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高分辨熔解曲线分析技术在地中海贫血基因诊断及产前诊断中的应用研究

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高分辨熔解曲线分析技术在地中海贫血基因诊断及产前诊断中的应用...

作者：魏明广州医学院

学位级别：硕士

α地中海贫血(α-thalassemia，简称α地贫)是由于α珠蛋白基因缺失(缺失型)或点突变(非缺失型)导致α珠蛋白肽链合成减少或缺失而引起的一种溶血性贫血，呈常染色体隐性遗传。我国最常见的3种缺失型突变为--SEA、-α和-α，最常见的3... 详细信息

α地中海贫血(α-thalassemia，简称α地贫)是由于α珠蛋白基因缺失(缺失型)或点突变(非缺失型)导致α珠蛋白肽链合成减少或缺失而引起的一种溶血性贫血，呈常染色体隐性遗传。我国最常见的3种缺失型突变为--SEA、-α和-α，最常见的3种非缺失型突变为Hb Constant Spring (Hb CS)、Hb Quong Sze(Hb QS)和HbWestmead(Hb WS)。血红蛋白Bart’s水肿胎无法存活，临床上出生后最为严重的α地贫类型是血红蛋白H病(Hb H病)。Hb H病可分为缺失型Hb H病和非缺失型HbH病，而非缺失型Hb H病的临床症状往往重于缺失型Hb H病。因此在产前诊断中需特别注意避免漏诊非缺失型Hb H病。目前血红蛋白毛细管电泳技术能够筛查HbCS，但无法筛查Hb QS和Hb WS。对于单纯的α地贫点突变携带者，临床上多无症状，且血常规及血红蛋白分析多无异常，因此在地贫筛查时很容易漏诊(除外Hb CS)。在产前筛查时，若夫妇一方为α地贫，则另一方就有必要进行点突变检测。目前用于检测非缺失型α地贫的方法主要有反向斑点杂交、等位基因特异性PCR及测序等，但这些方法均存在一定局限性。本研究将高分辨熔解曲线分析技术(high resolutionmelting, HRM)用于检测中国人群常见3种α地贫点突变，并探讨其临床应用价值。一、目的应用高分辨熔解曲线分析技术检测中国人群常见3种α地贫点突变：Hb ConstantSpring (Hb CS)、Hb Quong Sze(Hb QS)和Hb Westmead(Hb WS)，以建立一种简便快捷、成本低廉、准确可靠、高通量的分子筛查方法。二、方法 1.样本采集：收集2008年12月至2011年10月基因型已知的α地贫点突变携带者样本81例，均经跨越断裂点聚合酶链反应(gap-polymerase chain reaction，gap-PCR)、反向点杂交(reverse dot blot，RDB)和DNA测序检测。其中男性34例，女性44例，年龄范围为4天-50岁，另外还包括3例产前诊断样本(羊水、绒毛、脐血各1例)。另收集2011年6月至2011年9月的正常健康人样本14例，其中男性5例，女性9例，年龄范围为22岁-48岁。正常对照样本经测序验证不含α (α和α)珠蛋白基因点突变。所有样本均来自广州市妇女儿童医疗中心产前诊断中心。 2. PCR扩增：采用LightScanner Primer Design软件(美国Idaho Technology公司)设计1对引物同时扩增α1和α2珠蛋白基因第3外显子，扩增区域覆盖Hb CS、Hb QS和Hb WS点突变。建立并优化PCR反应体系。 3. HRM分析： PCR扩增完成后采用LightScanner96(美国Idaho Technology公司)进行HRM分析，应用LightScanner Software with Call-IT2.0软件分析结果。三、结果经HRM分析显示出5种类型的熔解曲线：(1)Hb QS(αα/αα);(2)Hb QS合并--SEA或-α4(.2αα/--SEA、αα/-α);(3)Hb CS及Hb CS合并缺失型突变(αα/αα、αα/--SEA、αα/-α、αα/-α);(4)Hb WS及Hb WS合并--SEA或-α(αα/αα，αα/--SEA，αα/--α);(5)健康对照组(αα/αα)。所有α地贫点突变样本均可与正常对照正确区分，且Hb QS与Hb QS合并缺失型突变可相互区分。采用HRM筛查Hb CS、Hb QS及Hb WS的灵敏度和特异性为100%。四、结论 HRM分析技术是一种简单、准确、快速、高通量、低成本的遗传学分析方法，可作为中国人群常见三种α地贫点突变筛查的优选方法。 β地中海贫血(β-thalassemia，简称β地贫)是世界范围内最常见的单基因疾病之一，是由β珠蛋白基因(hemoglobin beta，HBB)突变导致β珠蛋白合成障碍而引起的一种溶血性贫血，呈常染色体隐性遗传。至今已发现200多种β地贫突变，其中CDs41-42-TCTT、IVS2-654C>T、-28A>G、CD17A>T及CDs71-72+A五种突变占所有突变类型的90%以上。重型β地贫患儿出生后需要定期输血治疗，除非实施造血干细胞移植成功，大部分患儿将于青少年夭折。由于目前对该病尚无理想的根治方法，因此通过产前诊断阻止重症患儿出生是防治β地贫的首选措施。目前国内外检测β地贫基因突变的方法主要有等位基因特异性PCR、反向点杂交、变性高效液相色谱等。本研究应用高分辨熔解曲线(High Resolution Melting，HRM)分析技术检测中国人群常见β地贫突变

关键词：高分辨熔解曲线 α地中海贫血点突变高分辨熔解曲线分析 β地中海贫血产前诊断

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高分辨熔解曲线分析技术在分子诊断中的应用

大连医科大学学报 2019年第6期41卷 481-486页

作者：李梅大连医科大学附属第二医院科研中心

当个体靶向治疗成为医学常规手段,分子诊断的临床需求日益增加。这就要求基因检测方法更准确、快速、简单易用。高分辨熔解曲线分析技术是以PCR扩增为基础的目标基因检测技术。该技术不仅具有单基因检测灵敏、快速的优点,同时可以检测... 详细信息

当个体靶向治疗成为医学常规手段,分子诊断的临床需求日益增加。这就要求基因检测方法更准确、快速、简单易用。高分辨熔解曲线分析技术是以PCR扩增为基础的目标基因检测技术。该技术不仅具有单基因检测灵敏、快速的优点,同时可以检测全部基因变异类型、灵活扩展检测通量,并以特有的低成本、低污染风险特点使其在临床分子诊断领域具有巨大开发潜能和应用价值。

关键词：高分辨熔解曲线分析聚合酶链扩增反应分子诊断

高分辨熔解曲线分析正常核型成人AML的NPM1基因突变

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中国热带医学 2012年第5期12卷 577-578,581页

作者：周薇陈建兰王汉平应逸谢健晋陈晓燕广州市第一人民医院血液科广东广州510180 广东省临床分子医学及分子诊断实验室广东广州510180

目的研究急性髓细胞白血病(AML)患者核仁磷酸蛋白1(NPM1)基因突变检测方法。方法应用PCR结合高分辨熔解曲线分析技术(HRM)和毛细管电泳法(CE)检测正常核型的成人AML样本的NPM1基因突变,并与CE法进行比较分析,结果经克隆测序验证。结果 8... 详细信息

目的研究急性髓细胞白血病(AML)患者核仁磷酸蛋白1(NPM1)基因突变检测方法。方法应用PCR结合高分辨熔解曲线分析技术(HRM)和毛细管电泳法(CE)检测正常核型的成人AML样本的NPM1基因突变,并与CE法进行比较分析,结果经克隆测序验证。结果 85例AML样本均得到可供分析的NPM1基因突变检测结果,NPM1基因突变阳性19例,其中15例A型突变,4例B型突变,突变阳性率为22.4%。与CE法比较,二者符合率为100.0%(85/85),HRM检测的敏感性和特异性均达到100.0%。结论应用HRM技术检测NPM1基因突变快速简便,而且敏感,是一项适合临床开展的新方法,可用于临床AML诊断分型、治疗和预后指导。

关键词：高分辨熔解曲线分析急性髓系白血病基因突变 NPM1

高分辨熔解曲线分析技术检测中国人常见β地中海贫血基因突变

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中国优生与遗传杂志 2011年第7期19卷 19-21,137页

作者：李茹廖灿李东至李坚广州市妇女儿童医疗中心妇婴院区优生围产研究所广州510623

目的应用高分辨熔解曲线分析技术检测中国人常见β地中海贫血基因突变。方法 PCR扩增HBB基因3个外显子、外显子-内含子交界区及第2内含子部分区域,采用LightScanner对PCR产物进行高分辨熔解曲线分析,通过DNA;;测序对HRM结果进行验证。... 详细信息

目的应用高分辨熔解曲线分析技术检测中国人常见β地中海贫血基因突变。方法 PCR扩增HBB基因3个外显子、外显子-内含子交界区及第2内含子部分区域,采用LightScanner对PCR产物进行高分辨熔解曲线分析,通过DNA;;测序对HRM结果进行验证。结果对48例正常对照的HRM分析显示,在HBB基因的突变筛查区域存在两个常见SNPs;在验证实验中,对37例已知基因型患者的HRM分析显示,所有突变均得到正确检测且每种基因型都有其独特的熔解曲线;在双盲实验中,对70例未知样本的HRM分析共检出28个异常熔解曲线,与测序结果完全一致,HRM检测的灵敏度和特异性均为100%。结论高分辨熔解曲线分析法检测HBB基因突变具有简单快速、高效敏感、成本低廉等优点,不仅可用于β地贫的突变筛查,还可对已知突变进行基因分型。

关键词：高分辨熔解曲线分析 β地中海贫血 HBB基因突变

高分辨熔解曲线分析技术及其在遗传学中的应用

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中国优生与遗传杂志 2012年第4期20卷 1-3页

作者：何超廖灿广州市妇女儿童医疗中心优生围产研究所 510623

高分辨熔解曲线分析(High Resolution Melting,HRM)技术是建立在熔解曲线分析的基础上,通过一种新的饱和荧光染料,以及专业的高分辨率仪器,应用于突变筛查、基因分型等的遗传学分析新方法。这种技术因其简单、准确、快速、高通量、低成... 详细信息

高分辨熔解曲线分析(High Resolution Melting,HRM)技术是建立在熔解曲线分析的基础上,通过一种新的饱和荧光染料,以及专业的高分辨率仪器,应用于突变筛查、基因分型等的遗传学分析新方法。这种技术因其简单、准确、快速、高通量、低成本,对样本无污染等优点而受到普遍关注。本文对HRM技术及其应用进行综述。

关键词：高分辨熔解曲线分析突变筛查基因分型甲基化分析

高分辨熔解曲线分析方法检测子宫肌瘤MED12基因突变

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中华生物医学工程杂志 2014年第5期20卷 385-388页

作者：叶军王华陈亚宝钱华姜俊袁冬兰王君江苏省泰州市人民医院临床医学研究所 225300 泰州高等职业技术学院

目的建立高分辨熔解曲线分析（HRMA）检测子宫平滑肌瘤MED12基因突变。方法针对MEDl2基因突变位点设计PCR扩增引物，对60例子宫肌瘤标本进行PCR扩增。用HRMA技术对PCR产物进行突变分析，并通过DNA测序技术对HRMA结果进行验证。结果60例... 详细信息

目的建立高分辨熔解曲线分析（HRMA）检测子宫平滑肌瘤MED12基因突变。方法针对MEDl2基因突变位点设计PCR扩增引物，对60例子宫肌瘤标本进行PCR扩增。用HRMA技术对PCR产物进行突变分析，并通过DNA测序技术对HRMA结果进行验证。结果60例子宫平滑肌瘤样本中，HRMA检出MED12基因突变率为53.3％（33／60），测序法检出突变率为51．7％（31／60），两者比较差异无统计学意义（r=0．0335，P=0．885）。两者符合率为96．7％（58／60）。结论本研究成功建立HRMA技术检测MED12基因突变，可用于临床子宫肌瘤标本的检测。

关键词： DNA突变分析基因表达调控肿瘤子宫肿瘤高分辨熔解曲线分析

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高分辨熔解曲线分析技术临床应用研究进展

临床医药实践 2020年第2期29卷 143-146页

作者：李宗波天津市津南医院

高分辨熔解曲线分析技术(HRM)是在2002年由Utah大学Wittwer实验室和Idaho公司合作研发,它的原理是在PCR基础上加入饱和荧光染料、监测扩增产物熔解曲线变化的新兴核酸分析技术[1]。高分辨熔解曲线分析技术已经应用到临床的各个领域,对... 详细信息

高分辨熔解曲线分析技术(HRM)是在2002年由Utah大学Wittwer实验室和Idaho公司合作研发,它的原理是在PCR基础上加入饱和荧光染料、监测扩增产物熔解曲线变化的新兴核酸分析技术[1]。高分辨熔解曲线分析技术已经应用到临床的各个领域,对遗传病、肿瘤的诊断和细菌的鉴定及药敏试验、药物的鉴定等发挥了重要作用。

关键词：高分辨熔解曲线分析核酸分析技术熔解曲线荧光染料药敏试验遗传病合作研发扩增产物

高分辨熔解曲线分析慢性骨髓增殖性疾病JAK2V617F基因突变

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中国热带医学 2011年第4期11卷 464-465页

作者：谢健晋周薇王汉平应逸杜庆华陈晓燕陈小卫广州市第一人民医院血液科广东广州510180

目的研究慢性骨髓增殖性疾病(CMPDs)获得性JAK2V617F突变检测方法。方法应用高分辨熔解曲线分析技术(HRM),对前期经等位基因特异性PCR法(AS-PCR)分析过的36例CMPDs样本进行JAK2V617F基因突变检测,并与AS-PCR检测情况进行比较分析,结果... 详细信息

目的研究慢性骨髓增殖性疾病(CMPDs)获得性JAK2V617F突变检测方法。方法应用高分辨熔解曲线分析技术(HRM),对前期经等位基因特异性PCR法(AS-PCR)分析过的36例CMPDs样本进行JAK2V617F基因突变检测,并与AS-PCR检测情况进行比较分析,结果经测序验证。结果 36例CMPDs样本均得到可供分析的JAK2V617F基因突变HRM检测结果,与AS-PCR法相比较,二者的符合率为97%(35/36);只有一份样本结果不相符,经测序验证,结果与HRM检测相一致;HRM检测的敏感性和特异性均达100%。结论应用HRM技术检测JAK2V617F突变快速简便、而且敏感,是一项适合临床开展的新方法,可用于临床辅助CMPDs的诊断。

关键词：高分辨熔解曲线分析 JAK2V617F 突变慢性骨髓增殖性疾病等位基因特异性PCR

利用高分辨熔解曲线分析技术快速检测鉴定四种临床常见侵袭性曲霉菌的方法学研究

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利用高分辨熔解曲线分析技术快速检测鉴定四种临床常见侵袭性曲霉...

作者：曹楠楠南方医科大学

学位级别：硕士

侵袭性真菌感染是免疫力低下病人不得不面临的严峻挑战。近些年,肿瘤,艾滋病,器官移植等免疫低下病人的侵袭性真菌感染率不断上升,且死亡率极高。临床上侵袭性真菌感染的常见病原多为念珠菌属,但隐球菌尤其是新生隐球菌,丝状真菌尤其是... 详细信息

侵袭性真菌感染是免疫力低下病人不得不面临的严峻挑战。近些年,肿瘤,艾滋病,器官移植等免疫低下病人的侵袭性真菌感染率不断上升,且死亡率极高。临床上侵袭性真菌感染的常见病原多为念珠菌属,但隐球菌尤其是新生隐球菌,丝状真菌尤其是曲霉菌属等条件致病性真菌感染的发生近年来也呈逐年上升趋势。对于这些感染的临床治疗而言,治疗效果很大程度上取决于病人的免疫力状况及能否及时给与准确有效的抗真菌药物。目前临床上常用的抗真菌药物主要有两性霉素B,酮康唑,氟康唑,泊沙康唑、卡泊芬净等。有文献报道,临床上分离到越来越多的对唑类抗真菌药物和两性霉素B耐药的曲霉菌株,因此有必要研究一种能够快速检测鉴定临床常见曲霉菌的方法,为临床进行更有效的侵袭性曲霉菌感染治疗提供参考。高分辨熔解曲线分析技术的基本原理是在PCR完成后,升高PCR体系温度,利用双链DNA饱和荧光染料,实时监测升温过程中双链DNA饱和荧光染料与体系中DNA双链的结合情况（仪器上反映为荧光信号的变化）,达到DNA双链序列分析的目的。双链DNA饱和荧光染料的结合原理与传统的荧光定量PCR染料不同。传统的荧光染料如Sybr Green等属于不饱和荧光染料,体系中此种荧光染料存在对PCR反应有抑制作用,因此在体系中加入的不饱和荧光染料浓度很低,远远低于产物DNA双链结构中染料结合位点的数目,DNA双链结构中存在大量的空余荧光染料结合位点。PCR过程完成产生大量的产物DNA双链,荧光染料分子结合在产物DNA双链上的染料结合位点。随着体系温度逐渐升高,体系中的DNA双链开始变性解链,荧光染料分子逐渐离开DNA双链结合位点,反映为荧光信号的逐渐降低。Sybr Green等不饱和荧光染料分子在离开DNA双链的过程中会发生分子结合位置的重排,因DNA解链而离开的不饱和荧光染料分子会迅速重新结合到尚未解链的其他双链部分上空余染料结合位点,荧光信号的变化失真,不能准确反映体系内DNA双链的解链情况。而饱和荧光染料如LC Green等对PCR反应基本无抑制作用,PCR体系中荧光染料的添加量远远高于体系中DNA双链上的染料结合位点数目,DNA双链上不会存在空余的染料结合位点,解链过程中能够最大程度上减少染料分子重排。体系温度升高,体系中DNA双链变性解链,饱和荧光染料分子与解链的DNA双链解离,因其他尚未解链的DNA双链上不存在空余结合位点,解离的染料分子不会重新结合到双链DNA上,荧光信号的变化能够真实反映体系中双链DNA的解链情况,使利用熔解曲线进行序列分析成为可能。不对称PCR扩增技术（asymmetric PCR）顾名思义,不对称PCR方法中两种引物的量相差悬殊,通常1：5-1：100不等,其中量相对较少的引物称为限制引物,相对过量的引物称为过剩引物。不对称PCR体系在反应的前几十个循环中同时存在正向引物和反向引物,可以生成一定数量的双链产物,经过15-30个循环左右,浓度相对较低的限制引物消耗完全。在PCR反应的后面几十个循环中,体系中仅存在过剩引物。过剩引物在体系中扩增产生大量的单链DNA。在高分辨熔解曲线的基本分析原理和不对称PCR扩增技术的基础上,引入非标记探针技术,是对高分辨熔解曲线技术的一种延伸和应用。非标记探针是长度在20-40bp左右的3’端封闭阻止延伸的一段寡核苷酸链。与传统的荧光探针相比,非标记探针寡核苷酸链只需要在探针的3’端进行封闭阻止其在PCR过程中发生自身扩增,而无需任何荧光基团修饰。在PCR反应完成后,进行一个变性,复性的基本过程,探针结合到单链产物上,形成局部双链结构。再进行升温变性,采集荧光信号,在相对较低的温度时,探针与产物结合形成的局部双链结构发生解链,反映为荧光信号降低,产生探针熔解峰。继续升温,PCR体系中产生的目的DNA产物发生熔解解链,荧光信号降低明显,产生产物熔解峰。通过分析探针峰和产物熔解峰的熔解温度（melting temperature, Tm）,使序列分析更加敏感,特异。在本研究中,我们将高分辨熔解曲线分析技术,非标记探针技术和不对称PCR技术引入四种临床常见曲霉菌的检测鉴定中,试图探索一种快速,准确,经济的曲霉菌病原检测鉴定方法。第一部分“高分辨熔解曲线分析通用真菌引物扩增片段检测鉴定四种常见曲霉菌” 研究方法查找GeneBank中公布的隐球菌属,念珠菌属,曲霉菌属,青霉属等多种临床常见真菌及人类的18SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA以及ITS1、2基因序列。通过Clustal X软件比对找出与人类无序列同源性的真菌保守区段。以真菌核糖体RNA基因中的内转录间隔区2（ITS2）为靶基因,在5.8S和28S核糖体RNA基因上设计真菌通用引物,在BLAST中比对其特异性。利用设计的真菌通用引物

关键词：高分辨熔解曲线分析非标记探针不对称PCR 烟曲霉黄曲霉土曲霉黑曲霉