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高山被孢霉谷氨酸代谢调控产脂的初步研究

食品与发酵工业 2022年第20期48卷 188-195页

作者：蔡毅博陈海琴张灏陈卫江南大学食品学院江苏无锡214122

为解析谷氨酸代谢对产油丝状真菌高山被孢霉(Mortierella alpina)脂质合成的影响,该文考察了补加谷氨酸条件下高山被孢霉谷氨酸代谢相关酶的基因转录水平、酶活性水平和总脂产量等指标。结果显示,补加谷氨酸显著影响了高山被孢霉胞内谷... 详细信息

为解析谷氨酸代谢对产油丝状真菌高山被孢霉(Mortierella alpina)脂质合成的影响,该文考察了补加谷氨酸条件下高山被孢霉谷氨酸代谢相关酶的基因转录水平、酶活性水平和总脂产量等指标。结果显示,补加谷氨酸显著影响了高山被孢霉胞内谷氨酸代谢相关基因的转录水平,NADP+型谷氨酸脱氢酶和谷氨酸脱羧酶活性的增加为脂肪酸从头合成提供了充足的还原力,这使得细胞总脂含量提升了3 g/L(约占干重比例10%)。该研究为氨基酸介导的微生物脂质合成机制解析提供了参考。

关键词：高山被孢霉谷氨酸代谢脂质转录谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱羧酶

高山被孢霉NADP^(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶的异源表达与活性分析

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食品与发酵工业 2023年第2期49卷 13-19页

作者：王旭旭孙晓琪陈海琴赵建新陈卫唐鑫江南大学食品学院江苏无锡214122

产油真菌胞质中NADP^(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)能够为脂肪酸合成提供还原力,前期研究表明高山被孢霉的异柠檬酸脱氢酶4(Mortierella alpina isocitrate dehydrogenase4,MaIDH4)对脂质积累有积极的影响。为了深入研究MaIDH4的性质,该文将其在大肠杆菌和毕赤酵母系统中分别进行异源表达并纯化,均成功获得纯酶,并考察了不同表达系统对酶活性和产量的影响。首先克隆MaIDH4至表达载体pET28a(+)和pPink-HC-3CZHEK构建重组质粒,然后分别转化至Escherichia coli BL21(DE3)和PichiaPink TM Strain 2进行诱导表达,最后采用镍柱纯化获得携带10×His标签的MaIDH4重组酶,检测纯酶的比活力分别是34.10 U/mg和43.00 U/mg,酶产量分别为10.28 U/L和159.12 U/L。通过纯酶比活力和酶产量分析表明相比于大肠杆菌表达系统,毕赤酵母宿主更适合MaIDH4的异源表达。

关键词：高山被孢霉异柠檬酸脱氢酶异源表达酶活性酶产量

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高山被孢霉产多不饱和脂肪酸发酵条件优化

中国酿造 2023年第11期42卷 224-229页

作者：贾路遥卢晓霆宋遥遥长春工业大学化学与生命科学学院吉林长春130012

以玉米糖为碳源,酵母膏为氮源,以生物量和油脂产量为评价指标,通过单因素试验和正交试验优化高山被孢霉(Mortierella alpina)3.12824发酵条件,并采用气相色谱(GC)分析高山被孢霉油脂的组成。结果表明,最佳发酵条件为玉米糖80.0 g/L、酵... 详细信息

以玉米糖为碳源,酵母膏为氮源,以生物量和油脂产量为评价指标,通过单因素试验和正交试验优化高山被孢霉(Mortierella alpina)3.12824发酵条件,并采用气相色谱(GC)分析高山被孢霉油脂的组成。结果表明,最佳发酵条件为玉米糖80.0 g/L、酵母膏12.0 g/L、KH_(2)PO43.8 g/L、NaNO33.4 g/L、MgSO4·7H_(2)O 0.5 g/L、装液量200 mL/L、发酵时间7 d、发酵温度25℃、初始pH 6.5。在此优化条件下,高山被孢霉发酵后生物量及油脂产量分别达到26.23 g/L和8.98 g/L。经GC分析高山被孢霉产油脂组成为软脂酸(C_(16:0))、硬脂酸(C_(18:0))、油酸(C_(18:1))、亚油酸(C_(18:2))、十八碳三烯酸(C_(18:3))、花生三烯酸(C_(20:3))、花生四烯酸(C_(20:4))、二十二烷酸(C_(22:0)),其中不饱和脂肪酸C_(18:1)、C_(18:2)、C_(18:3)、C_(20:3)、C_(20:4)的含量分别为17.72%、5.73%、0.75%、5.83%、39.93%,其总含量超过69.00%,多不饱和脂肪酸(C_(18:2)、C_(18:3)、C_(20:3)、C_(20:4))的总含量超过52.00%。

关键词：高山被孢霉玉米糖发酵条件优化多不饱和脂肪酸

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高山被孢霉低温应激条件下油脂代谢研究

粮食与油脂 2023年第8期36卷 46-51页

作者：刘雯茜王海军陈吴西李德茂刘秀敏李军河北科技师范学院食品科技学院河北秦皇岛066600 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308 天津科技大学生物工程学院天津300308 河北交通职业技术学院粮食工程研发中心河北石家庄050035

对高山被孢霉在不同温度下的生物量、油脂产量和油脂组成等指标进行研究,并开展了比较代谢组学研究。结果表明:在低温处理(15℃)时,高山被孢霉的生物量和油脂含量均低于常温(25℃)处理。但是,在低温条件下高山被孢霉的极性脂含量提高到... 详细信息

对高山被孢霉在不同温度下的生物量、油脂产量和油脂组成等指标进行研究,并开展了比较代谢组学研究。结果表明:在低温处理(15℃)时,高山被孢霉的生物量和油脂含量均低于常温(25℃)处理。但是,在低温条件下高山被孢霉的极性脂含量提高到了2.53倍,而且极性脂中的不饱和脂肪酸含量提高到了1.32倍,表明高山被孢霉的低温保护机制启动,大量合成极性脂和不饱和脂肪酸用于抵御低温应激。差异化合物筛选发现其中与油脂合成和降解有关的有10个化合物,与糖酵解(EMP)途径有关的有6个化合物,与氨基酸合成、降解和转运相关的化合物有5个。

关键词：高山被孢霉油脂代谢组学中性脂极性脂

高山被孢霉接种对栽培人参根腐病防御影响的机制解析

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高山被孢霉接种对栽培人参根腐病防御影响的机制解析

作者：王岩东北林业大学

学位级别：硕士

人参是我国传统名贵中药材,具有增强器官功能、抑制炎症、预防肿瘤及抗病毒等多重功能。中国作为世界上最早开展人参栽培的国家,现今栽培面积和产量位居世界首位,其作用及经济地位不容忽视。由于伐林栽参破坏林区植被系统,严重危及林区... 详细信息

人参是我国传统名贵中药材,具有增强器官功能、抑制炎症、预防肿瘤及抗病毒等多重功能。中国作为世界上最早开展人参栽培的国家,现今栽培面积和产量位居世界首位,其作用及经济地位不容忽视。由于伐林栽参破坏林区植被系统,严重危及林区生态安全,已被严令禁止,人参种植已向农田栽参模式转移。农田土壤病害严重、有益微生物少、养分失衡等诸多因素限制着人参产业的进一步发展。如何调控土壤微生态系统、促进微生物群落正向演替、有效防治土传病害是亟待解决的科学问题。本研究首先分析人参不同栽培土壤的理化及微生物学分布特征,明确被孢霉在土壤中的分布规律以及与土壤健康的相关性;进一步,为明确被孢霉对土传病害的防治潜力,以分离获得的高山被孢霉为代表菌株,采用平板培养与盆栽接种试验对被孢霉与根腐病原真菌尖孢镰刀菌及人参植物的相互作用进行了解析。获得的结果如下:(1)通过分析林地、农田和4年参地土壤养分发现,不同类型土壤中速效氮(NO-N和NH-N)、有效磷、全氮、全磷和有机质含量均存在显著差异;高通量测序显示,Alpha多样性表明林地土壤中细菌和真菌的丰富度和多样性显著高于4年参地土壤;被孢霉在不同类型土壤中均占有较高的比例,且在林地土壤中被孢霉的相对丰度显著高于农田和4年参地土壤,暗示土壤被孢霉的丰度可能成为土壤健康的指示因子。(2)从人参根际分离出一株高山被孢霉,分析其与土壤微生物的相互作用及促生潜力。结果显示,高山被孢霉的菌丝生长受到土壤中芽孢杆菌、链霉菌、短杆菌、木霉、青霉等益生菌和枝孢霉、曲霉等潜在病原菌的抑制;但与人参根腐病病原菌尖孢镰刀菌无明显相互作用;高山被孢霉具有生产吲哚乙酸的潜力,在含有3 mM色氨酸的PDA培养基中培养4 d时吲哚乙酸产量最高可达141.37 mg/L;培养5 d后,蛋白酶活性为5.5 U/mL;未发现其具有产铁载体、溶磷、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶活性。(3)为明确高山被孢霉接种对人参植株抗病性的影响,设置单接种高山被孢霉(MA)、单接种尖孢镰刀菌(FO)和两者共同接种(MA＿FO)的处理进行人参盆栽试验。结果表明,在人参根际接种高山被孢霉可显著减轻人参植株感染根腐病的症状,高山被孢霉与尖孢镰刀菌共接种可使人参植株中潜在病原菌的相对丰度降低,有益微生物的相对丰度增加,并可帮助人参根部构建更加稳定的微生物网络,以促进人参植株生长。(4)人参根际土壤系统解析结果表明,单独接种高山被孢霉可显著提高土壤中铵态氮、有效磷和有效钾的含量以及脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶的活性;db-RDA分析表明,土壤铵态氮和有效磷含量分别是对根际细菌和真菌群落差异影响最大的因素;线性回归分析表明,高山被孢霉可能通过提高土壤蔗糖酶活性来抵御尖孢镰刀菌的入侵;结合对土壤微生物组成和组间差异分析表明,高山被孢霉接种可显著降低土壤中尖孢镰刀菌的相对丰度,有助于土壤理化及微生物群落的正向演替。

关键词：人参高山被孢霉尖孢镰刀菌微生物群落土壤生物防治

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高山被孢霉谷氨酸代谢与脂质积累的关系

高山被孢霉谷氨酸代谢与脂质积累的关系

作者：蔡毅博江南大学

学位级别：硕士

产油丝状真菌高山被孢霉(Mortierella alpina)具备工业化生产花生四烯酸的能力,是可持续生产多不饱和脂肪酸的理想菌株。氮限制能够显著促进高山被孢霉产脂,且细胞内以谷氨酸代谢为中心的碳、氮循环与脂质合成关联密切。本论文以解析高... 详细信息

产油丝状真菌高山被孢霉(Mortierella alpina)具备工业化生产花生四烯酸的能力,是可持续生产多不饱和脂肪酸的理想菌株。氮限制能够显著促进高山被孢霉产脂,且细胞内以谷氨酸代谢为中心的碳、氮循环与脂质合成关联密切。本论文以解析高山被孢霉胞内“谷氨酸-脂质”代谢机制、促进脂质积累为目的。实验通过补加谷氨酸改变高山被孢霉的生长模式,考察高山被孢霉生物量、脂质产量和代谢物丰度的变化。结果显示,补加谷氨酸改变了高山被孢霉胞内碳、氮代谢相关酶的基因转录和酶活性水平,造成了高山被孢霉代谢物丰度和产脂的变化。此外,联合补加氨基酸发酵显著促进了高山被孢霉脂质积累能力。主要研究内容及结果如下。(1)分析了补加谷氨酸对高山被孢霉产脂和代谢的影响。在72 h向发酵液补加谷氨酸至终浓度为0.8 g/L使高山被孢霉脂肪酸产量提升了1.3 g/L(约占干重的10%)。高山被孢霉代谢物分析显示,谷氨酸代谢显著调控了三羧酸循环、谷氨酸脱氢、谷氨酸脱羧、氮代谢等路径,使得包括有机酸、氨基酸及其衍生物、尿素和核苷酸等代谢物含量发生变化,同时调节了氧化还原稳态、呼吸作用、信号传递等诸多生理行为。(2)考察了谷氨酸代谢对高山被孢霉胞内碳、氮代谢关键酶的基因转录水平与酶活性水平的影响。发酵液中补加的谷氨酸在96 h被完全耗尽,谷氨酸代谢调节了高山被孢霉胞内碳、氮代谢相关酶的基因转录水平。葡萄糖6-磷酸脱氢酶、NADP型谷氨酸脱氢酶和谷氨酸脱羧酶活性水平显著提升,促进了高山被孢霉胞内碳、氮循环。此外,特异性抑制谷氨酸脱羧酶活性对高山被孢霉生物量和脂肪酸产量形成负调控。(3)考察了高山被孢霉胞内氨基酸丰度与脂质积累的关系。补加谷氨酸造成连续时间点下高山被孢霉胞内谷氨酸及其他氨基酸(如4-氨基丁酸、精氨酸和脯氨酸等)的丰度变化。外源添加4-丙戊酸钠特异性抑制了高山被孢霉琥珀酸半醛脱氢酶活性,消除了谷氨酸代谢对脂质产量的提升作用,谷氨酸-4-氨基丁酸联合补加发酵使得高山被孢霉脂肪酸产量增加了0.5 g/L(约占干重的5%)。谷氨酸代谢通过改变高山被孢霉精氨酸琥珀酸裂解酶活性调节精氨酸合成,谷氨酸-精氨酸联合补加发酵使得高山被孢霉脂肪酸产量提升了近1.1 g/L(约占干重的10%)。

关键词：高山被孢霉谷氨酸代谢脂质积累氨基酸丰度联合补加发酵

高山被孢霉异柠檬酸脱氢酶的表达、纯化及酶学性质研究

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高山被孢霉异柠檬酸脱氢酶的表达、纯化及酶学性质研究

作者：王旭旭江南大学

学位级别：硕士

产油微生物中的异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenase,IDH)在脂肪酸合成中发挥着重要的作用,本实验室前期研究发现,在高山被孢霉中同源过表达NAD-IDH(MaIDH3)会引起胞内柠檬酸含量减少,进而导致脂质积累量降低;同源过表达NADP-IDH(M... 详细信息

产油微生物中的异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenase,IDH)在脂肪酸合成中发挥着重要的作用,本实验室前期研究发现,在高山被孢霉中同源过表达NAD-IDH(MaIDH3)会引起胞内柠檬酸含量减少,进而导致脂质积累量降低;同源过表达NADP-IDH(MaIDH4)则通过增加NADPH(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,还原型辅酶Ⅱ)的含量,对脂质合成产生促进的作用,但是二者的酶学性质尚未得到考察。前期将二者在大肠杆菌中进行异源表达,但没有得到MaIDH3的活性蛋白。因此,本研究尝试选择毕赤酵母表达系统对MaIDH3和MaIDH4进行异源表达,探究大肠杆菌和毕赤酵母表达系统对MaIDH3和MaIDH4产量和活性的影响,并对相应纯酶进行酶学性质研究。本文的主要研究结果如下:(1)分别构建MaIDH3和MaIDH4的毕赤酵母重组菌。在目的基因羧基端添加10×His标签并在甲醇营养型巴斯德毕赤酵母Pichia Pink Strain 2中进行表达。免疫印迹分析显示,MaIDH3和MaIDH4在毕赤酵母中成功表达。为了提高目的蛋白的表达水平,分别对MaIDH3和MaIDH4重组菌的诱导条件进行优化。通过蛋白表达量和酶活性分析确定了MaIDH3重组菌的最佳诱导条件为:甲醇浓度为2.5%,诱导时间为60 h;MaIDH4重组菌的最佳诱导条件为:甲醇浓度为2.5%,诱导时间为36 h。(2)MaIDH3重组酶的纯化与活性测定。前期亚细胞定位预测MaIDH3位于线粒体,现通过免疫印迹分析确定了毕赤酵母重组菌中MaIDH3的线粒体定位。为了获得位于线粒体的目的蛋白MaIDH3,首先通过梯度离心富集线粒体组分。然后探索了线粒体破碎条件,确定了线粒体蛋白的最佳制备条件为:超声破碎3 s停4.5 s,总时长10 min,超声功率585 W。最后通过镍柱分离纯化获得了MaIDH3重组酶,但MaIDH3纯酶未检测到活性。(3)MaIDH4重组酶的纯化与酶学性质研究。利用镍柱对MaIDH4大肠杆菌和毕赤酵母重组菌中的目的蛋白进行分离纯化,均成功获得具有活性的MaIDH4纯酶。来自大肠杆菌和毕赤酵母表达系统的MaIDH4酶产量分别是10.28 U/L和159.12 U/L,纯酶的比活力分别为34.10 U/mg和43.00 U/mg,可看出毕赤酵母表达系统更适合MaIDH4的表达。对毕赤酵母表达系统中MaIDH4重组酶进行酶学性质研究,确定了MaIDH4重组酶仅依赖于辅酶NADP,Mn作用下酶活性最大,Mg次之。在Mn或Mg存在时,MaIDH4的最适反应温度分别是60℃和65℃,最适pH分别为8.5和9.5,在35℃～45℃和pH为7.5～8.0的环境中MaIDH4活性能够保持稳定,腺嘌呤核苷三磷酸和柠檬酸均会抑制MaIDH4的活性。在Mn或Mg作用下,MaIDH4对NADP的催化效率分别为16.33 L/(μmol·s)和3.86 L/(μmol·s),对底物异柠檬酸的催化效率分别是3.06 L/(μmol·s)和0.65 L/(μmol·s)。

关键词：异柠檬酸脱氢酶高山被孢霉异源表达纯化酶学性质

人参-丁香醇提物抑制高山被孢霉脂质合成的活性评价

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食品工业科技 2022年第21期43卷 388-395页

作者：倪伟锋赵大庆倪以宇白竹林王思明长春中医药大学吉林省人参科学研究院吉林长春130000

探究人参-丁香醇提物抑制脂质合成并对其机制进行初步研究。通过建立丰产脂肪酸的高山被孢霉(Mortierella alpina,MA)脂质筛选模型,利用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)筛选出脂质合成抑制最优的人参丁香药对用药比例和提取溶媒,测定MA内... 详细信息

探究人参-丁香醇提物抑制脂质合成并对其机制进行初步研究。通过建立丰产脂肪酸的高山被孢霉(Mortierella alpina,MA)脂质筛选模型,利用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)筛选出脂质合成抑制最优的人参丁香药对用药比例和提取溶媒,测定MA内甘油三酯含量、电镜观察其形态并进行脂肪酸气质(GC-MS)分析,通过RT-PCR法测定乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、ATP-柠檬酸裂解酶(ACLY)、脂肪酸合酶(FAS)和苹果酸酶(ME)基因的mRNA表达并对相关酶活力进行检测,对3T3-L1前脂肪细胞采用MTT法测定其增殖活力同时采用油红O染色法测定细胞分化中脂质积累的能力并加以论证。结果显示,人参丁香药对抑制脂质合成的最优比例和提取溶媒是人参-丁香质量比为1:2的100%乙醇提取物(alcohol extract of genseng and clove,AEGC),AEGC在0~30μg/mL浓度内对3T3-L1前脂肪细胞的增殖、分化无细胞毒性,能抑制脂肪细胞分化过程中甘油三酯的形成和积累;RT-PCR结果显示,较空白组AEGC干预后,MA内ACC、ACLY、FAS和ME的m RNA水平显著下调(P高山被孢霉和3T3-L1前脂肪细胞的脂质合成。

关键词：高山被孢霉脂肪细胞脂质合成人参丁香

发酵温度对高山被孢霉合成ω3/ω6多不饱和脂肪酸的影响

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西南农业学报 2022年第9期35卷 2024-2029页

作者：夏继蓉金娜苏荣镇杨建华温燕龙李凌飞云南农业大学食品科学技术学院昆明650201

【目的】旨在探讨发酵温度对高山被孢霉(Mortierella alpina)合成ω3/ω6多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)的影响。【方法】将高山被孢霉分别置于6个发酵温度下(10、15、20、25、30、35℃)进行发酵培养,发酵结束后测... 详细信息

【目的】旨在探讨发酵温度对高山被孢霉(Mortierella alpina)合成ω3/ω6多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)的影响。【方法】将高山被孢霉分别置于6个发酵温度下(10、15、20、25、30、35℃)进行发酵培养,发酵结束后测定其生物量,并通过气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)测定菌体所含脂肪酸的组成及其含量,分析发酵温度对高山被孢霉合成ω3/ω6多不饱和脂肪酸的影响。【结果】随着发酵温度的升高,高山被孢霉菌体生物量呈现先上升后下降的趋势,25℃时菌体生物量达到最高(16.07 g/L),30℃及以上菌体几乎不生长。不同温度条件下检测到的脂肪酸组分和含量不同,在所有温度条件下高山被孢霉菌体中共检测到2种ω-3 PUFAs,分别是十八碳三烯酸(α-亚麻酸,ALA)和二十碳五烯酸(EPA);检测到4种ω-6 PUFAs,分别是十八碳二烯酸(亚油酸,LA)、十八碳三烯酸(γ-亚麻酸,GLA)、二十碳三烯酸(DGLA)和二十碳四烯酸(花生四烯酸,ARA)。发酵温度对高山被孢霉菌体中PUFAs产量具有显著影响,15℃时菌体中ω-3和ω-6 PUFAs产量均为最高,分别是51.20和273.13 mg/L;当温度为30℃及以上时,ω-3和ω-6 PUFAs的产量因菌体几乎不生长而受到抑制。【结论】发酵温度对高山被孢霉的菌体生物量及对菌体中ω-3和ω-6 PUFAs的合成具有显著影响,且存在温度阈值效应。25℃最有利于菌体生长,15℃时最有利于菌体积累ω-3和ω-6 PUFAs。本研究为高山被孢霉工业化生产ω-3/ω-6营养平衡膳食油脂奠定研究基础。

关键词：高山被孢霉发酵温度 ω-3多不饱和脂肪酸 ω-6多不饱和脂肪酸膳食油脂