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应用毕氏酵母高效表达耐高温植酸酶

Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2002年第6期34卷 725-730页

作者：彭日荷熊爱生李贤范惠琴姚泉洪郭美锦张嗣良上海市农业科学院生物技术研究中心、上海市农业遗传育种重点实验室华东理工大学生物工程学院华东理工大学生物工程学院上海201106 上海200237

自然界很难获得大量的耐高温植酸酶。采取连续延伸PCR方法 ,按照毕氏酵母的偏爱密码 ,合成 1.3kb烟熏曲霉耐高温植酸酶基因 fphy。合成基因与野生型基因核苷酸序列同源性为 74 % ,但编码的氨基酸序列一致。将耐高温植酸酶基因fphy插入... 详细信息

自然界很难获得大量的耐高温植酸酶。采取连续延伸PCR方法 ,按照毕氏酵母的偏爱密码 ,合成 1.3kb烟熏曲霉耐高温植酸酶基因 fphy。合成基因与野生型基因核苷酸序列同源性为 74 % ,但编码的氨基酸序列一致。将耐高温植酸酶基因fphy插入毕氏酵母高效表达载体 pPIC9中 ,与分泌信号肽序列融合 ,通过同源重组将耐高温植酸酶基因整合到酵母染色体中 ,通过SDS PAGE检测和表达产物的酶活性筛选 ,得到重组转化子 ,证明植酸酶获得有效分泌和高效表达。经过 5L小罐高密度发酵 ,蛋白质表达量为 5 .6 g/L ;每毫升发酵液中植酸酶的活力单位达 130 0 0 0u ;表达产物耐高温性很强 ,90℃处理 80min后仍有 4 0 %的活性。

关键词：热稳定植酸酶基因合成高效表达毕氏酵母

海栖热袍菌木聚糖酶B的分子改造、高效表达及其在啤酒中的应用

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食品科学 2022年第6期43卷 66-73页

作者：刘学强江正强余静马俊文杨行闫巧娟中国农业大学工学院中国轻工业食品生物工程重点实验室北京100083 中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083

研究海栖热袍菌木聚糖酶B(TmXynB)的定向进化、高效表达和应用。构建突变文库后经两轮筛选,获得一个在酸性高温下具有高比活力的突变体(mTmXynB)。突变体mTmXynB的最适pH值和最适温度为5.5和90℃,较野生型的最适pH值和最适温度分别下降... 详细信息

研究海栖热袍菌木聚糖酶B(TmXynB)的定向进化、高效表达和应用。构建突变文库后经两轮筛选,获得一个在酸性高温下具有高比活力的突变体(mTmXynB)。突变体mTmXynB的最适pH值和最适温度为5.5和90℃,较野生型的最适pH值和最适温度分别下降了0.5和10℃,对小麦阿拉伯木聚糖的比活力由529 U/mg提高至1565 U/mg。序列比对表明,mTmXynB中3个氨基酸发生突变,分别为Asn91Ser、Trp129Arg和Arg143Glu。经定点突变实验,Arg143Glu通过改变局部蛋白表面的电荷分布提高了其耐酸性,Trp129Arg通过打破疏水平台降低了酶的最适温度,而Asn91Ser可能通过改变底物结合位点Trp89的构象提高该酶的催化活力。进一步将mTmXynB表达至毕赤酵母,经高密度发酵酶活力达18000 U/mL。突变体mTmXynB和野生型TmXynB分别添加至麦芽糖化过程中,结果表明mTmXynB在150 U/g麦芽添加量时效果最好,可降低45%的过滤时间和8.7%的料液黏度。而TmXynB在600 U/g麦芽添加量时效果最好,分别降低39%和8.1%的过滤速度和料液黏度。因此,突变体mTmXynB在啤酒工业中具有很好的应用前景。

关键词：木聚糖酶B 海栖热袍菌定向进化高效表达麦芽糖化

大肠杆菌T蛋白PDH结构域的高效表达纯化与活性测定

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中国药学杂志 2005年第3期40卷 224-227页

作者：陈静阮昊水文波陈枢青浙江大学药学院生物制药研究室浙江杭州310031

目的构建高效表达菌株,以大量表达大肠杆菌T蛋白的预苯酸脱氢酶(PDH),为研究T蛋白双功能结构域CM和PDH的相互协同作用以及T蛋白抑制剂对其影响提供活性蛋白材料。方法利用pGEX高效融合表达系统将PDH与谷光甘肽疏基转移酶(GST)编码序列... 详细信息

目的构建高效表达菌株,以大量表达大肠杆菌T蛋白的预苯酸脱氢酶(PDH),为研究T蛋白双功能结构域CM和PDH的相互协同作用以及T蛋白抑制剂对其影响提供活性蛋白材料。方法利用pGEX高效融合表达系统将PDH与谷光甘肽疏基转移酶(GST)编码序列在表达宿主BL21实现高效表达,并利用对GST具有亲和作用的GlutathioneSepharose4B琼脂糖珠进行亲和层析以对其分离纯化。结果表达产物达菌体总蛋白的40%,可溶性目的产物得量为240mg·L-1,利用亲和层析法纯化后纯度达92.5%,GSTPDH融合蛋白的PDH的比活为38U·mg-1。结论本法成功构建高效表达PDH菌株,表达量高,纯化度高,GSTPDH酶活性正常,为进一步研究奠定基础。

关键词： GST 蛋白纯化活性测定大肠杆菌正常高效表达结构域融合表达表达量

耐热嗜酸β-甘露聚糖酶TaMan5A在毕赤酵母中高效表达及酶学性质研究

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食品与发酵工业 2024年第3期50卷 52-58页

作者：王家强郑锋振浙江树人学院生物与环境工程学院浙江杭州310015

甘露聚糖酶是一类将甘露聚糖降解为短链甘露寡糖及甘露糖的水解酶。为了开发耐酸耐高温的工程酶,从棘孢木霉(Trichodema asperellum)ND-1中克隆甘露聚糖酶基因TaMan5A并在毕赤酵母(Komagataella phaffii)X-33中成功表达。结果显示,该酶... 详细信息

甘露聚糖酶是一类将甘露聚糖降解为短链甘露寡糖及甘露糖的水解酶。为了开发耐酸耐高温的工程酶,从棘孢木霉(Trichodema asperellum)ND-1中克隆甘露聚糖酶基因TaMan5A并在毕赤酵母(Komagataella phaffii)X-33中成功表达。结果显示,该酶的蛋白质分子质量约为67 kDa。最适pH值和温度分别为4.0和65℃,在pH 2.0~6.0具有较强的稳定性,孵育1 h后仍具有80%的活性,且在20~65℃时,残留酶活力均能达到90%以上。1 mmol/L Co^(2+)、脲和5 mmol/L SDS、Zn^(2+)、Fe^(2+)、Mn^(2+)、Ni^(2+)对TaMan5A的活力都有不同程度的激活作用。由于玉米秸秆富含纤维素与半纤维素,因此进一步确定了TaMan5A水解秸秆的最佳组合条件(玉米秸秆用量0.5 g,TaMan5A用量0.5 g,pH 4.0,水解2 d),并得到玉米秸秆用量和TaMan5A用量对玉米秸秆降解效率影响最大。该研究首次从棘孢木霉ND-1中克隆出TaMan5A基因,实验结果表明,TaMan5A是一种嗜酸、耐高温、热稳定性强的酶,具有较大的应用前景,值得进一步研究。

关键词：棘孢木霉ND-1 毕赤酵母高效表达 β-甘露聚糖酶酶学性质

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高效表达乙型肝炎表面抗原的CHO工程细胞株的构建

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中国生物制品学杂志 2009年第12期22卷 1172-1175页

作者：时成波徐军王堃贾重来徐冬冬盛军长春生物制品研究所长春130062 北京天坛生物制品股份有限公司疫苗二室北京100024

目的构建高效表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的CHO工程细胞株。方法从pCIneo质粒出发,构建含有改造了稀有密码子的HBsAgS基因和启动子弱化的二氢叶酸还原酶(DHFR)转录单位的新型表达载体,利用脂质体转染CHO/dhfr-细胞,经3轮氨甲喋呤(MTX)... 详细信息

目的构建高效表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的CHO工程细胞株。方法从pCIneo质粒出发,构建含有改造了稀有密码子的HBsAgS基因和启动子弱化的二氢叶酸还原酶(DHFR)转录单位的新型表达载体,利用脂质体转染CHO/dhfr-细胞,经3轮氨甲喋呤(MTX)梯度加压筛选和单克隆筛选,获得高效表达HBsAg的CHO工程细胞株,并对HBsAg的分泌动态进行检测。结果所构建的新型表达载体pCI-DS经PCR及酶切鉴定,证明构建正确,转染CHO/dhfr-细胞后,经筛选得到高效表达HBsAg的CHO工程细胞株3F9,表达量达9.21μg/106个细胞·48h。单层细胞培养动态表明,3F9株细胞能在40d内稳定高效表达HBsAg。结论已成功构建稳定高效表达HBsAg的CHO工程细胞株,为提高HBsAg的产量创造了条件。

关键词：乙型肝炎表面抗原中国仓鼠卵巢细胞高效表达

单宁酶在黑曲霉中的高效表达及其酶学性质研究

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食品工业科技 2023年第15期44卷 159-165页

作者：仝丹心李杰何洪彬张会东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 山东师范大学生命科学学院山东济南250014

运用基因工程手段,构建高效表达单宁酶的黑曲霉重组菌株,并对重组酶活性及酶学性质进行研究,以期提高单宁酶的表达,更好地实现单宁酶在茶饮料、饲料等行业的重要作用。以内源高表达的glaA基因位点为整合靶位点,集成glaA多拷贝强启动子Pg... 详细信息

运用基因工程手段,构建高效表达单宁酶的黑曲霉重组菌株,并对重组酶活性及酶学性质进行研究,以期提高单宁酶的表达,更好地实现单宁酶在茶饮料、饲料等行业的重要作用。以内源高表达的glaA基因位点为整合靶位点,集成glaA多拷贝强启动子PglaA6R和信号肽SglaA,构建单宁酶基因AnTan黑曲霉重组表达载体pSZHG6R-AnTan,采用农杆菌介导法转化黑曲霉,获得单宁酶黑曲霉纯合重组菌株A1。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测结果表明,目的蛋白大小约为76 kDa;以10%糊精为碳源摇瓶发酵至11 d时,酶活最高达到134.36 U·mL^(-1),约为宿主菌株的192倍。酶学性质研究表明,最适温度为50℃,高温时热稳定性较差;最适pH为7.0。K^(+)和Ca^(2+)对重组酶没有影响;Mg^(2+)对重组酶有微弱的促进作用;Zn^(2+)对重组酶有明显的促进作用;Cu^(2+)和Fe^(2+)对重组酶有微弱的抑制作用;Mn^(2+)和EDTA对重组酶有明显的抑制作用。研究结果为进一步优化单宁酶的分泌表达提供了有价值的参考。

关键词：单宁酶黑曲霉高效表达酶学性质重组菌株基因工程

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利用Cre／lox重组系统在转基因动物中筛选高效表达外源基因的“友好”基因座

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高技术通讯 2004年第12期14卷 43-49页

作者：桑璐郭英任立明安晓荣候健关宏陈永福中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室，北京100094

本实验的目的是利用Cre／lox重组系统进行“友好”基因座的筛选，即利用一个两端带有lox位点的标记基因去转染动物细胞或生产转基因动物，获得可以高效表达外源基因的“友好”基因座。一旦筛选到好的基因座，就建成了一个可以在动物体... 详细信息

本实验的目的是利用Cre／lox重组系统进行“友好”基因座的筛选，即利用一个两端带有lox位点的标记基因去转染动物细胞或生产转基因动物，获得可以高效表达外源基因的“友好”基因座。一旦筛选到好的基因座，就建成了一个可以在动物体稳定地高效表达外源基因的技术平台。为此，利用野生型loxP位点和含有一个点突变的lox511位点分别构建两个载体pSL-loxGFP和pSL-loxIFN。首先将含有GFP和新霉素基因的质粒pSL-loxGFP DNA转染牛胎儿成纤维细胞，并用G418筛选，挑选出发绿色荧光的细胞克隆。经增殖培养之后，再将含有鸡γ-干扰素基因的质粒pSL-loxIFN和含有Cre重组酶基因的质粒pBS185 DNA共转染发荧光的细胞克隆，筛选出发生重组后不再发光的细胞克隆。用PCR法检测了两个不发荧光的细胞克隆及发荧光的细胞克隆，并使用质粒pSL-loxIFN、质粒pSL-loxGFP及牛基因组作为对照。检测结果显示，在Cre重组酶的作用下，两个不发荧光的细胞克隆中，一个发生了基因置换，另一个发生了基因删除。以上实验表明，巧妙地用Cm／lox重组系统，可以构建一套使外源基因在动物体内定点地高效表达的技术体系。

关键词：细胞克隆 IFN 质粒筛选基因座动物体内共转染高效表达 Cre/lox 外源基因

一种新型人肿瘤坏死因子突变体在大肠杆菌中的高效表达

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 1996年第1期28卷 49-55页

作者：高长寿毛申兰俞璎陈常庆中国科学院上海生物工程研究中心

采用多位点突变引物和ＰＣＲ方法对合成的人肿瘤坏死因子进行了突变，通过这一突变，人肿瘤坏死因子的第二位精氨酸的密码子ＣＧＴ被变为赖氨酸密码子ＡＡＡ，将突变后的基因插入表达载体ｐＳＢ－９２的ＰＬ启动子下游得到重组质粒ｐＳ... 详细信息

采用多位点突变引物和ＰＣＲ方法对合成的人肿瘤坏死因子进行了突变，通过这一突变，人肿瘤坏死因子的第二位精氨酸的密码子ＣＧＴ被变为赖氨酸密码子ＡＡＡ，将突变后的基因插入表达载体ｐＳＢ－９２的ＰＬ启动子下游得到重组质粒ｐＳＢ－ＴＮＦ－Ｋ２，并在大肠杆菌中进行表达。突变体［Ｌｙｓ２］ｈＴＮＦ－α的表达产率达到菌体内总蛋白质的６０％以上，且为一可溶性蛋白质并易于纯化。同野生型ｈＴＮＦ－α相比，［Ｌｙｓ２］ｈＴＮＦ－α具有稍低的毒性，但对于某些人肿瘤细胞株表现出高于数十到数百倍的抑制活性．

关键词：肿瘤坏死因子高效表达突变

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高效表达淀粉酶的工业酿酒酵母菌株的构建

食品与发酵工业 2004年第9期30卷 27-32页

作者：刘增然李树立张光一刘世贵河北经贸大学生物科学与工程学院四川大学生命科学院成都610041

将PCR扩增的扣囊腹膜孢酵母菌淀粉酶基因 ,与磷酸甘油酸激酶基因 1启动子和α 分泌序列一起插入含 2 μm的酵母穿梭质粒YEp3 5 2 ,构建酵母菌重组表达质粒并命名为pLA8α。用醋酸锂转化法转化工业酿酒酵母Sc 1 6,转化子培养上清液的淀... 详细信息

将PCR扩增的扣囊腹膜孢酵母菌淀粉酶基因 ,与磷酸甘油酸激酶基因 1启动子和α 分泌序列一起插入含 2 μm的酵母穿梭质粒YEp3 5 2 ,构建酵母菌重组表达质粒并命名为pLA8α。用醋酸锂转化法转化工业酿酒酵母Sc 1 6,转化子培养上清液的淀粉酶活性为 6 8U/mL ,46%的淀粉被降解 ,SDS PAGE检测到约 5 5ku的蛋白条带。转化子在非选择条件下的遗传稳定性为82 %。

关键词：淀粉酶酶基因腹膜培养上清液穿梭质粒分泌菌株转化子高效表达酿酒酵母