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极端嗜热菌海栖热袍菌α-葡萄糖醛酸酶的高效表达和重组酶的纯化

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生物工程学报 2004年第4期20卷 554-560页

作者：薛业敏毛忠贵邵蔚蓝江南大学工业生物技术教育部重点实验室

α 葡萄糖醛酸酶作为木聚糖降解的限速酶之一 ,在木聚糖类半纤维素的生物转化中起着重要的作用。海栖热袍菌Thermotogamaritima是一个嗜极端高温的厌氧细菌 ,其产生的极耐热性酶类具有非常可观的工业应用前景。但热袍菌属Thermotoga的... 详细信息

α 葡萄糖醛酸酶作为木聚糖降解的限速酶之一 ,在木聚糖类半纤维素的生物转化中起着重要的作用。海栖热袍菌Thermotogamaritima是一个嗜极端高温的厌氧细菌 ,其产生的极耐热性酶类具有非常可观的工业应用前景。但热袍菌属Thermotoga的基因在大肠杆菌中的表达一般较困难。研究了T .maritima中的极耐热性α 葡萄糖醛酸酶基因在大肠杆菌不同菌株中的表达水平及纯化技术。结果表明 ,稀有密码子AGA、AGG和AUA限制了该基因在大肠杆菌中的表达 ,在大肠杆菌BL2 1 CodonPlus(DE3) RIL可得到高效表达 ,重组蛋白表达量达 2 0 % ,比酶活比野生菌株提高 5倍 ;重组蛋白经热处理和金属Ni2 + 的亲和层析提纯后 ,达到了电泳纯 ,提纯倍数为 5 1倍 ,收率为5 5 1 %。对重组菌诱导表达条件的研究表明 ,营养丰富的TB培养基有助于重组菌的生长 ,重组菌生长至OD6 0 0 为0 7～ 0 8时添加IPTG诱导

关键词：海栖热袍菌 α-葡萄糖醛酸酶高效表达重组酶纯化酶学性质

FAD依赖的葡萄糖脱氢酶多拷贝毕赤酵母菌株的构建及高效表达

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微生物学杂志 2023年第4期43卷 18-25页

作者：董聪王玥罗同阳高庆华王庆庆河北省微生物研究所有限公司河北保定071051

通过体外多拷贝构建实现FAD依赖的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)在毕赤酵母(Pichia pastoris)X33菌株中的高效表达。将前期构建的经密码子偏好性优化FAD-GDH基因插入到pPICZαA质粒中,通过同尾酶法酶切酶连构建含1~4个表达盒的重组表达质粒,分... 详细信息

通过体外多拷贝构建实现FAD依赖的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)在毕赤酵母(Pichia pastoris)X33菌株中的高效表达。将前期构建的经密码子偏好性优化FAD-GDH基因插入到pPICZαA质粒中,通过同尾酶法酶切酶连构建含1~4个表达盒的重组表达质粒,分别电转至毕赤酵母X33中,成功筛选到各种重组菌株。qRT-PCR测定结果表明,载体所含的表达盒数目与嵌合进毕赤酵母基因组中的GDH基因拷贝数之间存在正相关关系。重组菌在试管水平用甲醇诱导72 h,酶活达到最高,其中4拷贝的转化子表达水平最高;选择1拷贝和4拷贝转化子进行10 L发酵罐扩大培养,1拷贝菌株诱导108 h酶活达到最高697.125 U/mL,4拷贝菌株诱导132 h酶活达到最高1063.279 U/mL,比1拷贝酶活提高52.52%。结果表明通过增加目的基因拷贝数策略有助于提高FAD-GDH的表达量,为其进一步扩大生产提供参考。

关键词： FAD依赖的葡萄糖脱氢酶多拷贝重组菌株高效表达毕赤酵母

米曲霉β-半乳糖苷酶的定向进化、高效表达及应用

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食品与生物技术学报 2022年第10期41卷 49-57页

作者：李晨霞向芷璇李敬江正强闫巧娟马俊文中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083 中国农业大学工学院北京100083

定向进化米曲霉β-半乳糖苷酶(AoBgal35A),以提高其水解乳糖的效率,通过易错PCR构建米曲霉β-半乳糖苷酶的突变体文库,高通量筛选水解乳糖效率高的突变体,将其在毕赤酵母中高效表达,并用于制备无乳糖牛奶。筛选得到一个正向突变体(mAoBg... 详细信息

定向进化米曲霉β-半乳糖苷酶(AoBgal35A),以提高其水解乳糖的效率,通过易错PCR构建米曲霉β-半乳糖苷酶的突变体文库,高通量筛选水解乳糖效率高的突变体,将其在毕赤酵母中高效表达,并用于制备无乳糖牛奶。筛选得到一个正向突变体(mAoBgal35A),经高密度发酵酶活力达4760 U/mL。纯化后,mAoBgal35A的最适pH和温度分别为5.0和55℃,比野生型AoBgal35A分别提高了0.5和降低了5℃。mAoBgal35A在室温下能高效水解牛奶中的乳糖,加酶量为2 U/mL时,水解72 h后牛奶中的乳糖质量浓度为0.38 g/dL,达到无乳糖牛奶标准。而野生型AoBgal35A的加酶量为20 U/mL时,在相同条件下水解后,乳糖质量浓度为0.6 g/dL。由此表明,定向进化明显提高了米曲霉β-半乳糖苷酶水解乳糖的效率,所得正向突变体在制备无乳糖乳品中具有很大的应用潜力。

关键词：米曲霉 β-半乳糖苷酶定向进化高效表达水解乳糖

CHO/dhfr^-细胞定点整合高效表达系统的建立

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生物工程学报 2007年第4期23卷 756-762页

作者：周宏刘志刚孙志伟俞炜源军事医学科学院生物工程研究所蛋白质工程研究室北京100071

为了克服随机整合建立高表达细胞株时“位置效应”所带来的不可预知的后果,我们尝试建立基于定点整合的CHO高效表达系统。首先设计一个新的高效筛选载体pMCEscan。该载体含有报告基因(k2tPA)、扩增基因(dhfr)、重组酶识别序列(FRT)及筛... 详细信息

为了克服随机整合建立高表达细胞株时“位置效应”所带来的不可预知的后果,我们尝试建立基于定点整合的CHO高效表达系统。首先设计一个新的高效筛选载体pMCEscan。该载体含有报告基因(k2tPA)、扩增基因(dhfr)、重组酶识别序列(FRT)及筛选基因(neo),且neo基因的表达经过系统的弱化,确保能够对基因组中的整合位点进行大规模的高效筛选。然后利用该载体转染CHO/dhfr-细胞并进行大规模筛选以获得足够多的阳性克隆,并对阳性克隆进行系统分析,筛选出报告基因表达水平高、单拷贝且扩增效果好的克隆,此克隆被认为筛选载体整合入CHO细胞基因组中转录热点(Hotspot)区域,从而获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的CHO/dhfr-细胞系。随后利用位点特异性重组系统(FLP-FRT)将外源基因定点整合到Hotspot区域,以实现外源基因在CHO细胞基因组中的定点整合及高效表达。并利用该细胞系实现了k2tPA的高表达,表达量达到17.1μg/106cell.24h。该研究致力于CHO细胞基因组中高表达位点的寻找和确认,建立基于定点整合的哺乳动物细胞高效表达系统。

关键词： CHO细胞定点整合高效表达重组蛋白

利用融合蛋白EDDIE在大肠杆菌中高效表达抗菌肽Cecropin AD

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生物工程学报 2009年第8期25卷 1247-1253页

作者：张贞柯涛周玉玲马向东马立新湖北大学生命科学学院武汉430062 南阳师范学院生命科学与技术学院南阳473061

本研究采用猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)定点突变外壳蛋白(EDDIE)为融合蛋白,对抗菌肽Cecropin AD(CAD)基因进行了高效融合表达,获得了有抗菌活性的抗菌肽CAD。首先采用重叠PCR基因合成技术将编码抗菌肽的CAD基因与猪瘟... 详细信息

本研究采用猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)定点突变外壳蛋白(EDDIE)为融合蛋白,对抗菌肽Cecropin AD(CAD)基因进行了高效融合表达,获得了有抗菌活性的抗菌肽CAD。首先采用重叠PCR基因合成技术将编码抗菌肽的CAD基因与猪瘟病毒定点突变外壳蛋白EDDIE编码基因合成为e-cad融合基因,接着将融合基因e-cad采用定点同源重组的方法连接到载体pET30a上,构建成pETED表达载体,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)表达,表达的融合蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的40%以上。蛋白质在体外复性,融合蛋白中EDDIE自我剪切,产生抗菌肽CAD。抑菌试验表明抗菌肽CAD能有效地抑制大肠杆菌和藤黄八叠球菌的生长,并且对酵母菌的生长也有微弱地抑制作用。以EDDIE为融合蛋白是在大肠杆菌中高效表达抗菌肽的一种好方法。

关键词：抗菌肽融合蛋白高效表达

链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌及毕赤酵母中的高效表达

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生物工程学报 2003年第1期19卷 41-45页

作者：张红莲姚斌王亚茹袁铁峥张王照伍宁丰范云六中国农业科学院饲料研究所北京100081 中国农业科学院生物技术研究所北京100081

从橄榄绿链霉菌StreptomycesolivaceoviridisA1中克隆出木聚糖酶基因xynA ,将带与不带原基因信号肽编码序列的xynA分别以正确的阅读框架克隆到大肠杆菌表达载体pET 2 2b(+)上的pellB信号肽编码序列之后 ,得到 2种构建的重组载体 ,在重... 详细信息

从橄榄绿链霉菌StreptomycesolivaceoviridisA1中克隆出木聚糖酶基因xynA ,将带与不带原基因信号肽编码序列的xynA分别以正确的阅读框架克隆到大肠杆菌表达载体pET 2 2b(+)上的pellB信号肽编码序列之后 ,得到 2种构建的重组载体 ,在重组大肠杆菌中木聚糖酶得到了表达 ,表达产物具有生物活性。进一步将不带原基因信号肽编码序列的xynA插入到毕赤酵母转移载体pPIC9中 ,转化毕赤酵母得到重组子 ,在重组子中木聚糖酶基因得到了高效分泌表达 ,在摇床培养水平上的表达量达到 2 0 0mg L ,且表达产物具有生物学活性。

关键词：链霉素木聚糖酶基因 xynA 大肠杆菌毕赤酵母高效表达

猪囊尾蚴疫苗候选基因TSO18在酵母中的高效表达

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生物工程学报 2005年第4期21卷 563-567页

作者：袁改玲才学鹏景志忠郑亚东骆学农贾万忠李辉丁军涛中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046

将猪带绦虫六钩蚴TSO18基因亚克隆至毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K,构建重组表达载体pPIC9K_TSO18,电转化毕赤酵母菌GS115,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合。采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达,并... 详细信息

将猪带绦虫六钩蚴TSO18基因亚克隆至毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K,构建重组表达载体pPIC9K_TSO18,电转化毕赤酵母菌GS115,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合。采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达,并对表达产物进行SDS_PAGE和Westernblot分析、脱糖基化分析、分子筛纯化和小鼠免疫接种等表明,目的蛋白得到了高效表达并进行了适度的糖基化,易于纯化且具有免疫活性。在5L发酵罐中目的蛋白表达量达到2·54mg/mL,为制备基因工程疫苗打下了坚实的基础。

关键词：猪囊尾蚴 TSO18基因毕赤酵母高效表达

黑曲霉酸性果胶裂解酶的高效表达及其在果汁澄清中的应用

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食品科学 2019年第18期40卷 83-88页

作者：何玉兰王斌潘力华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006 广东省发酵与酶工程重点实验室广东广州510006

利用黑曲霉自身强启动子(葡萄糖淀粉酶启动子,PglaA)实现了酸性果胶裂解酶PelD在黑曲霉中的过量表达,重组酸性果胶裂解酶经镍柱亲和层析纯化后进行Western blot鉴定及酶学性质研究。重组酸性果胶裂解酶在摇瓶发酵条件下最高酶活力达到8 ... 详细信息

利用黑曲霉自身强启动子(葡萄糖淀粉酶启动子,PglaA)实现了酸性果胶裂解酶PelD在黑曲霉中的过量表达,重组酸性果胶裂解酶经镍柱亲和层析纯化后进行Western blot鉴定及酶学性质研究。重组酸性果胶裂解酶在摇瓶发酵条件下最高酶活力达到8 822.6 U/mL;经一步纯化后,该重组酶的比活力为8 522.7 U/mg,回收率为79.4%;该重组酶的最适反应pH值为5.0,在pH 3.0~6.5范围内40℃保温2 h仍能保持50%以上的相对酶活力,在酸性pH值下稳定性良好;最适反应温度为50℃,该重组酶在30~50℃的范围内非常稳定;在1 mmol/L浓度下,Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Ba2+对该重组酶具有激活作用,其中Zn2+、Ni2+、Ba2+激活作用较为显著,而十二烷基硫酸钠表现为抑制作用;底物特异性分析表明该酶能够特异性地降解高度甲酯化果胶,其对柑橘果胶(酯化度≥85%)酶活力高达31 248.0 U/mL;此外,重组酶对橙汁、苹果汁和葡萄汁具有良好的澄清效果,其中橙汁的透光度提高了16.9倍,苹果汁的透光度提高了10.5倍,葡萄汁的透光度提高了4.7倍。

关键词：酸性果胶裂解酶黑曲霉高效表达酶学性质果汁澄清

豹蛙抗瘤酶的毕赤酵母高效表达、纯化及活性测定

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生物工程学报 2015年第11期31卷 1632-1642页

作者：杨刚刚马诚凯张全义史世会王泽吕中原王绪洋许晓亚崔晴晴张继红张瑞刚徐存拴河南师范大学生命科学学院河南新乡453007 河南省-科技部共建细胞分化国家重点实验室培育基地生物工程药物河南省工程实验室河南新乡453007 河南新乡华星药厂河南新乡453007

豹蛙抗瘤酶(Onconase,ranpirnase,ONC)对体内外多种肿瘤有很强的杀伤作用,是当前全球重点研究的100种新药之一,为获得高表达与高活性的重组豹蛙抗瘤酶(Recombination onconase,rONC),根据成熟ONC的cDNA序列和毕赤酵母密码子偏好性设计... 详细信息

豹蛙抗瘤酶(Onconase,ranpirnase,ONC)对体内外多种肿瘤有很强的杀伤作用,是当前全球重点研究的100种新药之一,为获得高表达与高活性的重组豹蛙抗瘤酶(Recombination onconase,rONC),根据成熟ONC的cDNA序列和毕赤酵母密码子偏好性设计基因并提高其GC含量,分泌信号肽采用酵母α交配因子的pre肽,分别构建表达载体pPIC9/ONC、pPIC9K/ONC和pPICZα-A/ONC,并转染毕赤酵母X-33、GS115和SMD1168,筛选阳性克隆并进行诱导表达。在摇瓶规模筛选最佳载体-宿主组合及优化培养条件之后,进行10 L规模最优培养基的筛选,发酵产物经双水相萃取偶联G50凝胶层析分离纯化。结果表明,pPICZα-A/X-33/ONC组合表达量优于其他组合,且在p H 5.5、23℃条件下诱导7 d,最高表达量达到13 mg/L;在10 L规模条件下,rONC于pH 5.5的低盐基础培养基(Lower basic salt medium,LBSM)、甲醇浓度0.25%条件下诱导7 d,最高表达量为180 mg/L;纯化后的rONC纯度≥95%,收率高于90%;生物活性检测发现,rONC在体外能杀伤多种癌细胞。初步建立了rONC的高效表达与纯化体系,为后续的功能和作用机理研究奠定了一定基础。

关键词：豹蛙抗瘤酶高效表达双水相萃取活性测定