙醇的得率显著提高;当以纤维二糖为底物时,突变菌株的乙醇产量达3.60 g/L,得率为0.55 g/g,远高于突变菌株对其它底物的产量;以玉米芯水解液为底物时,突变菌株的乳酸产量高于野生菌株,而且野生菌乳酸、乙醇的产量都高于以木糖为底物时的产量。3.乙酸激酶基因的敲除对*** Rx1碳中心代谢的影响分析ack基因的敲除对代谢途径关键酶在基因转录水平、蛋白质水平上的影响,解析目的基因ack对宿主细胞的代谢调控作用。对*** Rx1中心碳代谢途径中的关键酶基因进行实时荧光定量PCR,结果显示除pta基因和NADH脱氢酶基因上调表达,突变菌株的其它关键酶基因的表达量都低于野生菌株。关键酶的酶活分析发现糖酵解途径的限速酶GK及POR、LDH的酶活增加,PTA、ACK的酶活显著降低,这也是乳酸含量升高的原因。4.乙酸激酶基因的敲除对Rx1菌株能荷水平和氧化还原水平的影响通过测定野生型和突变菌株细胞内NADH、NAD+、ATP、ADP的浓度,分析ACK依赖性ATP生成途径的缺失对细胞内氧化还原水平(NADH/NAD+)和ATP/ADP的影响。结果显示在细胞的指数生长期,突变菌株细胞内的ATP/ADP的比值稍低于野生菌株菌株,而稳定期野生菌株细胞内的ATP/ADP比值高于指数生长期细胞,而突变菌株则是稳定期的ATP/ADP比值低于指数生长期,ATP/ADP的比值对于细胞的生长有调节作用,高比值有利于细胞的生长。对于细胞内氧化还原水平NADH/NAD+,野生菌株生长期NADH/NAD+比值与稳定期相一致,而突变菌株则是稳定期细胞NADH/NAD+比值高于生长期,而突变菌株的代谢产物乳酸、乙醇产量高于野生菌株,这可以说明NADH/NAD+比值升高有利于碳源流向乳酸、乙醇等产物。

关键词：高温厌氧菌乙醇发酵基因敲除基因转录水平氧化还原水平

高温厌氧菌Thermoanaerobacterium calidifontis Rx1乙醇代谢调控机理研究

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高温厌氧菌Thermoanaerobacterium calidifontis Rx1乙醇代谢调控...

作者：吴铭杰昆明理工大学

学位级别：硕士

利用木质纤维素生产乙醇是当前生物乙醇领域的研究热点,高温厌氧菌因其具有降解纤维素和(或)半纤维素等多糖的能力而被视为有潜力的生物乙醇发酵菌种。嗜热厌氧温泉菌Rx1(Thermoanerobacterium calidifontis Rx1)是从云南保山温泉中筛... 详细信息

利用木质纤维素生产乙醇是当前生物乙醇领域的研究热点,高温厌氧菌因其具有降解纤维素和(或)半纤维素等多糖的能力而被视为有潜力的生物乙醇发酵菌种。嗜热厌氧温泉菌Rx1(Thermoanerobacterium calidifontis Rx1)是从云南保山温泉中筛选得到的嗜热、严格厌氧的革兰氏阳性细菌。本实验室对该菌株的乙酸激酶进行敲除,得到突变株*** Rx1 Δack。本论文以上述野生型菌株Rx1及其突变菌株Rx1 Δack为研究对象,为了阐明乙酸激酶基因的代谢调控机制,分析了乙酸激酶敲除对菌株转录水平的影响;研究了不同pH条件对Rx1和Rx1 Δack菌株乙醇代谢的影响及其机理。获得结果如下:1.对*** Rx1和*** Rx1 Δack进行转录组分析。基因差异表达分析显示两个菌株共同表达基因2283个,野生型菌株独有表达基因205个,突变菌株独有表达基因73个。总共有324个显著差异表达的基因,其中上调表达104个(占比32.1%),下调表达220个(占比67.9%),下调基因占大多数。基因GO功能分析表示转录本有差异地上调或下调的基因中大部分属于生物学过程(biological process),其中有机底物糖化过程(organic substance catabolic process)中差异表达基因最多,表明乙酸激酶的敲除对代谢过程的影响最大。KEGG功能分析显示差异显著基因中有209个差异表达基因参与42个不同的代谢或信号通路。其中40个(19.1%)基因属于代谢途径(Metabolicpathway),15个(7.2%)基因属于次级代谢合成(Biosynthesis of secondary metabolites),15个(7.2%)基因属于抗生素合成(Biosynthesis of antibiotics),13个(6.2%)基因参与微生物在不同环境中的代谢(Microbial metabolism in diverse environments)。乙酸激酶的敲除使木糖转运和木糖降解的相关蛋白下调表达,底物摄入和利用效率下降,是造成生长速率变慢的原因。2.培养基pH值对Rx1菌株生长代谢调节作用的研究分析。通过Rx1的补料发酵实验发现,在菌株到达最大菌体密度后其底物利用变慢或停止,此时培养基pH值低于4.6,因此本研究分析了pH值的控制对Rx1菌株生长代谢的影响。不控制pH值条件下野生型菌株培养24 h时培养基pH值会降至最低值4.33,突变株在32 h降至最低pH值4.79。不控制pH值条件下菌株会由于发酵后期pH值过低导致不能完全利用培养基中的底物,控制培养环境的pH值时,Rx1和Rx1Δack可以完全利用培养基中的有机底物,其中野生型菌株对有机底物的利用速率下降,导致菌株的生长速率下降。代谢产物方面,控制pH=6.0或7.0时会使*** Rx1和*** Rx1 Δack的乳酸产出减少,而原来流向乳酸的中心碳流向乙醇,乙醇成为发酵的最主要产物,控制pH为7.0时,培养48小时的最高产量达到3.87 g/L,为不控制pH值的160%。***值对Rx1菌株代谢调控机理分析。与不控制pH值条件相比,野生型菌株Rx1在控制pH为7.0的条件下乳酸脱氢酶基因ldh和丙酮酸激酶基因pk的表达量均显著上调两倍以上,乙酸激酶基因ack显著下调,双功能乙醛/乙醇脱氢酶基因AdhE的表达量则没有明显表达差异。突变株Rx1 Aack的pk、ldh和ack基因表达量都上调三倍,AdhE的表达量没有显著差异。在控制pH值条件下,野生型Rx1的丙酮酸激酶PK的活性提高了 88%,而乙醛脱氢酶ALDH和乙醇脱氢酶ADH的活性分别下降了 39%和51%,乙酸激酶ACK和乳酸脱氢酶LDH(pH=5.3)的活性则没有显著变化。突变株Rx1 Δack的PK、LDH和ALDH的酶活性分别提高18%、37%和31%,ADH活性没有显著变化,与之前的报道相同,突变株仍然保留部分乙酸激酶活性,但控制pH值的条件没有对突变株乙酸激酶活性造成任何的影响。另外,LDH在较低pH值时有较高的活性,在测定pH=7.3条件下LDH只有测定pH=5.3条件下50%以下的活性。该结果阐明了发酵实验中在控制pH值条件下乳酸产量下降,而乙醇产量相对提高的机理。***1菌株基因敲除遗传操作系统构建的探索。通过体外酶切实验证实了*** Rx1胞内存在可以降解外源DNA的限制性内切酶,通过对比该酶的蛋白序列,初步确定该酶属于二型限制性内切酶DpnⅡ。通过甲基化转移酶的甲基化可以使质粒或者DNA防止被内切酶降解。自身带有的甲基化酶的质粒宿主如E.

关键词：高温厌氧菌基因敲除转录组 pH值调控机理

高温厌氧菌CBZ-S-MEE2利用不同碳源发酵产氢的研究

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中国酿造 2012年第9期31卷 66-70页

作者：于雷高猛张作明任浩张凤吉林农业大学食品科学与工程学院吉林长春130118 吉林大学生命科学学院分子酶学工程教育部重点实验室吉林长春130112 吉林大学化学学院超分子结构与材料国家重点实验室吉林长春130112

以从长白山温泉中分离的一株高温厌氧产氢菌CBZ-S-MEE2为菌种,对该菌利用不同碳源发酵产氢进行研究。利用葡萄糖进行发酵产氢时,最大产气速率为180mL(/L.h),产氢效率为1.8mol H2/mol葡萄糖,表明该菌可以快速利用葡萄糖发酵产氢,对葡萄... 详细信息

以从长白山温泉中分离的一株高温厌氧产氢菌CBZ-S-MEE2为菌种,对该菌利用不同碳源发酵产氢进行研究。利用葡萄糖进行发酵产氢时,最大产气速率为180mL(/L.h),产氢效率为1.8mol H2/mol葡萄糖,表明该菌可以快速利用葡萄糖发酵产氢,对葡萄糖的转化效率高。对未经预处理纤维素和以纤维素为主要成分的碳源进行发酵时,该菌在硫元素缺失或pH偏碱性的状态下不能充分的生长,产氢速率低。在改进试验中,通过维持较好的硫元素平衡,以纤维素为唯一碳源发酵时,最大产气速率为77mL(/L.h),产氢效率为7.5mol H2/gVS。表明高温厌氧菌CBS-Z-MEE2可以利用未经预处理的纤维素原料为唯一碳源进行发酵产氢,这为以纤维素为主要成分的生物质发酵产氢奠定了技术基础。

关键词：产氢高温厌氧菌纤维素碳源

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高温厌氧菌分解纤维素的研究

大连轻工业学院学报 1998年第3期17卷 63-67页

作者：张春枝王振宇陈莉金凤燮大连轻工业学院食品工程系

研究了高温厌氧菌ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｏｐｒｉａｅＪＴ３３和ＪＴ１分解纤维素的机制，并研究了葡萄糖对代谢产物的影响。结果表明：纤维素（ＭＮ３００）能够被ＪＴ３３菌在７ｄ内完全水解，稻草能够被ＪＴ１菌... 详细信息

研究了高温厌氧菌ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｏｐｒｉａｅＪＴ３３和ＪＴ１分解纤维素的机制，并研究了葡萄糖对代谢产物的影响。结果表明：纤维素（ＭＮ３００）能够被ＪＴ３３菌在７ｄ内完全水解，稻草能够被ＪＴ１菌部分水解。纤维素或稻草的分解产物分别为乙醇、乙酸和丁酸。０．２％～０．５％的葡萄糖能促进代谢产物的生成。

关键词：纤维素分解高温厌氧菌代谢产物 JT3-3 JT1

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生化高温厌氧菌的——驯化与节能

资源节约与环保 2006年第4期22卷 60-61页

作者：石拥军天铁集团焦化厂回收车间河北涉县056404

本文通过对生化高温厌氧菌驯化过程的摸索,提高了污水处理效果,进一步降低了生化外排水指标,同时节约了大量冷却水及耗电量。

关键词：焦化污水高温厌氧菌厌氧池好氧池

高温厌氧细菌混合培养对纤维素酒精生产的提高作用

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环境科学 2010年第4期31卷 1059-1065页

作者：方治国浙江工商大学环境科学与工程学院杭州310012

以高温厌氧细菌热纤维梭菌(Clostridium thermocellum LQRI)和嗜热厌氧乙醇菌(Thermoanaerobacter ethanolicus X514和Thermoanaerobacter pseudoethanolicus39E)为对象,以纤维素为微生物利用的底物,分析了LQRI纯培养和LQRI+Thermoanaerobacter混合培养对纤维素降解、酒精生产及终产物分布的影响.结果表明,LQRI+Thermoanaerobacter混合培养的酒精生产能力和纤维素降解率明显高于LQRI纯培养.在混合培养体系中,LQRI+X514的酒精生产能力明显高于LQRI+39E.培养基中无外源酵母粉条件下,LQRI纯培养酒精最高浓度约为11.5mmol/L,LQRI+X514和LQRI+39E混合培养最高酒精浓度分别约为71mmol/L和36.5mmol/L,相同的底物纤维素浓度条件LQRI+X514和LQRI+39E混合培养酒精浓度分别约为LQRI纯培养的5～11倍和3～5倍,纤维素降解率分别都约为LQRI纯培养的1.5～5.0倍;培养基中0.6%外源酵母粉存在条件下,LQRI纯培养酒精最高浓度约为12.9mmol/L,LQRI+X514和LQRI+39E混合培养最高酒精浓度分别约为263.5mmol/L和143.5mmol/L,相同的底物纤维素浓度条件LQRI+X514和LQRI+39E混合培养酒精浓度分别约为LQRI纯培养的8～22倍和8～12倍,纤维素降解率均约为LQRI纯培养的1.1倍.在5%Solka Floc为底物和0.6%外源酵母粉的条件下,LQRI+X514混合培养酒精浓度最高可达到263.5mmol/L,相当于1.2%(质量浓度)的酒精,LQRI+39E约为143mmol/L.

关键词：纤维素酒精高温厌氧菌混合培养生物能源酒精发酵

ack基因敲除对Thermoanaerobacterium calidifontis Rx1发酵代谢的影响

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中国生物工程杂志 2015年第7期35卷 37-44页

作者：申冬玲尚淑梅李卫娜严金平伊日布斯昆明理工大学生命科学与技术学院昆明650500 长江师范学院生命科学与技术学院重庆408100

为提高嗜热厌氧菌*** Rx1的乙醇产率,通过同源重组的方式敲除Rx1乙酸生成途径的乙酸激酶(ack)基因,得到了代谢工程菌Δack突变株。分别以葡萄糖、纤维二糖、木糖和玉米芯酸水解液为底物,研究突变菌株的底物利用、细胞生长和发酵产物的... 详细信息

为提高嗜热厌氧菌*** Rx1的乙醇产率,通过同源重组的方式敲除Rx1乙酸生成途径的乙酸激酶(ack)基因,得到了代谢工程菌Δack突变株。分别以葡萄糖、纤维二糖、木糖和玉米芯酸水解液为底物,研究突变菌株的底物利用、细胞生长和发酵产物的变化情况。结果表明,与野生菌株相比,突变菌株的干重都有所降低,但是乳酸或乙醇的得率显著提高;当以纤维二糖为底物时,突变菌株的乙醇产量达3.60g/L,得率为0.55g/g,远高于突变菌株对其它底物的产量;以玉米芯水解液为底物时,突变菌株的乳酸产量高于野生菌株,而且野生菌乳酸、乙醇的产量都高于以木糖为底物时的产量。

关键词：高温厌氧菌基因敲除乙醇发酵

pH对Themoanaerobacterium calidifontis Rx1乙醇发酵代谢的影响

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基因组学与应用生物学 2019年第9期38卷 4086-4093页

作者：祁腾飞吴铭杰严金平伊日布斯昆明理工大学生命科学与技术学院

Themoanaerobacterium calidifontis Rx1 是一株能降解半纤维素发酵乙醇的高温厌氧菌。本研究以Rx1 和其乙酸激酶基因(ack)敲除的突变菌株Rx1 △ack 作为研究对象,研究了不同pH 值条件对两种菌株生长与代谢的影响,并通过测定碳中心代谢... 详细信息

Themoanaerobacterium calidifontis Rx1 是一株能降解半纤维素发酵乙醇的高温厌氧菌。本研究以Rx1 和其乙酸激酶基因(ack)敲除的突变菌株Rx1 △ack 作为研究对象,研究了不同pH 值条件对两种菌株生长与代谢的影响,并通过测定碳中心代谢关键酶的表达量与酶活性分析了pH 的代谢调控机制。结果表明,与自然pH相比,控制pH 能够改变两种菌株的代谢产物分布;当控制pH 值为7.0 时,Rx1 和Rx1 △ack 的乳酸产量分别下降了85.7%和89.9%,而乙醇产量分别提高了60%和69%;Rx1 和Rx1 △ack 乙酸产量的变化趋势不同。与自然pH 相比,控制pH 时,Rx1 和Rx1 △ack 的丙酮酸激酶(PK)基因表达量和酶活性都有所提高;野生型菌株的乙酸激酶(ACK)活性下降11%,而突变菌株基因表达量显著提高,酶活性只有野生型的25%,且与自然pH 条件相比,有提高的的趋势;野生型菌株乙醇代谢途径中乙醇脱氢酶(ADH)活性显著下调;研究发现pH 对Rx1 和Rx1 △ack 乳酸代谢途径中乳酸脱氢酶(LDH)影响十分显著,在弱碱或中性条件下,其活性还不足酸性条件下的一半。Rx1 和Rx1 △ack 在控制pH条件下乳酸产量下降,同时伴随乳酸生成途径的还原力(即NAD(P)H)积累,而乙醇生成途径可将积累的NAD(P)H 氧化成NAD(P)+,这可能是控制pH条件下乙醇产量提高的原因。

关键词：高温厌氧菌乙醇发酵 pH值代谢调控

1986年全国发酵工程学术讨论会部分论文摘要

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中国生物工程杂志 1987年第1期 80-89页

作者：江北

1986年11月18日到22日在无锡由中国食品科学技术学会、中国微生物学会、中国生化学会、无锡轻工业学院四家联合召开了全国发酵工程学术讨论会。我们选取了部分有关研究进展、综述文章的论文摘要在本期刊登。其中一些文章的全文将陆续在... 详细信息

1986年11月18日到22日在无锡由中国食品科学技术学会、中国微生物学会、中国生化学会、无锡轻工业学院四家联合召开了全国发酵工程学术讨论会。我们选取了部分有关研究进展、综述文章的论文摘要在本期刊登。其中一些文章的全文将陆续在本刊上发表。

关键词：己酸菌啤酒酿造酒精厂微生物发酵浓香型曲酒固体酒糟调味酒高温厌氧菌酒精发酵发酵产品大网格吸附剂生物工程生物学学术讨论会运动发酵单胞菌菌种选育半连续发酵浓香型白酒大曲酒上海生化所论文摘要