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生长抑素(SS)基因在pET-32表达系统中的高效表达

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南京农业大学学报 2003年第1期26卷 61-65页

作者：刘永庆刘文波潘杰彦杜念兴陈溥言赵国屏南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095 中国科学院上海生物工程研究中心上海200233

分别将SS基因克隆至pET 32a和pET 32c表达系统中 ,得到重组质粒SS N/X和SS N/S。实验结果表明 ,SS N/X Thioredoxin (硫氧还原蛋白 )和SS N/S Thioredoxin融合蛋白在IPTG (异丙基硫代 β D半乳糖苷 )诱导 3h后(37℃ )表达产量最高 ,约... 详细信息

分别将SS基因克隆至pET 32a和pET 32c表达系统中 ,得到重组质粒SS N/X和SS N/S。实验结果表明 ,SS N/X Thioredoxin (硫氧还原蛋白 )和SS N/S Thioredoxin融合蛋白在IPTG (异丙基硫代 β D半乳糖苷 )诱导 3h后(37℃ )表达产量最高 ,约占菌体总蛋白的 30 %左右。 0 0 5～ 1mmol·L-1IPTG对SS融合蛋白表达产量的影响并不太大 ,0 0 5mmol·L-1IPTG即可达到有效的诱导效果 ,但单位体积内的表达产量以 0 5mmol·L-1时为最高。乳糖诱导 4h(37℃ )的效果明显低于IPTG ,但当培养时间延长至 8h时 ,2 0mg·mL-1的乳糖可达到与IPTG同样的诱导效果 ,10和 5mg·mL-1的乳糖也可接近IPTG的诱导效果。SS N/X融合蛋白在 2 6℃表达时 ,主要以可溶性形式存在 ,占75 8% ,包涵体仅占 2 4 2 % ;而SS N/S融合蛋白则主要以包涵体形式存在 ,占 6 0 2 % ,可溶性蛋白仅占 39 8%。SS可溶性融合蛋白具有良好的SS抗原性。

关键词：生长抑素基因 pET-32表达系统高效表达异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 IPTG 乳糖融合蛋白动物生长

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菌丝霉素的高效表达、纯化及活性

中国医药工业杂志 2013年第1期44卷 21-26页

作者：梁文胡又佳朱宝泉谢丽萍中国医药工业研究总院上海医药工业研究院创新药物与制药工艺国家重点实验室上海200040

将来自腐生子囊菌中的菌丝霉素成熟肽基因经大肠杆菌密码子优化后,克隆到pET32a(+)载体中,构建了含His-tag标签和TEV酶识别位点的菌丝霉素表达质粒pYG330,使含菌丝霉素的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式高效表达。建立了菌丝霉素的纯化... 详细信息

将来自腐生子囊菌中的菌丝霉素成熟肽基因经大肠杆菌密码子优化后,克隆到pET32a(+)载体中,构建了含His-tag标签和TEV酶识别位点的菌丝霉素表达质粒pYG330,使含菌丝霉素的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式高效表达。建立了菌丝霉素的纯化路线,将融合蛋白进行TEV酶切后脱盐再进行亲和色谱分离,收集目的蛋白冻干浓缩,通过高效液相色谱进一步纯化获得纯度72%的目的多肽。纯化所得菌丝霉素对临床耐药金黄色葡萄球菌M-2和枯草芽孢杆菌有明显的抑菌活性。

关键词：菌丝霉素高效表达分离纯化抑菌活性临床耐药菌

来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达

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微生物学报 2006年第6期46卷 945-950页

作者：黄火清罗会颖柏映国王亚茹姚斌孟昆袁铁铮杨培龙中国农业科学院饲料研究所北京100081

柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)来源的植酸酶是目前报道的比活最高的植酸酶。按照毕赤酵母(Pichiapastoris)对密码子的选择偏向性,对来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因AppA进行了密码子优化改造。改造后的基因AppA(m)按正确的阅读框... 详细信息

柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)来源的植酸酶是目前报道的比活最高的植酸酶。按照毕赤酵母(Pichiapastoris)对密码子的选择偏向性,对来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因AppA进行了密码子优化改造。改造后的基因AppA(m)按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9的α-因子信号肽编码序列3′端,通过电击转化得到重组转化子。通过PCR验证,AppA(m)已整合在酵母染色体上。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,植酸酶得到了高效分泌表达,在5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到3·2mg/mL发酵液,发酵效价达到每毫升发酵液1·4×107IU以上,高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。

关键词：高比活植酸酶基因改造毕赤酵母高效表达

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内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中高效表达研究

农业生物技术学报 2009年第3期17卷 529-535页

作者：吴振芳陈惠曾民吴琦四川农业大学生命科学与理学院

在实现了内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中高效表达的基础上,对表达条件进行了优化研究。根据枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)内切葡聚糖酶基因序列设计引物,采用PCR扩增到获得去除信号肽后约1.4kb的内切葡聚糖酶基因片段。以此片段成功... 详细信息

在实现了内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中高效表达的基础上,对表达条件进行了优化研究。根据枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)内切葡聚糖酶基因序列设计引物,采用PCR扩增到获得去除信号肽后约1.4kb的内切葡聚糖酶基因片段。以此片段成功地构建了pPIC-End载体,并转化至巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。经过MD和MM平板筛选和酶活性测定,获得了高效表达的转化子GS115-pPIC-EndⅠ、GS115-pPIC-EndⅦ和GS115-pPIC-EndⅧ。在摇瓶培养条件下,酵母工程菌表达优化条件:在pH4~8条件下均能稳定表达,诱导起始OD600=5表达水平最高,甲醇诱导最佳浓度为0.5%~1.0%,于250mL以上揺瓶培养对表达有显著的促进作用。三种工程菌在优化条件后诱导培养,酶活性可达860.7、760.3和786.2U,分别为原始菌株酶活(63.78U)的13.5、11.9和12.3倍。SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量约为79.82kD,热稳定性分析表明该酶在65℃保温30min,可保持最高酶活的80%以上。

关键词：枯草芽胞杆菌中性内切葡聚糖酶毕赤酵母高效表达表达条件

来源于麦氏喙枝孢霉的玉米赤霉烯酮水解酶在毕赤酵母中的高效表达及活性分析

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微生物学通报 2020年第7期47卷 2012-2020页

作者：刘文婷梁爱玲刘卫东商娜郭瑞庭张同存郑迎迎天津科技大学生物工程学院天津300457 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308

【背景】玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)及其衍生物是一群具有雌激素活性的霉菌毒素,广泛存在于被霉菌污染的谷物中,造成食品业和畜牧业的巨大损失。利用专一性高的水解酶进行生物转化可有效去除玉米赤霉烯酮。【目的】构建高效表达玉... 详细信息

【背景】玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)及其衍生物是一群具有雌激素活性的霉菌毒素,广泛存在于被霉菌污染的谷物中,造成食品业和畜牧业的巨大损失。利用专一性高的水解酶进行生物转化可有效去除玉米赤霉烯酮。【目的】构建高效表达玉米赤霉烯酮水解酶的酵母系统,以促进玉米赤霉烯酮水解酶的研究和工业应用。【方法】将来源于麦氏喙枝孢霉(RhinocladiellamackenzieiCBS650.93)的Rmzhd基因转入毕赤酵母中,筛选获得高效表达菌株,通过高效液相色谱分析发酵液中重组酶的性质。【结果】发酵液中Rm ZHD对ZEN的酶活力为16.67 U/m L,对α-ZOL的酶活力为9.85 U/m L。SDS-PAGE检测表达产物的分子量,与理论值30.7k D符合,且发酵上清液蛋白纯度高。Rm ZHD的最适p H值为9.6,最适温度为45°C,并具有较好的耐热性。【结论】研究结果为玉米赤霉烯酮水解酶的异源表达及其潜在的工业应用提供了一定的指导。

关键词：玉米赤霉烯酮水解酶毕赤酵母高效表达酶学性质

整体优化的信号肽和人溶菌酶基因在毕赤酵母的高效表达

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江苏农业学报 2018年第1期34卷 20-28页

作者：陈珊珊丁健李鑫刘军贾禄强槐强强孙佼文史仲平江南大学生物工程学院/工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214100 武汉轻工大学生物与制药工程学院湖北武汉430040

人源溶菌酶作为一种天然的抑菌活力物质,在畜牧、医药及食品等行业具有潜在的应用价值。本研究将信号肽序列和人源溶菌酶基因碱基序列作为一个整体进行密码子优化。并在优化的信号肽序列2处位置,共新插入39个碱基,构成增长的优化信号肽... 详细信息

人源溶菌酶作为一种天然的抑菌活力物质,在畜牧、医药及食品等行业具有潜在的应用价值。本研究将信号肽序列和人源溶菌酶基因碱基序列作为一个整体进行密码子优化。并在优化的信号肽序列2处位置,共新插入39个碱基,构成增长的优化信号肽+溶菌酶优化基因。将2种优化的信号肽+溶菌酶基因碱基序列分别插入pPICZαA载体上,并整合到毕赤酵母KM71的基因组上,获得重组子K1(整体优化的α信号肽+人源溶菌酶基因)和K4(整体优化的α信号肽+人源溶菌酶基因又整合了增长信号肽)。摇瓶诱导表达72 h后,离心取上清液,通过Bradford法和比浊法测定发现,K4的蛋白质表达量和酶活力均高于K1。5 L发酵罐下,采用高密度诱导表达策略,诱导54 h后K4的总蛋白质表达量可达3.02 g/L,所表达的人源溶菌酶活力达到324 072.0 U/ml。表明整体优化的α信号肽+人源溶菌酶基因又整合了增长信号肽有利于提高溶菌酶的分泌效率,实现高效表达。

关键词：人源溶菌酶信号肽序列毕赤酵母高效表达

一个承载分子的设计与肽抗生素hPAB-β的高效表达

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第三军医大学学报 2002年第4期24卷 389-392页

作者：饶贤才金晓琳胡晓梅朱军民陈自瑾胡福泉第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程重点实验室重庆400038

目的　通过设计一个承载蛋白分子高效表达肽抗生素hPAB β ,为大量制备hPAB β奠定基础。方法　根据肽抗生素的特性 ,确立 4条设计原则 ,并据此设计一 489bp的承载蛋白编码序列 ,用化学合成法获得该序列并将之克隆到pQE 3 2中构建成表... 详细信息

目的　通过设计一个承载蛋白分子高效表达肽抗生素hPAB β ,为大量制备hPAB β奠定基础。方法　根据肽抗生素的特性 ,确立 4条设计原则 ,并据此设计一 489bp的承载蛋白编码序列 ,用化学合成法获得该序列并将之克隆到pQE 3 2中构建成表达载体 ,进一步将肽抗生素hPAB β基因插入上述表达载体 ,肽抗生素基因位于承载蛋白编码序列 3’ 端 ,两者构成融合基因。将含融合基因的表达载体转化大肠杆菌JM10 9,筛选阳性重组子 ,并用阳性重组子表达融合蛋白。结果　设计的承载蛋白为 163个氨基酸 ,分子量 17668.80 ,等电点 5 .62 1。用承载分子与肽抗生素hPAB β构建的融合蛋白表达载体转化细菌后 ,筛选到 4个阳性重组子 ,均能高效表达肽抗生素融合蛋白 ,融合蛋白的产量占细菌总蛋白的 40 %～ 45 %。结论　设计的承载蛋白分子能够实现肽抗生素的高效表达。

关键词：承载蛋白肽抗生素高效表达 hPAB-β

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融合短肽促进碱性果胶酶的高效表达

食品与生物技术学报 2016年第5期35卷 504-509页

作者：汪明星刘松刘龙堵国成陈坚江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

碱性果胶酶(PGL)是一种重要的工业酶,广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。作者将6种双亲短肽(SAP)融合至PGL N端,以期提高PGL在大肠杆菌中的分泌表达效率。得到一株高产菌株PGL-S1,胞外酶活由129.65 U/m L提高到535.47 U/m L,其他5种短... 详细信息

碱性果胶酶(PGL)是一种重要的工业酶,广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。作者将6种双亲短肽(SAP)融合至PGL N端,以期提高PGL在大肠杆菌中的分泌表达效率。得到一株高产菌株PGL-S1,胞外酶活由129.65 U/m L提高到535.47 U/m L,其他5种短肽则酶活降低。通过SDS-PAGE检测发现,PGL-S1的表达量并没有多大变化,推测可能是催化效率提高引起酶活提高。分析双亲短肽的疏水性指数发现,SAP1的疏水性不同于其他短肽,疏水性是蛋白质发生聚集的主要作用力,能够固定N、C末端,加强与底物的相互作用。推测PGL-S1融合蛋白的表面疏水性提高,促进了对底物的催化效率,具有巨大的工业应用潜力。

关键词：碱性果胶酶双亲短肽高效表达疏水性指数催化效率

7号淀粉酶链霉菌M1033菌株葡萄糖异构酶在大肠杆菌中的高效表达

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生物工程学报 1996年第S1期12卷 102-105页

作者：崔虹刘咸安李澄清伍传金王玉珍王淳牛立文徐洵崔涛中国科学技术大学生物系

从已克隆的含７号淀粉酶链霉菌Ｍ１０３３菌株产葡萄糖异构酶基因的质粒ｐＵＢ中，用ＤｄｅＩ和Ｋｐｎｌ酶解，分离出酶结构基因，以平端方式与大肠杆菌质粒ｐＴ７７连接，构建了重组表达质粒ｐＴＫＤＧＩ。将ｐＴＫＤＧＩ转化到... 详细信息

从已克隆的含７号淀粉酶链霉菌Ｍ１０３３菌株产葡萄糖异构酶基因的质粒ｐＵＢ中，用ＤｄｅＩ和Ｋｐｎｌ酶解，分离出酶结构基因，以平端方式与大肠杆菌质粒ｐＴ７７连接，构建了重组表达质粒ｐＴＫＤＧＩ。将ｐＴＫＤＧＩ转化到特异大肠杆菌寄主Ｋ３８，经４２℃热诱导，所产葡萄糖异构酶占菌体可溶性蛋白３５％。通过ＤＥＡＥ－Ａ５０柱和Ｇ－１５０柱层析，发酵液可获电泳纯蛋白３４ｍｇ／Ｌ。

关键词： 7号淀粉酶链霉菌M1033菌株葡萄糖异构酶(木糖异构酶) 高效表达