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β-葡萄糖苷酶催化活性改造及在毕赤酵母中的高效表达

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食品与发酵工业 2024年

作者：吴涛旭阳鹏辉李阳阳刘松江南大学未来食品科学中心江南大学生物工程学院

β-葡萄糖苷酶(EC 3.***.1.21)能催化底物非还原末端的β-D-葡萄糖苷键水解释放葡萄糖和相应配基，是纤维素糖化过程中的关键酶之一。篮状菌(Talaromyces leycettanus JCM12802)来源的β-葡萄糖苷酶bgl3A热稳定性较好，但催化活性还亟待... 详细信息

β-葡萄糖苷酶(EC 3.***.1.21)能催化底物非还原末端的β-D-葡萄糖苷键水解释放葡萄糖和相应配基，是纤维素糖化过程中的关键酶之一。篮状菌(Talaromyces leycettanus JCM12802)来源的β-葡萄糖苷酶bgl3A热稳定性较好，但催化活性还亟待提高。该研究中，通过Discovery Studio 2022柔性对接模块构建了bgl3A和底物pNPG的复合物结构；基于结合能预测模块对bgl3A催化活性位点6 ?以内的氨基酸残基进行虚拟突变，计算突变前后酶对pNPG的结合能变化；对结合能变化小于-0.7 kcal/mol的20个突变体进行表达、纯化和酶学性质分析。与bgl3A相比，突变体bgl3A-N237Y的比酶活和kcat/Km分别提升了22%和25%。将bgl3A-N237Y在毕赤酵母中表达，通过信号肽替换和共表达分子伴侣使其摇瓶发酵酶活达106.6 U/mL，较优化前提高75%。研究得到高活性bgl3A突变体及其生产菌将有助于提高其工业化应用效果。

关键词： β-葡萄糖苷酶催化活性底物结合能毕赤酵母高效表达

茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶在E.coli中的高效表达

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食品与发酵工业 2024年

作者：袁方李国莹顾秋亚余晓斌江南大学生物工程学院江苏一鸣生物股份有限公司

谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase， TGase)可以促进蛋白质分子内或分子间的交联，在食品、制药、纺织等行业中均有着广泛的应用。为了高效生产具有优良特性的TGase，该研究以茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)来源的TGase为研究对... 详细信息

谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase， TGase)可以促进蛋白质分子内或分子间的交联，在食品、制药、纺织等行业中均有着广泛的应用。为了高效生产具有优良特性的TGase，该研究以茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)来源的TGase为研究对象，比较了两个不同来源的TGase的性质，将具有较优酶学性质的TGase基因tgLD分别采用6种不同质粒在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行异源表达。其中，重组菌E. coli BL21(DE3) (pET32a-tgLD)实现了成熟TGase的异源表达，添加0.2 mmol/L IPTG、25 ℃诱导8 h，重组TGLD的酶活力为0.45 U/mL。为了进一步提高TGLD的表达量，构建了可以特异性激活pro-TGase的2种表达载体。其中，重组菌E. coli BL21(DE3) (pCOLDⅡ-pro-EK-tgLD)，添加0.2 mmol/L IPTG、15 ℃诱导24 h，体外活化后获得具有活性的TGLD酶，其酶活力达25.23 U/mL。该研究实现了具有优良性质的活性TGLD在E. coli 中的高效表达。

关键词：谷氨酰胺转氨酶茂源链霉菌大肠杆菌高效表达

大肠杆菌多酚氧化酶的分子克隆及异源高效表达

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中国饲料 2024年第5期 26-31页

作者：邓卉余丹邹成义范景胜李斌屈东倪青松郑钰嘉陈瑾四川省畜牧科学研究院动物遗传育种四川省重点实验室四川成都610066

菜籽粕、棉籽粕等非粮饲料资源存在的酚类化合物芥子碱、棉酚等抗营养因子,严重影响了其饲喂价值。本课题组筛选出的一株大肠杆菌属芥子碱降解菌SDB2已被证实能通过分泌多酚氧化酶来降解芥子碱和棉酚,本试验旨在运用基因工程技术克隆SDB... 详细信息

菜籽粕、棉籽粕等非粮饲料资源存在的酚类化合物芥子碱、棉酚等抗营养因子,严重影响了其饲喂价值。本课题组筛选出的一株大肠杆菌属芥子碱降解菌SDB2已被证实能通过分泌多酚氧化酶来降解芥子碱和棉酚,本试验旨在运用基因工程技术克隆SDB2多酚氧化酶基因,实现其高效表达,为SDB2多酚氧化酶在饲料工业上的规模化应用奠定基础。从大肠杆菌SDB2中克隆出多酚氧化酶基因,将其与质粒pET28a连接后转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中培养,通过PCR鉴定及质粒酶切验证方法构建重组菌株,同时对重组克隆基因进行生物信息学分析。采用“2×2”交叉试验设计,以温度和诱导剂IPTG浓度两个影响因素诱导SDB2多酚氧化酶基因在重组菌株中高效表达,经SDS-PAGE和WB双重验证后,确立最佳诱导条件,最终纯化出目标酶蛋白。结果表明:(1)成功克隆SDB2多酚氧化酶基因,构建出异源表达重组菌株。(2)克隆出的SDB2重组多酚氧化酶基因含目标核苷酸741个,总编码氨基酸263个(含标签氨基酸20个),氨基酸组成的蛋白相对分子质量为28499.0,理论等电点为6.94,据此预测出SDB2重组多酚氧化酶三维结构模型。(3)确立SDB2多酚氧化酶异源高效表达的最佳诱导条件为温度37℃,IPTG浓度1 mmol,该条件下表达出大量可溶性酶蛋白,有利于工业化生产。本试验条件下,大肠杆菌SDB2多酚氧化酶成功实现了分子克隆及异源高效表达,为我国非粮饲料资源实现高效利用提供了技术参考。

关键词：大肠杆菌多酚氧化酶克隆高效表达

谷氨酰胺转氨酶耐热突变体在茂原链霉菌中的表达及酶学性质分析

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食品与发酵工业 2024年

作者：陈智恒周灿韦佐权谭亚梦叶佳才崔世修刘松江南大学未来食品科学中心江南大学生物工程学院嘉兴未来食品研究院

谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase，TGase）能催化蛋白质交联，被广泛用于食品加工。为促进其工业化应用，该研究成功构建了高产耐热TGase的茂原链霉菌（Streptomyces mobaraensis）。首先，合成了TGase耐热突变体TGm3表达框（1 745 b... 详细信息

谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase，TGase）能催化蛋白质交联，被广泛用于食品加工。为促进其工业化应用，该研究成功构建了高产耐热TGase的茂原链霉菌（Streptomyces mobaraensis）。首先，合成了TGase耐热突变体TGm3表达框（1 745 bp），包含了S. mobaraensis TGase天然启动子、酶原区、终止子及TGm3编码序列（基于链霉菌密码子偏好性优化）。其次，基于双交换同源重组将TGm3表达框整合至S. mobaraensis 诱变菌smY2019-Δtg的TGase基因位点，得到TGm3生产菌smY2019-TGm3。最后，分析了smY2019-TGm3发酵水平及TGm3酶学性质。摇瓶发酵结果显示，smY2019-TGm3发酵至60 h胞外TGase酶活力达到最大值（19.5 U/mL）。经阳离交换柱纯化后，TGm3比酶活力达到了41.76 U/mg是野生型TGase的1.7倍。酶学性质分析显示，TGm3的60 ℃半衰期（60.6 min）和最适反应温度（60 ℃）分别较野生型TGase提高32.6倍和10 ℃。上述结果表明，smY2019-TGm3能高效合成耐热TGase，具有一定的工业化应用潜力。

关键词：茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶高效表达热稳定性

青霉素酰化酶在毕赤酵母中的异源表达及其产酶条件优化

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食品与发酵工业 2024年

作者：贾煜浛张想军马铖朱滕滕魏晓博陈龙刘慧燕方海田宁夏大学食品科学与工程学院宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室宁夏三十六度生物科技有限公司宁夏乙征生物工程有限公司

青霉素酰化酶(Penicillin Acylase， PA)主要用于β-内酰胺类抗生素半合成工业生产。本论文从雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)获得pga基因，在毕赤酵母(Komagataella pastoris)GS115中进行异源表达，并对重组酶PA进行产酶条件... 详细信息

青霉素酰化酶(Penicillin Acylase， PA)主要用于β-内酰胺类抗生素半合成工业生产。本论文从雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)获得pga基因，在毕赤酵母(Komagataella pastoris)GS115中进行异源表达，并对重组酶PA进行产酶条件优化。异源表达构建的结果表明，重组毕赤酵母发酵上清液酶活为2 155.59 U/L，沉淀酶活为1 375.75 U/L。重组酶的最佳诱导产酶条件为温度29℃，时间72 h，甲醇浓度1.5%，重组酶PA的活性为5 003.72±50.623 U/L，酶活较优化前提高了1.57倍，纯化后蛋白大小为72 kDa，蛋白浓度为1.58 mg/mL，纯化后重组酶的最适反应温度为60℃，最适pH为7，Mn2+对其有强烈抑制作用，Al3+对其有强烈激活作用。本研究结果可为青霉素酰化酶的异源表达及进一步工业应用提供指导。

关键词：毕赤酵母青霉素酰化酶异源蛋白表达酶学性质高效表达

单宁酶在黑曲霉中的高效表达及其酶学性质研究

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食品工业科技 2023年第15期44卷 159-165页

作者：仝丹心李杰何洪彬张会东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 山东师范大学生命科学学院山东济南250014

运用基因工程手段,构建高效表达单宁酶的黑曲霉重组菌株,并对重组酶活性及酶学性质进行研究,以期提高单宁酶的表达,更好地实现单宁酶在茶饮料、饲料等行业的重要作用。以内源高表达的glaA基因位点为整合靶位点,集成glaA多拷贝强启动子Pg... 详细信息

运用基因工程手段,构建高效表达单宁酶的黑曲霉重组菌株,并对重组酶活性及酶学性质进行研究,以期提高单宁酶的表达,更好地实现单宁酶在茶饮料、饲料等行业的重要作用。以内源高表达的glaA基因位点为整合靶位点,集成glaA多拷贝强启动子PglaA6R和信号肽SglaA,构建单宁酶基因AnTan黑曲霉重组表达载体pSZHG6R-AnTan,采用农杆菌介导法转化黑曲霉,获得单宁酶黑曲霉纯合重组菌株A1。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测结果表明,目的蛋白大小约为76 kDa;以10%糊精为碳源摇瓶发酵至11 d时,酶活最高达到134.36 U·mL^(-1),约为宿主菌株的192倍。酶学性质研究表明,最适温度为50℃,高温时热稳定性较差;最适pH为7.0。K^(+)和Ca^(2+)对重组酶没有影响;Mg^(2+)对重组酶有微弱的促进作用;Zn^(2+)对重组酶有明显的促进作用;Cu^(2+)和Fe^(2+)对重组酶有微弱的抑制作用;Mn^(2+)和EDTA对重组酶有明显的抑制作用。研究结果为进一步优化单宁酶的分泌表达提供了有价值的参考。

关键词：单宁酶黑曲霉高效表达酶学性质重组菌株基因工程

海栖热袍菌木聚糖酶B的分子改造、高效表达及其在啤酒中的应用

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食品科学 2022年第6期43卷 66-73页

作者：刘学强江正强余静马俊文杨行闫巧娟中国农业大学工学院中国轻工业食品生物工程重点实验室北京100083 中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083

研究海栖热袍菌木聚糖酶B(TmXynB)的定向进化、高效表达和应用。构建突变文库后经两轮筛选,获得一个在酸性高温下具有高比活力的突变体(mTmXynB)。突变体mTmXynB的最适pH值和最适温度为5.5和90℃,较野生型的最适pH值和最适温度分别下降... 详细信息

研究海栖热袍菌木聚糖酶B(TmXynB)的定向进化、高效表达和应用。构建突变文库后经两轮筛选,获得一个在酸性高温下具有高比活力的突变体(mTmXynB)。突变体mTmXynB的最适pH值和最适温度为5.5和90℃,较野生型的最适pH值和最适温度分别下降了0.5和10℃,对小麦阿拉伯木聚糖的比活力由529 U/mg提高至1565 U/mg。序列比对表明,mTmXynB中3个氨基酸发生突变,分别为Asn91Ser、Trp129Arg和Arg143Glu。经定点突变实验,Arg143Glu通过改变局部蛋白表面的电荷分布提高了其耐酸性,Trp129Arg通过打破疏水平台降低了酶的最适温度,而Asn91Ser可能通过改变底物结合位点Trp89的构象提高该酶的催化活力。进一步将mTmXynB表达至毕赤酵母,经高密度发酵酶活力达18000 U/mL。突变体mTmXynB和野生型TmXynB分别添加至麦芽糖化过程中,结果表明mTmXynB在150 U/g麦芽添加量时效果最好,可降低45%的过滤时间和8.7%的料液黏度。而TmXynB在600 U/g麦芽添加量时效果最好,分别降低39%和8.1%的过滤速度和料液黏度。因此,突变体mTmXynB在啤酒工业中具有很好的应用前景。

关键词：木聚糖酶B 海栖热袍菌定向进化高效表达麦芽糖化

米黑根毛霉甘露聚糖酶的定向进化、高效表达与应用

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食品与生物技术学报 2022年第7期41卷 120-129页

作者：李延啸马俊文闫巧娟武建张伟江正强中国农业大学工学院/中国轻工业食品生物工程重点实验室北京100083 北京瓜尔润科技股份有限公司北京100101 中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083 南京财经大学食品科学与工程学院/江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心江苏南京210023

为提高米黑根毛霉甘露聚糖酶(RmMan5A)对魔芋粉的水解效率,利用定向进化技术对该酶进行分子改造,经两轮筛选获得了一个对甘露聚糖酶催化效率显著提升的突变体(RmMan5AM2)。该突变体的最适pH为7.0,最适温度为65℃,较野生型甘露聚糖酶提高... 详细信息

为提高米黑根毛霉甘露聚糖酶(RmMan5A)对魔芋粉的水解效率,利用定向进化技术对该酶进行分子改造,经两轮筛选获得了一个对甘露聚糖酶催化效率显著提升的突变体(RmMan5AM2)。该突变体的最适pH为7.0,最适温度为65℃,较野生型甘露聚糖酶提高了10℃。该突变体继承了野生型甘露聚糖酶的高比酶活力,对槐豆胶的比酶活力达10371.4 U/mg。在最适条件下,该突变体对槐豆胶、魔芋粉和瓜尔胶的催化效率分别提高了37.4%、28.9%和34.4%。进一步将该突变体在毕赤酵母中进行高效表达,经过156 h高密度发酵,发酵液胞外酶活力达176000 U/mL,是目前产甘露聚糖酶的最高水平。利用该突变体水解魔芋粉成功制备魔芋甘露寡糖,产物主要为聚合度2~6的甘露寡糖(相对峰面积>85%),总得率为88.5%。该突变体具有优良的酶学性质,对魔芋粉的水解效率显著提升,在魔芋甘露寡糖的酶法制备中具有很大的应用潜力。

关键词：米黑根毛霉甘露聚糖酶定向进化高效表达应用

米曲霉β-半乳糖苷酶的定向进化、高效表达及应用

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食品与生物技术学报 2022年第10期41卷 49-57页

作者：李晨霞向芷璇李敬江正强闫巧娟马俊文中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083 中国农业大学工学院北京100083

定向进化米曲霉β-半乳糖苷酶(AoBgal35A),以提高其水解乳糖的效率,通过易错PCR构建米曲霉β-半乳糖苷酶的突变体文库,高通量筛选水解乳糖效率高的突变体,将其在毕赤酵母中高效表达,并用于制备无乳糖牛奶。筛选得到一个正向突变体(mAoBg... 详细信息

定向进化米曲霉β-半乳糖苷酶(AoBgal35A),以提高其水解乳糖的效率,通过易错PCR构建米曲霉β-半乳糖苷酶的突变体文库,高通量筛选水解乳糖效率高的突变体,将其在毕赤酵母中高效表达,并用于制备无乳糖牛奶。筛选得到一个正向突变体(mAoBgal35A),经高密度发酵酶活力达4760 U/mL。纯化后,mAoBgal35A的最适pH和温度分别为5.0和55℃,比野生型AoBgal35A分别提高了0.5和降低了5℃。mAoBgal35A在室温下能高效水解牛奶中的乳糖,加酶量为2 U/mL时,水解72 h后牛奶中的乳糖质量浓度为0.38 g/dL,达到无乳糖牛奶标准。而野生型AoBgal35A的加酶量为20 U/mL时,在相同条件下水解后,乳糖质量浓度为0.6 g/dL。由此表明,定向进化明显提高了米曲霉β-半乳糖苷酶水解乳糖的效率,所得正向突变体在制备无乳糖乳品中具有很大的应用潜力。

关键词：米曲霉 β-半乳糖苷酶定向进化高效表达水解乳糖