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高渗胁迫对玉米大斑病菌生长发育的影响及菌丝细胞中渗透调节物质的分析

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中国农业科学 2017年第10期50卷 1930-1937页

作者：巩校东刘星晨赵立卿郑亚男范永山韩建民谷守芹董金皋河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室唐山师范学院生命科学系

【目的】了解不同高渗胁迫条件对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)菌丝发育及胞内黑色素含量的影响,明确在病菌菌丝细胞中起主要作用的渗透调节物质的种类及这些物质在不同高渗胁迫条件下的变化规律。【方法】采用3种不同浓度梯度(0.... 详细信息

【目的】了解不同高渗胁迫条件对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)菌丝发育及胞内黑色素含量的影响,明确在病菌菌丝细胞中起主要作用的渗透调节物质的种类及这些物质在不同高渗胁迫条件下的变化规律。【方法】采用3种不同浓度梯度(0.4、0.8、1.2 mol·L-1 Na Cl)的高渗胁迫条件处理玉米大斑病菌,分析高渗胁迫对菌落生长、菌丝发育及菌丝胞内黑色素含量的影响;利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)技术测定3种高渗浓度处理下菌丝细胞中甘油、赤藓醇、葡萄糖、甘露醇、海藻糖5种多羟基醇的含量并分析其随时间变化的规律。【结果】与在普通PDA培养基上的病菌相比,在高渗胁迫条件下病菌菌落生长速率明显降低,菌丝细胞间隔变短、细胞显著膨大,且随胁迫浓度增加细胞膨大程度增强;高渗胁迫下的菌株在各个时间点的胞内黑色素含量与对照相比有明显差异,其中高渗处理12 h之前样品中黑色素的含量均比对照组低,但不同处理之间含量均很接近;而在24、48 h两个时间点不同处理浓度对黑色素的影响不同,1.2 mol·L-1Na Cl处理下与对照相比黑色素含量均显著增加,0.8 mol·L-1 Na Cl处理下与对照相比黑色素含量降低,0.4 mol·L-1Na Cl处理下样品的黑色素含量与对照相比在24 h时显著降低,但48 h时与对照基本一致;在不同的高渗胁迫条件下(0.4、0.8、1.2 mol·L-1 Na Cl)菌丝细胞中甘露醇的含量均有随处理时间延长而增加的趋势,在处理时间为36 h时甘露醇含量较对照增加最为明显,具有显著性差异;菌丝中甘油含量的变化与甘露醇的变化规律相似,且在高渗胁迫处理下甘油含量增加幅度更加明显,并在处理24 h后甘油含量较对照显著增加;菌丝中海藻糖含量总体上有随时间延长而降低的趋势,且渗透胁迫的强度越高该趋势越明显,不同浓度Na Cl处理的菌丝中海藻糖含量均在36 h与对照相比显著降低;而赤藓醇、葡萄糖的含量与对照相比没有显著变化;在普通PD培养基或高渗处理条件下,菌丝培养滤液中均没有检测到甘露醇、海藻糖和甘油的存在,而培养基中葡萄糖的含量随高渗胁迫浓度的增加而减少。【结论】高渗胁迫抑制了玉米大斑病菌菌落的生长,使菌丝细胞膨大、间隔变短;高渗胁迫处理病菌12 h之前对菌丝胞内黑色素含量均有明显的抑制作用;甘露醇、甘油为病菌菌丝细胞中的主要渗透调节物质,海藻糖也参与了病菌的高渗胁迫反应。

关键词：玉米大斑病菌高渗胁迫生长发育渗透调节物质

高渗胁迫后橡胶树萌发籽苗抗旱性主成分及隶属函数分析

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中国农学通报 2010年第1期26卷 260-264页

作者：曾宪海安锋蔡明道陈俊明林位夫中国热带农业科学院橡胶研究所海南儋州571737

利用NaCl、PEG6000、甘露醇模拟高渗胁迫条件,对RRIM600巴西橡胶树种子进行浸种处理7天,测定了不同浸种处理橡胶树萌发籽苗的多项生理指标,并应用主成分及隶属函数分析法对影响橡胶树苗期抗旱性的主要生理指标和不同浸种处理橡胶树萌发... 详细信息

利用NaCl、PEG6000、甘露醇模拟高渗胁迫条件,对RRIM600巴西橡胶树种子进行浸种处理7天,测定了不同浸种处理橡胶树萌发籽苗的多项生理指标,并应用主成分及隶属函数分析法对影响橡胶树苗期抗旱性的主要生理指标和不同浸种处理橡胶树萌发籽苗的抗旱性进行了分析评价。结果表明:与橡胶树苗期抗旱性关系最密切的生理指标有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、可溶性糖(SS)、脯氨酸(PRO)、过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2-);不同浸种处理橡胶树萌发籽苗抗旱性强弱依次为:甘露醇(10%)>PEG6000(15%)>NaCl(3%)>甘露醇(15%)>PEG6000(25%)>甘露醇(20%)>NaCl(2%)>NaCl(4%)>PEG6000(35%)>甘露醇(20%)。

关键词：高渗胁迫巴西橡胶树抗旱性

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高渗胁迫下啤酒酵母的生理特性研究

中国酿造 2008年第5期 45-47页

作者：王继花薛永常高圣汤佳鑫俞志敏赵长新辽宁省发酵工程重点实验室大连工业大学生物与食品工程学院辽宁华润雪花啤酒丹东有限公司

研究了0.3 mol/L、0.6 mol/L、1.0 mol/L的氯化钠对啤酒酵母活细胞数、细胞形态、糖代谢、pH值、菌体蛋白的影响。细胞动力学结果表明:随着NaCl浓度的增加,细胞的渗透胁迫加剧,细胞收缩。与对照组比较0.6 mol/L NaCl、1.0 mol/L NaCl延... 详细信息

研究了0.3 mol/L、0.6 mol/L、1.0 mol/L的氯化钠对啤酒酵母活细胞数、细胞形态、糖代谢、pH值、菌体蛋白的影响。细胞动力学结果表明:随着NaCl浓度的增加,细胞的渗透胁迫加剧,细胞收缩。与对照组比较0.6 mol/L NaCl、1.0 mol/L NaCl延长细胞对数生长期,减缓葡萄糖消耗速率,且分别在2h～4h、6h～8h内出现糖代谢停滞,但并不影响细胞的增殖。在生理可接受的渗透范围内,与对照组比较0.3 mol/L NaCl基本上不影响啤酒酵母的生物量、糖代谢速率和pH值。说明该菌株有较高的抗高渗能力。随着NaCl浓度的升高,渗透胁迫加剧,耐高渗有关的蛋白开始表达。

关键词：啤酒酵母氯化钠高渗胁迫菌体蛋白

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高渗胁迫下啤酒酵母的生理特性研究

中国酿造 2008年第3期27卷 45-48页

作者：王继花薛永常高圣汤佳鑫俞志敏赵长新辽宁省发酵工程重点实验室大连工业大学生物与食品工程学院辽宁大连116034 辽宁华润雪花啤酒丹东有限公司辽宁丹东118001

关键词：啤酒酵母氯化钠高渗胁迫菌体蛋白

高渗胁迫下拟南芥信号通路中关键基因的筛选与研究

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高渗胁迫下拟南芥信号通路中关键基因的筛选与研究

作者：杨本光杭州师范大学

学位级别：硕士

水是植物生存所必需的物质,干旱限制植物的生长发育,严重时会导致植物死亡。干旱胁迫日益成为限制农业发展的主要因素,对植物干旱胁迫应答机制的研究,对农业发展有重要的意义。钙离子作为重要的第二信使,在植物感知到干旱胁迫后,胞内钙... 详细信息

水是植物生存所必需的物质,干旱限制植物的生长发育,严重时会导致植物死亡。干旱胁迫日益成为限制农业发展的主要因素,对植物干旱胁迫应答机制的研究,对农业发展有重要的意义。钙离子作为重要的第二信使,在植物感知到干旱胁迫后,胞内钙离子快速激增,进而将信号级联传导至下游,诱导胁迫相关基因应答。然而对于植物如何感受干旱胁迫的研究尚有诸多疑问,本课题利用正向遗传学的方法,筛选参与干旱响应相关的基因,对植物抗逆研究具有一定的借鉴意义。本课题对实验室前期从拟南芥EMS诱变库筛选到的突变体9f8进行研究,利用瞬时的高渗处理,实时检测植物体内钙信号的变化,挑选出高渗胁迫下钙信号缺失突变体的候选植株。突变体与野生型进行回交,进行多轮钙表型筛选以构建F3代图位克隆群体。高渗胁迫下,突变体相比野生型对高渗胁迫的响应存在缺陷,F3回交群体存在3:1亮暗的分离比例。说明是单基因突变导致钙信号的缺失。通过钙信号特异性实验分析,9f8对高渗胁迫的响应存在缺陷,但对NaCl和CaCl等离子胁迫、氧化胁迫以及低温胁迫均能够正常响应,说明9f8是高渗特异性突变体。在低钙胁迫下和高渗胁迫下的生理实验中,9f8相比野生型对低钙和高渗更为敏感,表现出地下部分根长更短的表型,这说明突变体在响应低钙和高渗胁迫时,调控自身生长发育能力的缺失。在1/2MS培养基上,突变体的萌发速率也低于野生型,说明该基因可能在种子感知外界水分以及调控种子萌发上发挥作用。对F3群体进行二代基因组重测序,并绘制染色体的单核苷酸突变频率峰图。通过设计分子标记进行图位克隆,挑选出四个候选基因。通过测序或设计分子标记来验证是否发生突变,排除其中两个基因,将剩余的两个基因分别命名为osmo9f8a和osmo9f8b,并构建候选基因的表达载体,农杆菌侵染获得转基因互补材料。通过对两个候选基因T3纯合子进行钙成像实验,生理实验以及萌发实验,确定了突变体存在的缺陷是由osmo9f8a单个核苷酸突变导致的。对osmo9f8a进行组织定位分析,其在拟南芥幼苗的叶片以及种子的表达与生理功能相符。订购osmo9f8a的T-DNA材料,并鉴定到基因敲除的纯合子,可以后续用于对钙表型和长期生理分析,进一步对该基因的功能进行研究。综上所述,本实验通过正向遗传学筛选到一个能够参与拟南芥感受渗透胁迫信号途径相关的突变体,并完成了候选基因的互补试验。接下来研究清楚该基因如何调控钙信号的传导并参与植物抗逆响应,对提高作物的抗旱性具有重要的意义。

关键词：钙信号高渗胁迫图位克隆互补实验

高渗胁迫和灌流培养策略对提高HEK293细胞重组腺病毒载体产量的适用性研究

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高渗胁迫和灌流培养策略对提高HEK293细胞重组腺病毒载体产量的适...

作者：张卓曦江南大学

学位级别：硕士

由于世界范围内各种疾病的肆虐,国际市场对重组腺病毒载体(Recombinant adenoviral vector,Re-Adv)疫苗的需求量大幅提升,为满足市场需求,急需提高Re-Adv产量的方法,而工艺研究是解决这一问题的有效手段。灌流培养已被广泛应用于Re-Adv... 详细信息

由于世界范围内各种疾病的肆虐,国际市场对重组腺病毒载体(Recombinant adenoviral vector,Re-Adv)疫苗的需求量大幅提升,为满足市场需求,急需提高Re-Adv产量的方法,而工艺研究是解决这一问题的有效手段。灌流培养已被广泛应用于Re-Adv的生产,在当前成熟的生物医药生产设备的加持下,单位培养体积的Re-Adv产量已经远高于传统的分批培养。渗透压作为哺乳动物无血清培养基的关键理化性质参数,在接毒前的细胞生长阶段施加高渗胁迫可以显著提高分批培养模式下的Re-Adv产量。由于该高渗胁迫工艺的生产模式仍停留在分批培养,受到名为“细胞密度效应”的限制,因此其产量提升比例远不及灌流培养。将灌流培养与高渗胁迫工艺相结合有望进一步提升高细胞密度生产过程中的Re-Adv产量。本课题利用摇瓶结合拟灌流培养作为生物反应器灌流培养的缩小模型,选取接毒时刻的活细胞密度(TOI)、感染复数(MOI)、p H和病毒收获时间(Har)为关键过程参数,通过实验设计确定了关键过程参数与关键质量属性(收获时刻Re-Adv的病毒滴度(IFU))之间的关系。在得到设计空间(p H为7.13～7.20、TOI为1.2～1.5×10cells·m L、MOI为2.0～4.8 IFU·cell、Har为48～56 hpi)后利用其鲁棒性设置点(p H=7.15、TOI=1.26×10 cells·m L、MOI=3.6 IFU·cell、Har=53.3 hpi)进行后续的实验研究。在Re-Adv生产过程中施加高渗胁迫的实验结果显示,在细胞生长阶段使用高渗透压培养基(370 m Osm),在病毒生产阶段使用等渗透压培养基(300 m Osm)的灌流培养工艺有效地提高了Re-Adv的产量,进一步研究发现这可能归因于病毒复制后期热休克蛋白70的表达量增加。将这种工艺放大至3 L生物反应器中,Re-Adv的产量达到3.2×10IFU·m L,为等渗灌流培养工艺的3倍。因此,高渗胁迫工艺与灌流培养相结合的策略可以有效地提高Re-Adv的产量。本研究首次将高渗胁迫工艺与灌流培养相结合的策略应用于Re-Adv生产,同时揭示了高渗胁迫工艺增产Re-Adv的原因,也为HEK293细胞生产其他病毒的工艺优化提供了借鉴。

关键词：高渗胁迫灌流培养 HEK293细胞重组腺病毒载体

高渗胁迫对玉米大斑病菌生长发育及致病性的影响及其调控机制

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高渗胁迫对玉米大斑病菌生长发育及致病性的影响及其调控机制

作者：刘星晨河北农业大学

学位级别：硕士

本实验室前期研究发现,高渗胁迫影响玉米大斑病菌菌落形态及菌丝的发育,但高渗胁迫对病菌生长发育及致病性的影响方面尚缺乏系统研究。本研究拟在前期研究基础上,阐明高渗胁迫对病菌生长发育及致病性的影响及其分子机制。1.高渗胁迫不... 详细信息

本实验室前期研究发现,高渗胁迫影响玉米大斑病菌菌落形态及菌丝的发育,但高渗胁迫对病菌生长发育及致病性的影响方面尚缺乏系统研究。本研究拟在前期研究基础上,阐明高渗胁迫对病菌生长发育及致病性的影响及其分子机制。1.高渗胁迫不仅影响病菌菌丝形态,也影响病菌分生孢子的形态及产量。在高渗培养条件下,野生型菌株01-23菌落生长受到显著抑制;病菌气生菌丝和基生菌丝均明显缩短膨大;分生孢子产量显著降低。在PDA培养基中添加0.4 M NaCl及0.4 M KCl的培养条件下,分生孢子形态无明显变化,但在PDA培养基中添加0.6 M山梨醇的培养条件下,分生孢子长度显著增大。2.高渗胁迫增强了病菌细胞的膜泡化运输,增加了细胞壁外分泌物质的产生。将病菌接种在添加0.4 M NaCl的PDA培养基中培养3 d,之后利用透射电镜观察发现,细胞内膜泡状结构明显增多,细胞壁外絮状分泌物增多。3.高渗胁迫影响病菌分生孢子的侵入丝形成及致病性。将病菌接种在高渗培养基中进行高渗胁迫培养(20 d),之后收集所产生的分生孢子,观察发现,分生孢萌发时间提前,孢子所形成的侵入丝呈束状延伸并快速延长,病菌发病时间提前,致病力增强。另外,将正常培养产生的分生孢子经高渗胁迫处理3 h后,发现病菌侵入丝大部分呈束状延伸,但将正常培养产生的分生孢子经高渗处理30 min后,其分生孢子侵入丝形态未发生显著变化。说明高渗胁迫影响病菌侵入丝的形成及其致病力,其影响作用与处理时间有关。***-MAPK途径参与调控病菌的高渗胁迫反应。将病菌培养在添加0.4 M NaCl的PD培养基中处理,利用RT-qPCR技术分析HOG-MAPK途径及其下游关键基因的表达模式,发现StSTE11、StPBS2、StHOG1、StMSN2、StMSN4、StFPS1、StGPD1、StGPP2均响应高渗胁迫信号,说明这些基因参与了病菌的高渗胁迫反应。***-MAPK途径关键基因StHOG1和StFPS1参与调控病菌附着胞形成及致病性。对StHOG1和StFPS1突变体的分析发现,病菌不能穿透玻璃纸,且不能形成附着胞。***-Seq数据分析发现细胞中5个ABC转运蛋白基因参与响应高渗胁迫信号和侵染过程。

关键词：玉米大斑病菌 MAPK 高渗胁迫侵染结构致病性

砧用南瓜幼苗根系表型分析及高渗胁迫耐受性评价

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中国蔬菜 2024年第6期 65-73页

作者：张棣莛张梦夏尚庆茂三亚中国农业科学院国家南繁研究院海南三亚572024 中国农业科学院蔬菜花卉研究所蔬菜生物育种全国重点实验室北京100081

为探究砧用南瓜苗期根系形态指标、总糖含量与其耐高渗胁迫的相关性,以及高渗胁迫下髓腔发育情况,以16个砧用南瓜品种为试材,采用根系扫描法测定播种后14 d幼苗根系表型参数并提取根系构型,测定根系总糖含量,利用主成分分析、单因素方... 详细信息

为探究砧用南瓜苗期根系形态指标、总糖含量与其耐高渗胁迫的相关性,以及高渗胁迫下髓腔发育情况,以16个砧用南瓜品种为试材,采用根系扫描法测定播种后14 d幼苗根系表型参数并提取根系构型,测定根系总糖含量,利用主成分分析、单因素方差分析等筛选根系性状差异较大品种并测定其高渗胁迫下茎叶及根系生长指标、总糖含量和髓腔发育情况,综合评价砧用南瓜幼苗对高渗胁迫的耐受性。结果表明:16个品种幼苗根系表型参数经PCA降维后显示黑籽南瓜和嘉藤青木具有较大差异,黑籽南瓜的总根长、根表面积和根系分叉数等9个根系表型指标及根系总糖含量均显著高于嘉藤青木;经高渗胁迫处理后,黑籽南瓜茎叶及根系生长指标显著优于嘉藤青木,且根系总糖含量在持续高渗胁迫处理15 d后仍能保持相对稳定,下胚轴髓腔发育也对高渗胁迫较不敏感。根系主要形态指标和总糖含量可作为筛选耐高渗胁迫砧木的重要参考指标;黑籽南瓜综合评价最高,对高渗胁迫表现出较强的耐受性,是能适应一定高渗胁迫环境的优良砧木。

关键词：南瓜砧木高渗胁迫根系总糖含量髓腔

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玉米大斑病菌StFPS1参与病菌高渗胁迫及细胞壁发育机制初探

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玉米大斑病菌StFPS1参与病菌高渗胁迫及细胞壁发育机制初探

作者：张盼河北农业大学

学位级别：硕士

本课题组在前期研究中利用生物信息学手段初步明确了在玉米大斑病菌中存在4条MAPK级联途径,其中HOG-MAPK途径主要参与调控病菌的高渗胁迫反应。继而,克隆了玉米大斑病菌水甘油通道蛋白基因St FPS1,并利用RNAi及基因敲除技术初步阐明了... 详细信息

本课题组在前期研究中利用生物信息学手段初步明确了在玉米大斑病菌中存在4条MAPK级联途径,其中HOG-MAPK途径主要参与调控病菌的高渗胁迫反应。继而,克隆了玉米大斑病菌水甘油通道蛋白基因St FPS1,并利用RNAi及基因敲除技术初步阐明了基因的功能。本研究在此基础上,利用基因敲除技术再次创制St FPS1基因的2株敲除突变体,通过比较突变体与野生型菌株在生长发育、细胞壁发育及对高渗胁迫的反应,进一步明确该基因的功能。主要研究结果如下:1、获得了玉米大斑病菌St FPS1基因敲除突变体。验证了前期研究中构建的玉米大斑病菌St FPS1基因敲除载体,并将该载体转化玉米大斑病菌野生型菌株原生质体;利用潮霉素抗性筛选获得了2株表型稳定的抗性转化子;通过特异引物PCR、RT-PCR等技术证实了这2株抗性转化子为St FPS1基因敲除突变体。2、St FPS1基因影响玉米大斑病菌菌丝细胞的形态建成及分生孢子发育。与野生型菌株相比,St FPS1基因敲除突变体在PDA培养基上生长速度降低,菌丝细胞长度增加并出现弯曲膨大现象,几乎不产生分生孢子。表明,St FPS1基因不仅影响菌丝发育,也影响分生孢子发育。3、St FPS1基因参与玉米大斑病菌菌丝细胞的高渗胁迫反应。在高渗胁迫条件下,与野生型菌株相比,突变体菌丝细胞膨大;菌丝细胞内甘油含量显著增加;生长速率受抑制程度低,St FPS1基因敲除突变体对高渗胁迫条件的耐受力明显提高。表明,St FPS1基因参与病菌高渗胁迫反应,是一种调控因子。进一步检测外高渗胁迫条件下突变菌株中调控甘油合成的关键基因(St GPD1、St HOR2)的表达水平变化,发现2个基因的表达水平比正常培养条件下升高,但未达到野生型菌株中基因的表达水平。基于此,推测玉米大斑病菌中水甘油通道蛋白St FPS1的缺失、甘油的外排受阻是细胞甘油含量升高及突变体提高其耐受高渗胁迫条件的主要原因。4、透射电镜观察发现,与野生型菌株相比,St FPS1基因敲除突变体的细胞壁明显变薄;Real-time RCR技术分析发现突变体中细胞壁合成相关基因St CHS1、St CHS2、St CHS2、St Rho1的表达量均降低,且突变体对细胞壁合成干扰物质的敏感性降低。结果表明,St FPS1基因参与调控病菌细胞壁的形态建成。5、渗胁迫条件下,野生型和突变体菌株细胞壁均增厚,但突变体显著增厚。细胞壁合成基因(St CHS1、St CHS2、St CHS3、St Rho1)表达水平明显增加,表明在高渗胁迫条件下,细胞壁增厚是病菌耐受高渗胁迫条件的重要反应之一。6、玉米大斑病菌St FPS1基因对HOG-MAPK途径和CWI-MAPK级联途径均具有一定影响。本研究发现在St FPS1基因敲除突变体中HOG-MAPK和CWI-MAPK途径的关键基因St HOG1、St SLT2表达量均呈现显著下降。因此,St FPS1基因的缺失降低了St HOG1、St SLT2基因的表达水平,降低了细胞壁合成酶基因的表达水平,是细胞壁合成受阻,是胞壁变薄。7、玉米大斑病菌St FPS1基因参与病菌的氧胁迫及温度胁迫反应。

关键词：玉米大斑病菌 StFPS1 高渗胁迫细胞壁水甘油通道