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高分辨率熔解曲线分析技术检测血清游离DNA的EGFR基因突变

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中国肿瘤外科杂志 2016年第1期8卷 36-39页

作者：王卓井昶雯吴建中马蓉江苏省肿瘤医院临床肿瘤实验中心江苏南京210009

目的利用高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting,HRM)检测石蜡包埋组织和血清游离DNA的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变,分析两者之间的关系,并探讨其临床应用价值。方法利用HRM技术检测E... 详细信息

目的利用高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting,HRM)检测石蜡包埋组织和血清游离DNA的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变,分析两者之间的关系,并探讨其临床应用价值。方法利用HRM技术检测EGFR基因突变的方法,检测200例非小细胞肺癌患者石蜡包埋标本和200例相应的血清游离DNA,并将二者结果进行比较分析。结果HRM法检测非小细胞肺癌患者石蜡包埋组织DNA的EGFR基因突变总检出率为43.5%,血清游离DNA的EGFR基因突变总检出率为25.0%,HRM法检测血清游离DNA的EGFR基因突变与检测石蜡包埋组织DNA的EGFR基因突变相比,敏感性为57.5%,特异性为100%。结论 HRM法检测血清游离DNA的EGFR基因突变为无法获取肿瘤组织标本的患者提供了新的检测机会。

关键词：高分辨率熔解曲线分析技术 EGFR基因突变血清游离DNA

高分辨率熔解曲线分析技术检测BRAF基因V600E突变方法的建立及初步临床应用

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中国肿瘤外科杂志 2017年第4期9卷 243-245页

作者：汤俊明刘奇王学才乔国洪宜兴市人民医院检验科江苏宜兴214200

目的建立高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting,HRM)检测BRAF基因V600E突变的方法,并探讨其在临床检测中的应用价值。方法用所建方法检测16例甲状腺乳头状癌患者超声引导下细针穿刺抽吸活检标本,并与测序法结果进行比较分... 详细信息

目的建立高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting,HRM)检测BRAF基因V600E突变的方法,并探讨其在临床检测中的应用价值。方法用所建方法检测16例甲状腺乳头状癌患者超声引导下细针穿刺抽吸活检标本,并与测序法结果进行比较分析。结果所建HRM检测方法 Ct值与Tm的CV值均较小,重复性好。HRM法BRAF基因V600E突变检测标本的结果与测序法相比较,突变检出率分别为43.75%和40.00%,敏感性为100.00%,特异性为90.00%。结论成功建立的HRM法检测BRAF基因V600E突变敏感性高,特异性强,重复性好,操作简便,节约时间,成本低,适合细针穿刺抽吸活检标本检测BRAF基因V600E突变。

关键词： BRAF基因V600E 癌,乳头状甲状腺乳头状癌高分辨率熔解曲线分析技术

高分辨率熔解曲线分析技术——单核苷酸多态性（SNP）及突变研究的新工具

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医学新知 2012年第5期22卷 362-364,367页

作者：习华英三峡大学仁和医院检验科湖北宜昌443001

随着分子生物学技术的发展，在完成了人类基因组计划之后，人类已进入了后基因组时代。其中很重要的一部分，便是进行基因组多样性的研究。基因组多样性的变异，可以表现为：突变、插入、缺失、串联重复数目的变异，以及单核苷酸多态性... 详细信息

随着分子生物学技术的发展，在完成了人类基因组计划之后，人类已进入了后基因组时代。其中很重要的一部分，便是进行基因组多样性的研究。基因组多样性的变异，可以表现为：突变、插入、缺失、串联重复数目的变异，以及单核苷酸多态性（SingleNucleo．tidePolymorphism，SNP）。其中的SNP在基因组中分布十分广泛，是基因组多样性的主要表现。

关键词：高分辨率熔解曲线分析技术单核苷酸多态性(SNP) 突变

137例上海地区出生新生儿家系G6PD基因突变分析

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临床儿科杂志 2011年第9期29卷 833-836页

作者：许洪平王燕敏田国力上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院新生儿疾病筛查中心上海200040

目的了解上海地区出生的新生儿及其家系葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症基因突变特点,探讨该病的发病机制,提高诊断水平。方法用高分辨率熔解曲线分析(HRM)技术对中国人常见的突变类型G1388A、G1376T、A95G、G392T、G871A、C1311T、C10... 详细信息

目的了解上海地区出生的新生儿及其家系葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症基因突变特点,探讨该病的发病机制,提高诊断水平。方法用高分辨率熔解曲线分析(HRM)技术对中国人常见的突变类型G1388A、G1376T、A95G、G392T、G871A、C1311T、C1024T、C406T进行分析鉴定。结果 137例新生儿的家系中258例患者有213例检出突变类型,45例未检出突变类型。单个位点突变184例,G1376T,66例(30.9%);G1388A,64例(30%);A95G,25例(11.7%);C1024T,16例(7.5%);G392T,10例(4.7%);C406T,3例(1.4%)。复合位点突变共29例,G871A+C1311T+IVS11 93T→C,10例(4.7%);G1376T+IVS11 93T→C,7例(3.3%);C1311T+IVS11 93T→C,5例(2.3%);C406T+C1311T,2例(0.9%);G1388A+IVS11 93T→C,2例(0.9%);G1376T+C1311T+IVS11 93T→C,1例(0.5%);A95G+C1311T+IVS11 93T→C,1例(0.5%);C1024T+IVS11 93T→C,1例(0.5%)。结论随着外来人口的流入和通婚的增多,上海地区的G6PD基因突变也在发生变化,基因诊断是对该病分子水平的诊断,有利于杂合子的检测,以便做好产前筛查,同时对研究人口迁徙与遗传病分布之间的关系有一定意义。

关键词：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因突变高分辨率熔解曲线分析技术

应用HRM技术检测MASP2基因D120G突变和MASP2在小儿上呼吸道感染中的意义

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应用HRM技术检测MASP2基因D120G突变和MASP2在小儿上呼吸道感染中...

作者：熊思敏南方医科大学

学位级别：硕士

感染性疾病如小儿急性上呼吸道感染(upper respiratory tract infection, URTI,简称上感)、乙型肝炎(hepatitis B,简称乙肝)严重威胁着人类健康与生存质量。上感是小儿内科最为常见的疾病,在春季及冬季较为多发,也是儿科门诊和病房患者... 详细信息

感染性疾病如小儿急性上呼吸道感染(upper respiratory tract infection, URTI,简称上感)、乙型肝炎(hepatitis B,简称乙肝)严重威胁着人类健康与生存质量。上感是小儿内科最为常见的疾病,在春季及冬季较为多发,也是儿科门诊和病房患者所占比例最大的疾病。我国是乙肝的高发流行区,每年约30万人死于因乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)感染所致的重型肝炎、肝硬化和肝癌等疾病。对病原体是否易感取决于机体的抵抗力,而天然免疫是抗御病原体感染的第一道防线。在生物进化史上,补体系统已经存在350万年,是天然免疫防御的重要组成部分,其介导的免疫防御功能包括释放炎症介质、招募炎症细胞、破坏病原体,消除免疫复合物及凋亡细胞等在抵抗各种病原微生物中发挥了重要作用。补体激活的第三条途径—凝集素途径为天然免疫系统中重要组成部分。在凝集素途径中,甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)和纤维胶原素(ficolins)与甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1/2 (MBL-associated serine protease 1/2, MASP1/MASP2)等组成类似C1的复合物,MBL通过糖识别域(carbohydrate-recognition domain, CRD)识别并结合病原微生物表面的甘露糖、N-乙酰葡萄糖等相应糖结构后,经其胶原样区(collagen-like region, CLR)活化MASP1和MASP2,裂解补体C4和C2形成C3转化酶C4b2a,由此形成补体激活凝集素途径。MASP2蛋白由686个氨基酸组成,编码基因位于1号染色体p.36.22,全长20717 bp,包含12个外显子和12个内含子。MASP2分子为单肽链,从N端至C端有6个功能区组成,依次为：CUB区(complement subcomponent C1r/C1s-like domain)^ EGF区(epidermal growth factor-like domain)、CUB区、2个CCP区(complement control protein domain)、SP (serine proteases)区。研究表明,MASP蛋白N端及C端的功能相对独立：MASP2N端的3个结构域即2个CUB区和1个EGF区是MASP与MBL-CLR结合的区域,能以Ca2+依赖方式与MBL相互作用,形成MBL-MASPs复合物;而C末端的3个结构域即2个CCP区和1个SP区是丝氨酸蛋白酶的活性中心,激活补体主要依靠SP区发挥丝氨酸蛋白酶的作用,裂解补体C4和C2,产生C3转化酶。所以MASP2为MBL和几种(H、M和L)纤维胶原素激活补体所必需,在凝集素途径中发挥至关重要的作用。在患有多重感染和自身免疫性疾病的患者,首次描述MASP2缺损是由外外显子3所编码的功能区CUB1区产生GAC120GGC点突变,导致编码产物由酸性氨基酸天冬氨酸(Asp, D)变为中性氨基酸甘氨酸(Gly,G),即D120G突变,等电点发生了改变。因此,我们认为MASP2缺损是各种病原微生物反复感染的可能病因之一,而快速进行MASP2基因分型可能预测感染性疾病风险。目前,尚未见血浆MASP2浓度与上感关系的报道,故我们分析了上呼吸道感染儿童血浆MASP2水平并探讨其意义。第一章应用HRM技术检测MASP2基因D120G突变高分辨率熔解曲线(high-resolution melting, HRM)分析技术检测基因点突变具有以下优点：成本低,不需要设计昂贵的探针;在聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结束后,直接进行熔解曲线分析;快速、高通量,一次可以同时检测96或384个样本;闭管操作,防止样本脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)在PCR扩增后转移过程中污染;经过HRM分析处理后的PCR扩增产物还可以直接进行DNA测序,十分简洁便利。因此HRM技术已广泛应用于生命科学、食品安全、医学、畜牧业等各个领域的研究工作中。基于HRM上述特点,本研究拟应用HRM技术,建立检测分析人MASP2基因D120G突变的方法。材料与方法：1、标本：共收集153例全血标本,采用常规饱和酚/氯仿法提取外周血基因组DNA。2、点突变分析方法：(1)针对MASP2基因D120G变异位点设计PCR扩增体系及优化PCR条件。通过PCR定点诱变构建突变型纯合子基因,本科室构建保存MASP2基因片段经测序验证为野生型纯合子基因从而获得各种基因型样品。(2)建立检测MASP2基因D120G位点突变的HRM分析技术。针对变异位点设计HRM分析的引物,利用经测序已知的基因型样品优化HRM分析条件,从而建立分析MASP2基因的HRM分型方法。(3)根据HRM的分析结果,从各种

关键词：甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2 高分辨率熔解曲线分析技术基因分型急性上呼吸道感染