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一种BAC载体的构建及其在CYP2A6单倍型分析中的应用

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医学研究杂志 2024年第2期53卷 24-28,111页

作者：赵芳玲綦钰莹蔡剑平戴大鹏北京大学第五临床医学院 100730 国家老年医学中心、国家卫生健康委北京老年医学研究所、国家卫生健康委北京老年医学重点实验室、中国医学科学院老年医学研究院 100730

目的构建大片段基因克隆用高拷贝BAC质粒载体以用于CYP2A6基因的单倍型分析。方法利用退火程序生成包含多克隆位点的寡核苷酸,分别连接入HindⅢ/BamHⅠ双酶切后的pGEM-3Z载体及pBeloBAC11载体,随后使用HindⅢ单酶切中间载体并连接,利用... 详细信息

目的构建大片段基因克隆用高拷贝BAC质粒载体以用于CYP2A6基因的单倍型分析。方法利用退火程序生成包含多克隆位点的寡核苷酸,分别连接入HindⅢ/BamHⅠ双酶切后的pGEM-3Z载体及pBeloBAC11载体,随后使用HindⅢ单酶切中间载体并连接,利用蓝白斑筛选获得头尾串联的高拷贝BAC载体pBAC-BJH。利用STI PCR的方法扩增CYP2A6基因全长,经切胶纯化后利用BstBⅠ与MluⅠ双酶切,并与同样双酶切的pBAC-BJH载体连接,转化大肠杆菌以获得包含新突变355A>T的全长Bac克隆用于单倍型测序分析。结果成功构建了增加7个多克隆酶切位点的高拷贝BAC载体pBAC-BJH。该载体具有拷贝数高、可选酶切位点多等优势。利用该载体对CYP2A6的基因分型结果显示,新突变体携带22C>T、51A>G、355A>T,3个SNP单倍型为CGT。结论成功构建了方便用于大片段基因克隆的载体pBAC-BJH,该载体可用于p450基因的单倍型分析及其他大片段基因克隆分析。

关键词：高拷贝 BAC载体 CYP2A6 单倍型分析

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嗜盐单胞菌利用乙酸盐合成PHB的研究

化学工业与工程 2022年第5期39卷 119-126页

作者：晋彪张静洪坤强王智文陈涛天津大学化工学院天津300350 系统生物工程教育部重点实验室合成生物学前沿科学中心天津300072

首先测试了嗜盐单胞菌Halomonas ***1.0对乙酸钠的耐受性,结果显示乙酸钠浓度由25 g·L^(-1) 提高到100 g·L^(-1) 时对TD1.0生长的抑制率只有45.8%。在摇瓶培养中,TD1.0在36 h内消耗完27.3 g·L^(-1) 乙酸钠,细胞干质量达到9.6 g·L^(-... 详细信息

首先测试了嗜盐单胞菌Halomonas ***1.0对乙酸钠的耐受性,结果显示乙酸钠浓度由25 g·L^(-1) 提高到100 g·L^(-1) 时对TD1.0生长的抑制率只有45.8%。在摇瓶培养中,TD1.0在36 h内消耗完27.3 g·L^(-1) 乙酸钠,细胞干质量达到9.6 g·L^(-1) ,其中PHB质量分数为61%,表明该菌株具有很好的高浓度乙酸钠耐受性和利用乙酸合成PHB的特性。随后为进一步提高乙酸钠的利用速度,在TD1.0中分别用高拷贝和低拷贝表达载体表达了来自枯草芽孢杆菌的乙酰辅酶A合成酶基因acs,结果显示,含有高拷贝表达质粒的菌株TD-PN59的乙酸盐平均利用速率为0.91 g·L^(-1) ·h^(-1),比TD1.0提高了19.7%。TD-PN59的细胞干质量和PHB质量分数分别达到9.98 g·L^(-1) 和65%,PHB产量达到6.49 g·L^(-1) ,比TD1.0提高了约10.8%。在以葡萄糖和乙酸钠为混合碳源(10 g·L^(-1) Glu和10 g·L^(-1) NaAC)的培养基中,利用低拷贝载体表达acs的TD-PN85菌株的乙酸钠利用速率显著高于TD1.0,并且在一定程度上缓解了碳分解代谢物阻遏现象(CCR),促进了葡萄糖和乙酸钠的共利用。

关键词：乙酰辅酶A合成酶枯草芽孢杆菌乙酸盐高拷贝乙酸钠混合碳源载体表达摇瓶培养

超表达胞外分泌相关基因促进毕赤酵母重组蛋白EGFP外泌的初步研究

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超表达胞外分泌相关基因促进毕赤酵母重组蛋白EGFP外泌的初步研究

作者：崔鑫湖北大学

学位级别：硕士

近年来,毕赤酵母逐渐成为最常用的蛋白表达系统之一,利用该系统成功表达了数千种蛋白。增加外源基因拷贝数可以提高蛋白表达量,然而拷贝数和蛋白分泌量不成正比,高拷贝菌株中经常出现异源蛋白滞留在胞内的现象。因此,探究并解决高拷贝... 详细信息

近年来,毕赤酵母逐渐成为最常用的蛋白表达系统之一,利用该系统成功表达了数千种蛋白。增加外源基因拷贝数可以提高蛋白表达量,然而拷贝数和蛋白分泌量不成正比,高拷贝菌株中经常出现异源蛋白滞留在胞内的现象。因此,探究并解决高拷贝菌株中重组蛋白滞留胞内的机制,提高异源蛋白的分泌至关重要。在前期的工作,利用EGFP做报告基因构建了1,2,4,6,8拷贝的毕赤酵母分泌表达菌株,诱导发酵发现2拷贝菌株分泌水平最高,8拷贝菌株分泌水平最低。荧光分析发现拷贝数和总荧光强度成正比,8拷贝菌株总荧光最强,但是大量的重组蛋白滞留在内质网,不能分泌到胞外。本研究旨在研究8拷贝EGFP表达菌株中重组蛋白停留在内质网的原因,拟通过共表达转录组中下调基因、甲醇利用途径相关基因、内质网分子伴侣、转录因子、细胞周期蛋白等辅助因子以提高8拷贝EGFP菌株的分泌量。主要结果如下:1.转录组测序,挑选log2FC≤-3且与分泌相关的下调基因进行过表达。将最高分泌量的2拷贝菌株和最少分泌量的8拷贝菌株甲醇诱导3天的细胞送公司进行转录组测序和分析。从中找到log2FC≤-3且与分泌相关的下调基因在8拷贝EGFP表达菌株中进行过表达,结果表明下调基因(Mob1、PAS＿chr1-4＿0570、PAS＿chr2-1＿0659、Fet4、Pry2、Ctr1、Dip5、Yfl040w、Pet123、PAS＿chr2-1＿0659和PAS＿chr1-1＿0479)能够促进8拷贝菌株EGFP的分泌,其中过表达PAS＿chr2-1＿0659、Fet4、Pry2和Dip5能够增加EGFP总产量1.5倍左右;2.过表达甲醇利用途径和磷酸戊糖途径相关基因。蛋白质在合成和分泌中需要不断地能量供应,大量异源蛋白表达会对细胞造成代谢压力,因此增强8拷贝菌株的能量供给或许能够促进EGFP分泌。甲醇利用途径能产生大量的ATP和还原力,因此过表达甲醇利用途径相关基因,结果显示过表达甲醇诱导型启动子P的正调控因子Gcn5、Mxr1、甲醇异化途径中的Fdh和磷酸戊糖途径的Gnd2可以提高EGFP分泌量约1.3-2倍。3.过表达分泌途径中相关分子伴侣。为了改善8拷贝菌株的EGFP分泌,选择帮助重组蛋白转位、折叠、糖基化和囊泡运输的分子伴侣进行过表达,结果表明过表达与折叠相关的分子伴侣(Ssa1、Aha1、Cne1、GⅡ和Sly1)能使EGFP总产量提高1.2-1.8倍;过表达转位、糖基化以及囊泡运输相关的分子伴侣Ydj1、GⅡ和Sed4可以增加EGFP分泌量1.4倍;4.过表达转录因子。转录因子Gcn4、Hsf1和Aft1参与细胞内氨基酸合成、内质网蛋白分泌以及能量产生等途径,过表达Gcn4、Hsf1和Aft1都能提高EGFP分泌量2倍左右;总之,目前已经得到了可以提高分泌的辅助蛋白,下一步将会组合表达具有促进分泌效果的辅助蛋白,从而改善8拷贝EGFP菌株的分泌表达。虽然能量强化能够提高分泌,但是促进效果有限,后继需要将能量导向到内质网。本研究获得的新辅助因子为优化毕赤酵母异源蛋白分泌表达提供了更多的选择。

关键词：毕赤酵母分泌表达转录组分析高拷贝转录因子甲醇利用

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表达人胰岛素前体的毕赤酵母菌株的构建

北京化工大学学报（自然科学版） 2004年第2期31卷 21-23页

作者：李军陈劲春李江邹保华吴为华孙悦北京化工大学化学工程学院北京100029

将人胰岛素前体 (HIP)基因插入到毕赤酵母Pichiapastoris的分泌表达质粒 pPIC9K中 ,得到分泌表达质粒pPIC9K/HIP并用电转化法转化P .pastorisGS1 1 5。筛选出整合型His+ Muts 菌株 ,进一步用G4 1 8筛选获得高拷贝转化子。经诱导培养后 ,... 详细信息

将人胰岛素前体 (HIP)基因插入到毕赤酵母Pichiapastoris的分泌表达质粒 pPIC9K中 ,得到分泌表达质粒pPIC9K/HIP并用电转化法转化P .pastorisGS1 1 5。筛选出整合型His+ Muts 菌株 ,进一步用G4 1 8筛选获得高拷贝转化子。经诱导培养后 ,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)证明HIP在毕赤酵母中能有效分泌表达。对毕赤酵母中外源基因的稳定性进行了研究。

关键词：人胰岛素前体毕赤酵母高拷贝稳定性

构建人Cu,Zn-SOD毕赤酵母转化子及其高表达研究

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食品科学 2012年第5期33卷 218-223页

作者：迟春萍时成波曹玉锋陈子杨徐军张健锋贾媛李铮王小杰牛灵田海山孙彪李校堃吉林农业大学生命科学学院吉林长春130118 长春生物制品研究所吉林长春130062 中国科学院微生物研究所北京100080 四平华科生物技术有限责任公司吉林四平136000

设计人Cu,Zn-SOD酵母偏爱密码子并化学合成,与pPIC9K连接,构建酵母偏爱密码子的人Cu,Zn-SOD基因真核表达载体,通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母GS115高拷贝转化子,获得的重组高表达酵母菌株建立主种子批。经Southern blot鉴定,基因拷... 详细信息

设计人Cu,Zn-SOD酵母偏爱密码子并化学合成,与pPIC9K连接,构建酵母偏爱密码子的人Cu,Zn-SOD基因真核表达载体,通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母GS115高拷贝转化子,获得的重组高表达酵母菌株建立主种子批。经Southern blot鉴定,基因拷贝数提高2～8倍,活性检测显示提高2～4倍。重组菌的目的基因拷贝数与表达产物呈正相关;表达产物为二聚体,其分子质量为40kD左右,低糖基化,均为分泌表达。Western blot法分析,对Cu,Zn-SOD抗体具有特异性反应。转化子在培养16h后进入对数生长期,24h后进入生长稳定期;转化子培养20h左右进行诱导表达最为合适。高拷贝的3株重组菌经50次传代后插入的目的基因保持稳定;Cu,Zn-SOD转化子用正交试验筛选摇瓶的诱导表达条件,经诱导表达,Cu,Zn-SOD表达上清最高活性大于600U/mL。确立最适摇瓶培养条件为pH6.0、30℃、体积分数1.5%甲醇诱导72h测得上清的目的蛋白表达最好,表明构建了高表达菌株。

关键词：毕赤酵母GS115 Cu Zn-SOD 电转化法高拷贝真核表达

人胰岛素原密码子的优化及其在毕赤酵母中的表达

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厦门大学学报（自然科学版） 2012年第1期51卷 101-106页

作者：史莹飞敬科举凌雪萍卢英华厦门大学化学化工学院福建厦门361005

依据毕赤酵母偏好密码子,设计合成长效人胰岛素原(human proinsulin,HPI)基因序列,所合成的HPI基因全长为200bp,并在其N端添加信号肽(EEAEAEAEPK)以提高目的蛋白表达.将改造后基因克隆到pPIC9K载体中,构建分泌表达型载体pPIC9K-HPI,转... 详细信息

依据毕赤酵母偏好密码子,设计合成长效人胰岛素原(human proinsulin,HPI)基因序列,所合成的HPI基因全长为200bp,并在其N端添加信号肽(EEAEAEAEPK)以提高目的蛋白表达.将改造后基因克隆到pPIC9K载体中,构建分泌表达型载体pPIC9K-HPI,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中.用遗传霉素G418梯度筛选获得高拷贝菌株,在甲醇诱导下表达分子质量为7.87ku的HPI,利用金属螯合层析纯化蛋白质,胰蛋白酶酶切后利用人胰岛素试剂盒测得生物活性,HPI摇瓶最高产量可达35.4mg/L.该研究为获得大量长效胰岛素基因工程产品奠定研究基础.

关键词：胰岛素原基因改造高拷贝毕赤酵母

构建铜锌超氧化物歧化酶毕赤酵母转化子及其高表达分析

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中国兽医学报 2011年第12期31卷 1763-1768页

作者：迟春萍隋红刘畅时成波王艳芳郭立君李校堃长春生物制品研究所吉林长春130062 吉林农业大学吉林长春130118

设计铜锌超氧化物歧化酶酵母偏爱密码子并化学合成,与pPIC9K连接,构建酵母偏爱密码子的铜锌超氧化物歧化酶基因真核表达载体;通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母GS115高拷贝转化子,获得重组高表达酵母菌株建立主种子批。经Southern blot... 详细信息

设计铜锌超氧化物歧化酶酵母偏爱密码子并化学合成,与pPIC9K连接,构建酵母偏爱密码子的铜锌超氧化物歧化酶基因真核表达载体;通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母GS115高拷贝转化子,获得重组高表达酵母菌株建立主种子批。经Southern blot鉴定,高拷贝基因比低拷贝高2～8倍,表达活性高2～4倍。重组菌的目的基因拷贝数与表达产物呈正相关;表达产物为二聚体,相对分子质量为40 000左右,低糖基化,均为分泌表达。West-ern blot法分析,对Cu,Zn-SOD抗体具有特异性反应。转化子在培养16h后进入对数生长期,24h后进入生长稳定期;转化子培养20h左右进行诱导表达最为合适。Cu,Zn-SOD转化子用正交试验筛选摇瓶的诱导表达条件,经诱导表达,Cu,Zn-SOD表达上清最高活性大于600U/mL。确立最适摇瓶培养条件为pH6.0,30℃,1.5%甲醇诱导浓度诱导72h上清的目的蛋白表达最好。高拷贝的3株重组菌经50次传代后插入的目的基因保持稳定。本研究为中试工艺研究奠定了基础。

关键词：毕赤酵母GS115 Cu Zn-SOD 电转化法高拷贝真核表达

S-2-氯丙酸脱卤酶在毕赤酵母中的重组表达

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中国生物工程杂志 2013年第8期33卷 24-30页

作者：秦迎春杨立荣徐刚吴坚平浙江大学化学工程与生物工程学系杭州310027

根据S-2-氯丙酸脱卤酶的基因序列设计引物,克隆重组大肠杆菌中的S-2-氯丙酸脱卤酶基因。将目的基因片段构建到pPIC9K载体,经Sac I单酶切后转化到毕赤酵母GS115中,通过G418抗性YPD平板筛选高拷贝重组子,甲醇诱导成功实现胞外活性表达。... 详细信息

根据S-2-氯丙酸脱卤酶的基因序列设计引物,克隆重组大肠杆菌中的S-2-氯丙酸脱卤酶基因。将目的基因片段构建到pPIC9K载体,经Sac I单酶切后转化到毕赤酵母GS115中,通过G418抗性YPD平板筛选高拷贝重组子,甲醇诱导成功实现胞外活性表达。重点考察了基因拷贝数和甲醇浓度的影响,结果表明重组子含有12个拷贝,甲醇浓度为1%时较佳,重组脱卤酶的酶活可达236U/L。重组毕赤酵母具有很好的遗传稳定性。对该酶最适反应温度及pH进行研究,表明其最适反应温度为50℃,最适pH为9.5。

关键词： S-2-氯丙酸脱卤酶毕赤酵母胞外活性表达高拷贝

ART-PCR方法的建立及扩增低拷贝RNA的初步研究

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药物生物技术 2013年第6期20卷 475-479页

作者：李铁军周宋峰陆毅祥朱远源江苏莱芙时代生物科技有限公司百奥迈科生物技术有限公司南通大学小核酸技术与应用研究所中国药科大学

建立依赖反义RNA和核糖核酸酶T1(RNase T1)的PCR方法,称为ART-PCR,用于扩增高拷贝RNA和复杂RNA样本中的低拷贝RNA。首先,设计待检低拷贝RNA的反义RNA分子,在高拷贝和复杂RNA样本中与待检低拷贝RNA退火后用RNase T1消化,反转录后用PCR扩... 详细信息

建立依赖反义RNA和核糖核酸酶T1(RNase T1)的PCR方法,称为ART-PCR,用于扩增高拷贝RNA和复杂RNA样本中的低拷贝RNA。首先,设计待检低拷贝RNA的反义RNA分子,在高拷贝和复杂RNA样本中与待检低拷贝RNA退火后用RNase T1消化,反转录后用PCR扩增。进一步,用ARPE-19细胞中低表达基因干扰素γ(IFNG)作为实例,用ART-PCR和常规实时定量PCR(RT-qPCR)检测。结果显示,用ART-PCR可以很好地消除常规RT-qPCR中低拷贝RNA的PCR抑制效应。研究结果初步表明ART-PCR可以作为检测低拷贝RNA的理想工具,这对于RNA功能的基础研究以及基于多重PCR的临床复合病毒感染的基因诊断方法的优化、推广具有重要的参考价值。

关键词：依赖反义RNA的核糖核酸酶T1 PCR 低拷贝高拷贝基因 RNase T1 dsRNA ssRNA 病毒