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苯丙氨酸脱氨酶在乳酸乳球菌NICE系统的高效表达及其实验动物研究

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生物工程学报 2002年第6期18卷 713-717页

作者：张晶刘敬忠谭淑珍贾兴元周艳首都医科大学附属北京朝阳医院基础医学研究中心北京市基因诊断实验室北京100020

为构建苯丙氨酸脱氨酶的一种更新更高表达的基因工程菌 ,取得治疗高苯丙氨酸血症大鼠的更佳疗效。将欧芹PALcDNA重组到质粒pNZ80 48中 ,构建翻译融合载体和转录融合载体 ,分别转化乳酸乳球菌NZ90 0 0。对两种高效表达菌株的酶活性差异... 详细信息

为构建苯丙氨酸脱氨酶的一种更新更高表达的基因工程菌 ,取得治疗高苯丙氨酸血症大鼠的更佳疗效。将欧芹PALcDNA重组到质粒pNZ80 48中 ,构建翻译融合载体和转录融合载体 ,分别转化乳酸乳球菌NZ90 0 0。对两种高效表达菌株的酶活性差异进行比较 ,观察Nisin诱导的动态进程 ,并利用新鲜培养的p(NZ80 48 PAL) 1 NZ90 0 0工程菌进行了高苯丙氨酸血症大鼠 (称PKU动物模型 )的治疗实验。结果表明 :(1)翻译融合型菌株具有更高的酶活性 ;(2 )当Nisin的诱导时间达 6h时 ,产物肉桂酸生成量基本达到峰值 ;(3)给高苯丙氨酸血症大鼠灌喂新鲜培养的p(NZ80 48 PAL) 1 NZ90 0 0工程菌 (翻译融合型 ) ,观察到该工程菌能显著降低模型动物血中Phe浓度。

关键词：苯丙氨酸脱氨酶乳酸乳球菌 ICE系统高效表达实验动物苯丙酮尿症基因治疗

瘦素与绿色荧光蛋白融合基因的合成及其高效表达

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中国药科大学学报 2004年第3期35卷 276-279页

作者：庞实锋吴晓萍李校堃郑青于平野曲红艳王艳萍暨南大学药学院生物制药教研室广州510632 暨南大学国家教育部基因组医药生物技术研究开发中心

目的 :为了便于追踪瘦素 (Leptin)在体内的去向 ,对其进行体内定位 ,设计合成Leptin荧光分子蛋白探针。方法 :用PCR技术将LeptincDNA与绿色荧光蛋白cDNA构建成融合基因LG ,然后将其克隆进原核表达载体pET3c中 ,构建成原核表达工程菌BL2 ... 详细信息

目的 :为了便于追踪瘦素 (Leptin)在体内的去向 ,对其进行体内定位 ,设计合成Leptin荧光分子蛋白探针。方法 :用PCR技术将LeptincDNA与绿色荧光蛋白cDNA构建成融合基因LG ,然后将其克隆进原核表达载体pET3c中 ,构建成原核表达工程菌BL2 1(DE3) /pET3c LG。用Western blot杂交检测重组蛋白的免疫原性 ,用荧光显微镜观察融合蛋白及其诱导菌休的发光活性。结果 :DNA测序结果证实设计合成的融合基因与预期一致 ;构建的工程菌BL2 1(DE3) /pET3c LG获得了表达 ,融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的 4 0 %以上 ;Western blot杂交检测表明重组蛋白具有Leptin的免疫原性 ;经IPTG诱导后的菌体及蛋白粗提液在荧光显微镜下可观察到其能发射出强烈的绿色荧光。结论 :融合基因在大肠杆菌中实现了高效表达 ,表达的融合蛋白具Leptin的免疫原性和GFP的发光特性。为利用绿色荧光蛋白标记Leptin在动物体内的药物治疗的研究提供了一种新的途径。

关键词：瘦素绿色荧光蛋白(GFP) 融合基因高效表达

弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2004年第4期22卷 231-234页

作者：雷明军吴少庭戴五星潘晖榕林绮萍温见翔黄达娜高世同张仁利华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系武汉430030 深圳市疾病预防控制中心分子生物室深圳518020 华南农业大学动物医学系广州510089 广东医学院微生物学教研室湛江524023

目的　构建原核重组表达质粒pET2 3a SAG2 ,并在大肠埃希菌中实现高效表达 ,以及检测表达产物的抗原性。　方法　PCR扩增SAG2编码基因目的片段 ,琼脂糖凝胶电泳回收纯化 ,克隆至 pMD18 T载体 ,转化大肠埃希菌DH5α。测序后亚克隆至表达... 详细信息

目的　构建原核重组表达质粒pET2 3a SAG2 ,并在大肠埃希菌中实现高效表达 ,以及检测表达产物的抗原性。　方法　PCR扩增SAG2编码基因目的片段 ,琼脂糖凝胶电泳回收纯化 ,克隆至 pMD18 T载体 ,转化大肠埃希菌DH5α。测序后亚克隆至表达质粒载体 pET2 3a ,构建重组表达质粒 pET2 3a SAG2 ,转化大肠埃希菌DH5α。筛选阳性克隆 ,经限制性酶切分析鉴定后 ,转化大肠埃希菌BL2 1(DE3 ) ,以异丙基 β D 硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)与免疫印迹分析表达产物。　结果　PCR扩增出约 5 0 0bp的SAG2编码基因目的片段 ,与预期片段大小相符 ,经测序鉴定无基因突变 ;所构建的 pET2 3a SAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定 ,与预期结果一致 ;含有pET2 3a SAG2重组质粒的大肠埃希菌BL2 1(DE3 )诱导后得到了高效表达 ,SDS PAGE显示表达产物约Mr 190 0 0 ;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性。　结论　成功构建了pET2 3a SAG2表达质粒 ,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达 ;表达产物具有良好的抗原性。

关键词： ET 大肠埃希菌抗原性分析表达产物表面抗原弓形虫编码基因高效表达阳性克隆重组表达质粒

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甲酸脱氢酶催化活性的定向进化及其高效表达

应用化学 2021年第6期38卷 704-712页

作者：张振华解玉丽王铁军赵虹唐存多阚云超姚伦广南阳师范学院昆虫生物反应器河南省工程实验室河南省南水北调中线水源区生态安全重点实验室南阳473061 河南蓝图制药有限公司南阳473061

甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH)属于D-2-羟基酸脱氢酶类,能催化甲酸氧化生成二氧化碳,同时能将氧化型辅酶I(Oxdized form of nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)还原成还原型辅酶I(Redued form of nicotinamide adenine dinucleotide,NADH),在NADH的再生中起重要作用。为了获得高活性的甲酸脱氢酶突变体,本研究以博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶(Candida boidinii formate dehydrogenases,CbFDH)突变体(CbFDHC23S)为亲本,进行了2轮定向进化,获得了一个比酶活性约为亲本4倍,且更适合于在生理条件下进行辅酶再生的突变体M2。然后,利用计算机辅助的手段初步阐明了其温度特性和催化效率改变的分子机制。最后,借助共表达策略进一步提高了突变体M2在大肠杆菌中的表达水平,超声裂解液中的甲酸脱氢酶活性达到45.85 U/mL,远远高于亲本单拷贝表达水平。本研究为增强NADH再生能力、降低NADH的再生成本,实现FDH偶联催化的手性醇及氨基酸衍生物等食品添加剂高效、廉价的绿色生物合成奠定理论基础。

关键词：甲酸脱氢酶催化效率定向进化分子对接高效表达

葡萄糖异构酶突变体酶GIG138P和GIG138P-G247D在变铅青链霉菌中的高效表达及检测

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生物工程学报 2002年第3期18卷 304-307页

作者：朱国萍张颖徐旸唐建国徐冲中国科学技术大学生命科学学院分子生物学与细胞生物学系合肥230026

将含有G138P单点突变和G138P G2 47D双点突变的GI结构基因 ,分别克隆入E .coli 链霉菌穿梭载体pHZ 12 72 ,成功构建了穿梭表达载体pHZGI1和pHZGI2。通过原生质体的转化 ,将穿梭表达载体导入变铅青链霉菌TK5 4菌株。 30℃振荡培养 2 4h ... 详细信息

将含有G138P单点突变和G138P G2 47D双点突变的GI结构基因 ,分别克隆入E .coli 链霉菌穿梭载体pHZ 12 72 ,成功构建了穿梭表达载体pHZGI1和pHZGI2。通过原生质体的转化 ,将穿梭表达载体导入变铅青链霉菌TK5 4菌株。 30℃振荡培养 2 4h ,加入 2 μg mL硫链丝菌素诱导表达 12h。SDS PAGE电泳表明 ,两个穿梭载体在TK5 4菌株内表达出 42 5kD特异性条带。薄层扫描显示 ,突变体酶GIG138P和GIG138P G2 47D分别约占可溶性蛋白的19%和 2 2 %。Western杂交进一步证实GIG138P和GIG138P G2 47D在变铅青链霉菌TK5

关键词：葡萄糖异构酶突变体酶穿梭载体变铅青链霉菌高效表达 GIG138P GIG138P-G247D

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高效表达具有生物学活性的植酸酶的毕赤酵母

中国科学（C辑） 1998年第3期28卷 237-243页

作者：姚斌张春义王建华范云六中国农业科学院饲料研究所中国农业科学院生物技术中心北京100081 中国农业科学院生物技术中心

对来源于Aspergillusniger 96 3的植酸酶基因 phyA2进行了改造 ,包括去掉基因中的内含子和信号肽编码序列 ,在不改变所编码氨基酸的情况下 ,定点突变优化了对此基因在酵母中高效表达起关键作用的Arg密码子 .经改造的植酸酶基因按正确的... 详细信息

对来源于Aspergillusniger 96 3的植酸酶基因 phyA2进行了改造 ,包括去掉基因中的内含子和信号肽编码序列 ,在不改变所编码氨基酸的情况下 ,定点突变优化了对此基因在酵母中高效表达起关键作用的Arg密码子 .经改造的植酸酶基因按正确的阅读框架融合到毕赤酵母 (Pichiapastoris)高效表达载体 pPIC9上的α 因子信号肽编码序列 3′端 ,重组表达载体电击转化毕赤酵母得到重组转化子 ,经Southernblotting分析证实了植酸酶基因已整合到酵母基因组中 ,并确定了基因整合的拷贝数 .Northernblotting分析证明植酸酶基因能进行正常的转录 .SDS PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明 ,植酸酶能有效分泌和高效表达 (Arg密码子优化后其表达量可达每毫升培养液 1 5 0 0 0U ,比Arg密码子没有优化的表达量高约 37倍 ,比原菌株A .niger 96 3的表达量高约 30 0 0倍 ) ,表达产物具有正常的生物学活性 .这是迄今为止我国饲料工业中 ,构建的第

关键词：植酸酶基因毕赤酵母高效表达饲料生物学活性

降糖多肽Brevinin-2GUb的高效表达及活性鉴定

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现代食品科技 2020年第5期36卷 155-162页

作者：林静莲黄敏华王蒙马毅王菊芳华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006

为实现降糖多肽Brevinin-2GUb在大肠杆菌中的高效表达,本文将Brevinin-2GUb基因插入到含有硫氧还蛋白、His标签及肠激酶酶切位点的p ET32a载体中,将重组表达载体p ET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb转化至大肠杆菌中诱导表达Trx-His-EK-Br... 详细信息

为实现降糖多肽Brevinin-2GUb在大肠杆菌中的高效表达,本文将Brevinin-2GUb基因插入到含有硫氧还蛋白、His标签及肠激酶酶切位点的p ET32a载体中,将重组表达载体p ET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb转化至大肠杆菌中诱导表达Trx-His-EK-Brevinin-2GUb融合蛋白。通过对表达温度进行优化,结果显示16℃诱导表达20 h后融合蛋白产量达到36 mg/L;该融合蛋白经肠激酶(EK)特异性切割后成功获得不带标签的Brevinin-2GUb多肽,产量约为2.50 mg/L,纯度达90%以上。通过反相高效液相色谱对重组表达的Brevinin-2GUb进行鉴定,结果显示重组表达的Brevinin-2GUb与人工合成的Brevinin-2GUb的氨基酸序列一致。通过血平板检测发现,170μg/m L的重组表达Brevinin-2GUb多肽无溶血效应。此外,重组表达的Brevinin-2GUb多肽在浓度为10μg/m L时对INS-1细胞产生显著的刺激胰岛素分泌作用(为基础释放量的120.04%;p<0.01)。研究结果为Brevinin-2GUb多肽开发为降糖口服液及多肽药物奠定了基础。

关键词： Brevinin-2GUb 大肠杆菌高效表达促胰岛素分泌活性

HIV核心抗原p24原核系统的高效表达、纯化及活性鉴定

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中华实验和临床病毒学杂志 2005年第1期19卷 28-31页

作者：侯俊貌盼勇洪世雯胡燕杨健洋沈宏辉朱雷解放军第三○二医院病毒研究室北京100039

目的　在原核表达系统中对HIVp2 4抗原基因进行克隆和高效表达、纯化并鉴定其活性。方法　利用PCR技术从HIV-1全基因质粒 (B2N)中扩增p2 4抗原基因 ,并克隆入T载体中。通过酶切消化后连接到表达载体pRSET上 ,用此连接产物转化大肠埃希菌... 详细信息

目的　在原核表达系统中对HIVp2 4抗原基因进行克隆和高效表达、纯化并鉴定其活性。方法　利用PCR技术从HIV-1全基因质粒 (B2N)中扩增p2 4抗原基因 ,并克隆入T载体中。通过酶切消化后连接到表达载体pRSET上 ,用此连接产物转化大肠埃希菌BL2 1,经IPTG诱导 ,表达p2 4抗原。利用固定化金属离子 (Ni2 + )配体亲和层析技术从表达蛋白中纯化目的蛋白。并运用双酶切技术、SDS-PAGE电泳、WesternBlot(WB)及ELISA法分别对插入基因片段的正确性、表达产物的活性及特异性进行检测。结果　PCR产物约为 6 90bp ,与预期p2 4抗原全基因片段大小一致。重组质粒T-p2 4和pRSET-p2 4经BamHⅠ和HindⅢ双酶切 ,其插入的外源基因片段均为 6 90bp。将纯化前与纯化后的蛋白作SDS PAGE电泳 ,均可见一条约 2 4× 10 3的外源基因表达带 ,与计算的相对分子质量相符。经WB和ELISA试验 ,证明基因工程表达的p2 4抗原具有较高的特异性及活性。结论　成功构建了HIVp2 4表达载体pRSET-p2 4 ,并在原核细胞中高效表达。

关键词： HIV 核心抗原高效表达纯化特异性活性原核系统表达载体酶切外源基因表达

海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E·coli中的高效表达

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微生物学通报 2005年第4期32卷 25-30页

作者：王希菊蒋宇邵蔚蓝江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214036

为解决密码子偏好性差异造成的表达水平低下问题,采取了3种手段提高海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在***中的表达水平。用PCR方法从海栖热袍菌(Therm otoga maritima)基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶A的完整基因amyA,插入表达载体pET-20(b)中... 详细信息

为解决密码子偏好性差异造成的表达水平低下问题,采取了3种手段提高海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在***中的表达水平。用PCR方法从海栖热袍菌(Therm otoga maritima)基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶A的完整基因amyA,插入表达载体pET-20(b)中构建成质粒pET-amyA;运用基因工程手段将amyA基因富含稀有密码子的信号肽进行切除,将不含信号肽的amyAⅠ基因插入pET-20(b)中构建成质粒pET-amyAⅠ;用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增出argU基因,插入pET-amyAⅠ中构建成质粒pET-amyAⅡ。将重组质粒分别转化到***109(DE3),并将重组质粒pET-amyAⅠ转化***21-CodonP lus(DE3)-R IL。通过IPTG诱导测酶活性:在***109(DE3)中表达的重组酶(pET-amyA)、(pET-amyAⅠ)、(pET-amyAⅡ)的酶活分别是1658.0 U/mL、6721.7 U/mL、8904.5 U/mL,在***21-CodonP lus(DE3)-R IL中表达的重组酶(pET-amyAⅠ)的酶活是13867.7 U/mL。表明通过这些手段能大幅提高***胞外α-淀粉酶在***中的表达水平。

关键词：海栖热袍菌 α-淀粉酶 argU基因高效表达