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高山被孢霉Δ5脱饱和酶基因的分离与验证

Acta Genetica Sinica 2005年第9期32卷 986-992页

作者：朱敏刘智余龙江朱路程华华中科技大学生命科学与技术学院武汉430074

花生四烯酸(arachidonicacid)是人体的必需脂肪酸,具有独特的生物活性。Δ5脱饱和酶是花生四烯酸生物合成途径上的关键酶,以二高-γ-亚麻酸为底物,催化其第5位碳脱氢形成花生四烯酸。从花生四烯酸高产菌株高山被孢霉M6(Mortierellaalpi... 详细信息

花生四烯酸(arachidonicacid)是人体的必需脂肪酸,具有独特的生物活性。Δ5脱饱和酶是花生四烯酸生物合成途径上的关键酶,以二高-γ-亚麻酸为底物,催化其第5位碳脱氢形成花生四烯酸。从花生四烯酸高产菌株高山被孢霉M6(Mortierellaalpina)中通过RT-PCR分离了可能的编码Δ5脱饱和酶完整的cDNA,其大小为1366bp,编码446个氨基酸。推导出的蛋白质含有Δ5脂酰脱饱和酶中保守的特征性结构域,包括该蛋白质N端典型的细胞色素b5结构域,以及3个保守的组氨酸盒。为验证该蛋白质的功能,将该基因片段克隆到穿梭表达载体pPIC9K中,获得的重组载体pPIC9K-D5通过电转化法转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,利用G418耐受度筛选出高拷贝数的酵母转化子,在加入外源底物二高-γ-亚麻酸时,利用甲醇诱导酵母转化子表达外源基因。酵母转化子的油脂的气相色谱图谱中出现了一个花生四烯酸的特征峰,进一步对该峰进行气质联谱(GC-MS)分析,证实该峰是花生四烯酸。研究结果表明,从高山被孢霉M6中分离出Δ5脱饱和酶基因。

关键词：花生四烯酸高山被孢霉 △D5脱饱和酶基因巴斯德毕赤酵母GS115

高山被孢霉NADP^(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶的异源表达与活性分析

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食品与发酵工业 2023年第2期49卷 13-19页

作者：王旭旭孙晓琪陈海琴赵建新陈卫唐鑫江南大学食品学院江苏无锡214122

产油真菌胞质中NADP^(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)能够为脂肪酸合成提供还原力,前期研究表明高山被孢霉的异柠檬酸脱氢酶4(Mortierella alpina isocitrate dehydrogenase4,MaIDH4)对脂质积累有积极的影响。为了深入研究MaIDH4的性质,该文将其在大肠杆菌和毕赤酵母系统中分别进行异源表达并纯化,均成功获得纯酶,并考察了不同表达系统对酶活性和产量的影响。首先克隆MaIDH4至表达载体pET28a(+)和pPink-HC-3CZHEK构建重组质粒,然后分别转化至Escherichia coli BL21(DE3)和PichiaPink TM Strain 2进行诱导表达,最后采用镍柱纯化获得携带10×His标签的MaIDH4重组酶,检测纯酶的比活力分别是34.10 U/mg和43.00 U/mg,酶产量分别为10.28 U/L和159.12 U/L。通过纯酶比活力和酶产量分析表明相比于大肠杆菌表达系统,毕赤酵母宿主更适合MaIDH4的异源表达。

关键词：高山被孢霉异柠檬酸脱氢酶异源表达酶活性酶产量

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高山被孢霉产多不饱和脂肪酸发酵条件优化

中国酿造 2023年第11期42卷 224-229页

作者：贾路遥卢晓霆宋遥遥长春工业大学化学与生命科学学院吉林长春130012

以玉米糖为碳源,酵母膏为氮源,以生物量和油脂产量为评价指标,通过单因素试验和正交试验优化高山被孢霉(Mortierella alpina)3.12824发酵条件,并采用气相色谱(GC)分析高山被孢霉油脂的组成。结果表明,最佳发酵条件为玉米糖80.0 g/L、酵... 详细信息

以玉米糖为碳源,酵母膏为氮源,以生物量和油脂产量为评价指标,通过单因素试验和正交试验优化高山被孢霉(Mortierella alpina)3.12824发酵条件,并采用气相色谱(GC)分析高山被孢霉油脂的组成。结果表明,最佳发酵条件为玉米糖80.0 g/L、酵母膏12.0 g/L、KH_(2)PO43.8 g/L、NaNO33.4 g/L、MgSO4·7H_(2)O 0.5 g/L、装液量200 mL/L、发酵时间7 d、发酵温度25℃、初始pH 6.5。在此优化条件下,高山被孢霉发酵后生物量及油脂产量分别达到26.23 g/L和8.98 g/L。经GC分析高山被孢霉产油脂组成为软脂酸(C_(16:0))、硬脂酸(C_(18:0))、油酸(C_(18:1))、亚油酸(C_(18:2))、十八碳三烯酸(C_(18:3))、花生三烯酸(C_(20:3))、花生四烯酸(C_(20:4))、二十二烷酸(C_(22:0)),其中不饱和脂肪酸C_(18:1)、C_(18:2)、C_(18:3)、C_(20:3)、C_(20:4)的含量分别为17.72%、5.73%、0.75%、5.83%、39.93%,其总含量超过69.00%,多不饱和脂肪酸(C_(18:2)、C_(18:3)、C_(20:3)、C_(20:4))的总含量超过52.00%。

关键词：高山被孢霉玉米糖发酵条件优化多不饱和脂肪酸

高山被孢霉ATCC16266Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

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生物工程学报 2001年第2期17卷 161-164页

作者：刘莉李明春胡国武葛军张丽程志晖邢来君南开大学微生物系天津300071

Δ6 脂肪酸脱氢酶是形成γ 亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT MACL6中 ,酶切出 1 4kb的目的片段 ,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体 pYES2 .0 ,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒 pY... 详细信息

Δ6 脂肪酸脱氢酶是形成γ 亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT MACL6中 ,酶切出 1 4kb的目的片段 ,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体 pYES2 .0 ,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒 pYMAD6 ,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INCSc1中 ,在SC Ura合成培养基中 ,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下 ,加入外源底物亚油酸 ,经半乳糖诱导后 ,收集菌体。通过GC MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析 ,结果表明 ,产生了 31 6 %的γ 亚麻酸。这是迄今为止 ,国内外Δ6 脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。

关键词： △^6-脂肪酸脱氢酶基因 γ-亚麻酸酿酒酵母表达高山被孢霉

高山被孢霉GDP-L-岩藻糖合成途径中GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的克隆、表达和功能鉴定

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食品与发酵工业 2016年第11期42卷 14-19页

作者：王鸿超张陈周昕陈海琴顾震南张灏陈卫陈永泉江南大学食品学院江苏无锡214122

GDP-L-岩藻糖是糖复合物生物合成和糖类代谢的重要中间产物,作为岩藻糖转移酶的供体参与岩藻糖基化反应,具有重要的生理功能。高山被孢霉是重要的产油真菌,是唯一在分子水平上证明可合成GDP-L-岩藻糖的真菌。GDP-L-岩藻糖从头合成途径中... 详细信息

GDP-L-岩藻糖是糖复合物生物合成和糖类代谢的重要中间产物,作为岩藻糖转移酶的供体参与岩藻糖基化反应,具有重要的生理功能。高山被孢霉是重要的产油真菌,是唯一在分子水平上证明可合成GDP-L-岩藻糖的真菌。GDP-L-岩藻糖从头合成途径中的GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(GMD)能催化GDP-D-甘露糖合成GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖。对高山被孢霉中的GMD基因进行克隆、表达和功能鉴定,可进一步阐明GDP-L-岩藻糖体内代谢的分子生物机制。首先对GMD序列进行分析,并以p ET28a+质粒为骨架构建了GMD的表达载体,然后转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。进一步利用Ni金属螯合层析纯化目的蛋白,采用液相色谱-质谱法分析酶反应产物,表明纯化蛋白具有GMD活性。最后对高山被孢霉进行发酵培养,发现GDP-L-岩藻糖产量在氮源耗尽后较高,可达0.10 mg/g。同时GMD的转录水平在氮源耗尽后发生了明显的上调,表明GMD在氮源耗尽后对高山被孢霉体内GDP-L-岩藻糖的合成具有重要作用。这为进一步利用高山被孢霉发酵生产GDP-L-岩藻糖和酶法转化生产GDP-L-岩藻糖奠定了理论基础。

关键词：功能鉴定从头合成途径 GDP-甘露糖-4,6-脱水酶 GDP-L-岩藻糖高山被孢霉

高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b_5还原酶I的克隆、表达和功能鉴定

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微生物学通报 2016年第10期43卷 2172-2178页

作者：王明轩陈海琴顾震南陈卫陈永泉江南大学食品学院食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122

【目的】鉴定产油微生物高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b_5还原酶Ⅰ的功能。【方法】将高山被孢霉ATCC 32222中膜结合细胞色素b_5还原酶Ⅰ基因与人可溶性细胞色素b_5还原酶基因序列比对,去除该基因N端穿膜区域后,与人可溶性细胞色素b_... 详细信息

【目的】鉴定产油微生物高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b_5还原酶Ⅰ的功能。【方法】将高山被孢霉ATCC 32222中膜结合细胞色素b_5还原酶Ⅰ基因与人可溶性细胞色素b_5还原酶基因序列比对,去除该基因N端穿膜区域后,与人可溶性细胞色素b_5基因分别在大肠杆菌中异源表达;通过钴离子亲和层析、离子交换和分子排阻色谱等方法对表达产物进行纯化;以2,6-二氯靛酚钠(DCIP)为底物,测定细胞色素b_5还原酶Ⅰ的体外活性及其对NADH和NADPH的偏好性;在反应体系中存在NADH时,通过全波长扫描方法检测细胞色素b_5还原酶Ⅰ与细胞色素b_5的相互作用。【结果】高山被孢霉ATCC 32222中膜结合细胞色素b_5还原酶Ⅰ被成功可溶表达,经纯化后检测到体外活性:使用NADH时酶活为564.57 U,使用NADPH时为51.97 U;在NADH存在时,细胞色素b_5还原酶Ⅰ能够还原细胞色素b_5,其吸收峰从411 nm偏移至422 nm,并在521 nm和554 nm处吸光值增加。【结论】细胞色素b_5还原酶Ⅰ N端穿膜区域的去除增加了其可溶性,并保持了蛋白质活性;高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b_5还原酶Ⅰ基因编码的是一种NADH-细胞色素b_5还原酶,其在体外能与细胞色素b_5相互作用。

关键词：细胞色素b5还原酶细胞色素b5 高山被孢霉脂肪酸脱饱和反应

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高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的优化

食品与生物技术学报 2016年第1期35卷 101-106页

作者：曹刚刚管政兵廖祥儒蔡宇杰江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

研究了高山被孢霉液态发酵产花生四烯酸过程中主要底物和培养条件对花生四烯酸产量的影响。采用单因素和正交试验设计优化了碳源、氮源、无机盐的种类及浓度,找出了最佳的培养温度和变温策略。试验结果显示最佳碳源和氮源及浓度是:玉米... 详细信息

研究了高山被孢霉液态发酵产花生四烯酸过程中主要底物和培养条件对花生四烯酸产量的影响。采用单因素和正交试验设计优化了碳源、氮源、无机盐的种类及浓度,找出了最佳的培养温度和变温策略。试验结果显示最佳碳源和氮源及浓度是:玉米粉66 g/L,豆粕粉54 g/L;最佳无机盐配方是:KH_2PO_43 g/L,MgSO_41 g/L,Na_2SO_42 g/L。采取逐级变温培养:30℃(3 d),25℃(4 d),20℃(4 d)。优化后生物量和花生四烯酸产量分别达到52.3和13.6 g/L。

关键词：谷物粗粉碳氮比变温策略无机盐花生四烯酸高山被孢霉

高山被孢霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

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生物工程学报 2004年第1期20卷 34-38页

作者：李明春孙颖张琦邢来君南开大学微生物系国家微生物学重点学科天津300071

γ 亚麻酸 (GLA)作为人体必需的不饱和脂肪酸 ,具有重要的营养和药用价值。Δ6 脂肪酸脱氢酶是γ 亚麻酸合成途径中的关键酶。为了在毕赤酵母中建立一种新的合成γ 亚麻酸的表达体系 ,将高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因与胞内表达载体... 详细信息

γ 亚麻酸 (GLA)作为人体必需的不饱和脂肪酸 ,具有重要的营养和药用价值。Δ6 脂肪酸脱氢酶是γ 亚麻酸合成途径中的关键酶。为了在毕赤酵母中建立一种新的合成γ 亚麻酸的表达体系 ,将高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因与胞内表达载体pPIC3 5K连接 ,SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母SMD116 8,获得的转化子经PCR鉴定目的基因已整合到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达 ,通过脂肪酸气相色谱和气相色谱质谱 (GC MS)联用分析表明高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达 ,γ 亚麻酸含量占总脂肪酸的 16 2 6 %。

关键词：高山被孢霉毕赤酵母 Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因胞内表达

高山被孢霉Δ6Ⅱ-脱饱和酶的克隆、表达和功能鉴定

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中国生物工程杂志 2015年第12期35卷 37-44页

作者：史海粟陈海琴顾震南张灏陈永泉陈卫江南大学食品学院食品科学与技术国家重点实验室无锡214122

产油微生物高山被孢霉中Δ6脱饱和酶是决定ω3/ω6脂肪酸代谢流的关键酶,该酶对不同底物的催化特性直接决定该菌体内脂肪酸的流向。在已完成基因组测序的高山被孢霉ATCC32222中经注释发现它存在两种Δ6脱饱和酶(Δ6-Ⅰ和Δ6-Ⅱ),选择对... 详细信息

产油微生物高山被孢霉中Δ6脱饱和酶是决定ω3/ω6脂肪酸代谢流的关键酶,该酶对不同底物的催化特性直接决定该菌体内脂肪酸的流向。在已完成基因组测序的高山被孢霉ATCC32222中经注释发现它存在两种Δ6脱饱和酶(Δ6-Ⅰ和Δ6-Ⅱ),选择对其中的Δ6-Ⅱ脱饱和酶进行克隆、表达和功能鉴定。首先以p YES2/NT C质粒为骨架构建了Δ6-Ⅱ脱饱和酶基因(FADS6-Ⅱ)的表达载体(p YES2/NT C-FADS6-Ⅱ),并转化至酿酒酵母中进行诱导表达,进一步通过在重组菌培养基中添加Δ6脱饱和酶的底物来考察Δ6-Ⅱ脱饱和酶对各底物的偏好作用。实验结果表明,在分别添加0.5 mmol/L亚油酸(LA)和0.5 mmol/Lα-亚麻酸(ALA)时,Δ6-Ⅱ脱饱和酶对LA的转化率为42.94%,对ALA没有催化作用。而当底物添加方式改为同时添加LA和ALA时(分别为0.25 mmol/L),Δ6-Ⅱ脱饱和酶对LA的转化率为37.12%,对ALA仍没有催化作用。该实验结果为高山被孢霉中Δ6-Ⅱ脱饱和酶的催化功能研究提供了理论依据。

关键词： Δ6脱饱和酶高山被孢霉底物偏好性