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耐盐性Imt1基因表达载体的构建及其在酵母中的高效表达

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中国农业科学 1997年第4期30卷 51-56页

作者：董云洲沈波ＳｔｅｆａｎＨｏｈｍａｎｎＨａｎｓＢｏｈｎｅｒｔ中国农业科学院生物技术研究中心比利时Ｌｅｕｖｅｎ大学分子细胞生物学系美国亚利桑那大学生物化学系

将Ｉｍｔ１（ＩｎｏｓｉｔｏｌＯ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，肌醇甲基转移酶）构建成酵母表达载体ｐＢＤ３，在酵母双突变体ｇｐｄ－（ｇｌｙｃｅｒｏｌ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，３－磷酸甘油... 详细信息

将Ｉｍｔ１（ＩｎｏｓｉｔｏｌＯ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，肌醇甲基转移酶）构建成酵母表达载体ｐＢＤ３，在酵母双突变体ｇｐｄ－（ｇｌｙｃｅｒｏｌ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，３－磷酸甘油脱氢酶）中高效表达，使ｇｐｄ－突变株对氯化钠的耐性由２．５％提高到５．０％。生化分析表明，在每ｍｇ干酵母细胞内积累高达２．２ｎｍｏｌ的Ｏｎｏｎｉｔｏｌ（芒柄醇）含量。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证明了Ｉｍｔ１基因的表达。这一研究为植物耐盐基因工程开辟了一条新途径。

关键词： Imt1基因耐盐性酵母高效表达

枯草芽孢杆菌bioI基因的克隆和高效表达及BioI蛋白的纯化

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2008年第12期36卷 35-40页

作者：龚月生王晶刘锦妮袁新宇姬生跃王俊杨明明西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 武汉阳光广济医药开发有限公司湖北武汉430064 湖北工业大学生物工程学院湖北武汉430064

【目的】克隆和表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)bioI基因并纯化表达产物。【方法】提取***-tilis1A747基因组DNA,从中扩增bioI基因并将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)的表达载体pET-28a(+)上,构建bioI的表达载体pET28a-bioI。将重组质粒pET28a-bioI电转化到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,对表达产物BioI用Ni2+-NAT亲和层析树脂进行纯化,并对纯化蛋白进行波长扫描。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bioI,酶切鉴定结果正确并在大肠杆菌中表达成功,经IPTG诱导8 h后,重组蛋白BioI的表达量占总可溶性蛋白的20%;波长扫描发现,重组蛋白BioI在400 nm处有特征吸收峰。【结论】bioI基因克隆表达成功,其表达产物BioI具有P450蛋白的特征,为蛋白性质的进一步研究和抗体的制备奠定了基础。

关键词：枯草芽孢杆菌 bioI基因大肠杆菌BL21(DE3) 高效表达

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溶葡球菌酶高效表达与应用

中国生物工程杂志 2017年第9期37卷 118-125页

作者：王曦陈熙明浦铜良兰州大学生命科学学院兰州730000 中国科学院西北生态环境研究院兰州730000

溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)是采用基因克隆技术使溶葡球菌酶基因实现外源表达所产生的蛋白质。它是Zn2+依赖的金属蛋白酶,具有肽链内切酶活性,能专一性地水解葡萄球菌细胞壁Gly五肽桥联,使金黄色葡萄球菌(特别是MRSA)细胞壁破裂,达到... 详细信息

溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)是采用基因克隆技术使溶葡球菌酶基因实现外源表达所产生的蛋白质。它是Zn2+依赖的金属蛋白酶,具有肽链内切酶活性,能专一性地水解葡萄球菌细胞壁Gly五肽桥联,使金黄色葡萄球菌(特别是MRSA)细胞壁破裂,达到溶菌杀菌作用,而不产生耐药性。作为一种抗菌剂,在兽药与临床等领域具有巨大的应用潜力。综述对溶葡球菌酶的来源、作用机制、不同表达系统及前景与展望进行综述。

关键词：溶葡球菌酶金黄色葡萄球菌高效表达应用

黄粉虫抗菌肽TmAMP3在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

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昆虫学报 2011年第10期54卷 1111-1117页

作者：唐馨毛新芳热西力·克来木刘忠渊新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室乌鲁木齐830046

昆虫抗菌肽具有广谱抗菌活性,克隆黄粉虫Tenebrio molitor抗菌肽基因,进行原核表达和活性检测,为昆虫抗菌肽推广应用奠定一定基础。根据GenBank公布的黄粉虫抗菌肽序列设计特异引物,以RT-PCR法从黄粉虫体内克隆了抗菌肽基因TmAMP3,将其... 详细信息

昆虫抗菌肽具有广谱抗菌活性,克隆黄粉虫Tenebrio molitor抗菌肽基因,进行原核表达和活性检测,为昆虫抗菌肽推广应用奠定一定基础。根据GenBank公布的黄粉虫抗菌肽序列设计特异引物,以RT-PCR法从黄粉虫体内克隆了抗菌肽基因TmAMP3,将其亚克隆至pET-30a表达载体中,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行原核表达,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达,同时检测生物活性。结果表明我们成功构建了重组质粒pET-30a-TmAMP3,大部分目的蛋白呈可溶性分泌表达。经Ni2+亲和层析,获得较纯融合蛋白HIS-TmAMP3,诱导表达的融合蛋白使BL21转化菌生长受到一定程度的抑制。融合蛋白在100℃煮沸10h、与pH2～12的缓冲液混匀后,依然保持稳定的抗菌活性,具有较强的稳定性。同时检测了融合蛋白对5种菌株的最小抑菌浓度(minimun inhibitory concentration,MIC)。本研究为具有稳定活性抗菌肽进行大规模生产发酵提供了理论基础。

关键词：黄粉虫抗菌肽高效表达蛋白纯化抗菌活性

A型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的高效表达

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卫生研究 1998年第S1期27卷 51-54页

作者：许崇波朱平姚湘燕马从林冯书章解放军农牧大学军事兽医研究所

将含Ａ型产气荚膜梭菌α毒素基因的质粒ｐＫＭＡ１００用核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，经电泳分离、透析袋电洗脱法回收了０．９５ｋｂα毒素基因片段，再将载体ｐＥＴ－２８ｂ（＋）用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，然后... 详细信息

将含Ａ型产气荚膜梭菌α毒素基因的质粒ｐＫＭＡ１００用核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，经电泳分离、透析袋电洗脱法回收了０．９５ｋｂα毒素基因片段，再将载体ｐＥＴ－２８ｂ（＋）用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，然后将处理好的ｐＥＴ－２８ｂ（＋）与０．９５ｋｂ的α毒素基因片段进行连接、转化。经ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切分析和序列分析，证明重组质粒ｐＸＥＴＡ１含有α毒素基因，且具有正确的阅读框架。构建的重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）能表达α毒素，但已经完全丧失其毒性。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层凝胶扫描分析，ＩＰＴＧ诱导后的ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）所表达的目的蛋白占菌体总蛋白的３３．２１％。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析和免疫试验结果表明，表达产物能被α毒素抗血清识别，且免疫小鼠后，用强毒株培养上清攻击，结果免疫小鼠能抵抗至少４ＬＤ１００的攻击，这说明表达产物具有良好的免疫原性。

关键词： A型产气荚膜梭菌 α-毒素基因高效表达免疫原性

假单胞菌海因酶基因在大肠杆菌中的高效表达(英文)

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中国生物化学与分子生物学报 2002年第2期18卷 145-150页

作者：李志强胡卓逸刘景晶中国药科大学生物化学研究室南京210009

为实现利用生物酶转化法进行D 对羟基苯甘氨酸的工业化生产 ,构建了 3株海因酶基因工程菌 .利用PCR技术从恶臭假单胞菌 (Pseudomonasputida)CPU 980 1染色体DNA中扩增得到长约1.8kb的含编码区和自身启动子的海因酶全基因 .通过将海因酶... 详细信息

为实现利用生物酶转化法进行D 对羟基苯甘氨酸的工业化生产 ,构建了 3株海因酶基因工程菌 .利用PCR技术从恶臭假单胞菌 (Pseudomonasputida)CPU 980 1染色体DNA中扩增得到长约1.8kb的含编码区和自身启动子的海因酶全基因 .通过将海因酶全基因插入pMD18 T质粒、海因酶基因的编码区与pET 17 b质粒重组、海因酶基因编码区和T7强启动子一起插入pMD18 T质粒分别得到重组质粒pMD dht、pET dht和pMD T7 dht.将上述重组质粒分别转化大肠杆菌 (Escherichiacoli) ,通过地高辛标记菌落原位杂交和海因酶活力测定两种方法 ,筛选出具有海因酶活力的阳性转化子 .结果表明 ,大肠杆菌的RNA聚合酶能够识别和结合来自恶臭假单胞菌海因酶基因的自身启动子 ,该启动子在大肠杆菌中能够工作 .基因工程菌E .coliBL2 1 pMD dht、E .coliBL2 1 pET dht和E .coliBL2 1 pMD T7 dht的海因酶活力分别为 170 0U L、190 0U L和 2 5 0 0U L ,比野生菌P .putidaCPU 980 1的海因酶活力分别提高了 8倍、9倍和 12倍 .薄层扫描结果显示 ,这些工程菌的海因酶表达量分别约占菌体总可溶性蛋白质的 2 0 %、31%和 5 7%.SDS PAGE显示 ,海因酶的单体分子量约为 5 0kD .经工程菌E .coliBL2 1 pMD T7 dht催化 ,底物对羟基苯海因的转化率在 13h内可达到

关键词：假单胞菌海因酶基因大肠杆菌高效表达

人工转录因子促进外源基因在CHO细胞中的高效表达

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生物工程学报 2007年第1期23卷 21-26页

作者：李世崇叶玲玲杨海刘红许建吴本传黄培堂陈昭烈军事医学科学院生物工程研究所北京100071

以酵母转录因子GALA中1-147位氨基酸序列为构建人工转录因子的DNA结合结构域，单纯疱疹病毒转录激活子VP16中12肽（DALDDFDLDMLG）的4个串联重复作为人工转录因子的功能结构域，用SV40的核定位序列（NLS）将两部分连接起来，构建了人工... 详细信息

以酵母转录因子GALA中1-147位氨基酸序列为构建人工转录因子的DNA结合结构域，单纯疱疹病毒转录激活子VP16中12肽（DALDDFDLDMLG）的4个串联重复作为人工转录因子的功能结构域，用SV40的核定位序列（NLS）将两部分连接起来，构建了人工转录因子GVP4并将其克隆进入表达载体pcDNA3．1/Hygro（＋）中。将不同长度的人工转录因子结合序列构建在外源基因表达载体pcDNA3．1（＋）启动子CMV的上游，分别连接外源基因EGFP和tPA。用表达人工转录因子和外源基因的载体共转染CHO细胞，EGFP和tPA在含不同数量人工转录因子结合位点表达载体pcDNA3．1（＋）转染的CHO细胞中的表达水平呈现不同程度的提高。其中，以引入10个人工转录因子结合位点的表达载体的效果最明显，EGFP和t-PA的表达效率均提高2～3倍。结果表明，人工转录因子能有效地促进外源基因在哺乳动物细胞中的表达。

关键词：人工转录因子 CHO细胞 EGFP t-PA 高效表达

耐热异淀粉酶的高效表达及其在麦芽糖浆制备中的作用

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食品与发酵工业 2016年第7期42卷 23-29页

作者：方安然牛丹丹乔舰吴海洋董自星路福平天津科技大学生物工程学院天津300457 福州大学生物科学与工程学院福建福州350116 天津科技大学化工与材料学院生物化工系天津300457

淀粉酶法制备高麦芽糖浆工艺中，淀粉液化酶、脱支酶以及β-淀粉酶不可或缺，其中脱支酶是决定淀粉转化为麦芽糖的转化率高低的关键因素。在工业上常用的两种脱支酶中，异淀粉酶比普鲁兰酶能更好地协助β-淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖。首... 详细信息

淀粉酶法制备高麦芽糖浆工艺中，淀粉液化酶、脱支酶以及β-淀粉酶不可或缺，其中脱支酶是决定淀粉转化为麦芽糖的转化率高低的关键因素。在工业上常用的两种脱支酶中，异淀粉酶比普鲁兰酶能更好地协助β-淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖。首先通过PCR扩增获得异淀粉酶的编码基因iso并克隆入表达载体pHY—WZX，在枯草芽胞杆菌1A717中获得重组质粒pHY—ISO，将构建好的重组质粒电转化入地衣芽孢杆菌D402中，其摇瓶发酵酶活力达330U／mL，实现了异淀粉酶的异源高效表达。基本酶学特征分析表明：该重组酶适宜反应条件为50～55℃，pH6．5～9．0；K＋、Ca2＋、Mg2＋对酶活有促进作用，其他离子或化合物强烈抑制酶活。HPLC分析表明，该重组异淀粉酶与普鲁兰酶相比，更有助于极高麦芽糖浆的制备。最后通过在线软件对该酶进行同源结构模拟和分析，进一步确定其为异淀粉酶，为后续对其进行分子改造奠定了基础。

关键词：异淀粉酶地衣芽胞杆菌高效表达麦芽糖浆生产同源结构模拟

Stx1A-LHRH融合毒素基因的构建及高效表达

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中国兽医学报 2010年第5期30卷 620-623页

作者：王文东刘军孙洋祝令伟郭学军周博冯书章吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062

通过PCR方法,从肠出血性大肠杆菌O157:H7的基因组DNA中扩增出Stx1A基因序列,并将之与编码LHRH的基因序列连接起来,构建编码Stx1A-LHRH的重组融合基因片段,并定向克隆到表达质粒pET28a的NcoⅠ和EcoRⅠ位点之间,构建重组表达质粒pET28a::s... 详细信息

通过PCR方法,从肠出血性大肠杆菌O157:H7的基因组DNA中扩增出Stx1A基因序列,并将之与编码LHRH的基因序列连接起来,构建编码Stx1A-LHRH的重组融合基因片段,并定向克隆到表达质粒pET28a的NcoⅠ和EcoRⅠ位点之间,构建重组表达质粒pET28a::stx1A-LHRH,将重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3)中。对重组菌株用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明重组菌株表达出了23700的目的融合蛋白Stx1A-LHRH,目的蛋白为包涵体表达,经薄层扫描分析表明表达量约占菌体总蛋白的37.6%。为了将来更好的进行目的蛋白的功能研究,本研究再将融合基因片段克隆到表达质粒pMAL-p2x中实现了重组蛋白的可溶性表达,表达的重组蛋白经amylose亲和层析柱一步纯化后纯度可达93.4%,为下一步进行重组蛋白的活性分析及其生物学作用研究奠定了基础。

关键词：志贺毒素 LHRH 融合毒素高效表达