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南方医科大学学报 2014年第5期34卷 669-673页

作者：欧阳晴晴赵进军杨敏南方医科大学南方医院风湿免疫科广东广州510515

目的探讨骨髓源性肥大细胞(BMMCs)对软骨细胞表达Ⅱ型胶原和糖胺多糖(GAG)的影响。方法原代培养小鼠BMMCs和关节软骨细胞,将第2代软骨细胞以及培养4周的BMMCs,按照1∶10的比例种植于Transwell共培养系统中。细胞分为4个组:软骨细胞组(... 详细信息

目的探讨骨髓源性肥大细胞(BMMCs)对软骨细胞表达Ⅱ型胶原和糖胺多糖(GAG)的影响。方法原代培养小鼠BMMCs和关节软骨细胞,将第2代软骨细胞以及培养4周的BMMCs,按照1∶10的比例种植于Transwell共培养系统中。细胞分为4个组:软骨细胞组(对照组)、软骨细胞+BMMCs组(BMMCs组)、软骨细胞+BMMCs+色甘酸二钠组(DSCG组)、软骨细胞+BMMCs+Compound48/80组(C48/80组),每组设3个复孔,收集软骨细胞并裂解,随后ELISA以及Western Blotting检测软骨细胞内的Ⅱ型胶原的表达,用1,9-二甲基亚甲蓝法(DBM)检测软骨细胞内GAG的含量。结果在培养24 h,BMMCs组和DSCG组Ⅱ型胶原以及GAG的含量与对照组间无差异(P>0.05),C48/80组Ⅱ型胶原与GAG含量相对于对照组和BMMCs组显著降低(P0.05)。结论 C48/80激活的BMMCs可降低软骨细胞Ⅱ型胶原以及GAG表达。

关键词：骨髓源性肥大细胞软骨细胞 Ⅱ型胶原 C48 80 糖胺多糖

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肿瘤坏死因子-α对骨髓源性肥大细胞表达MMP-3、MMP-9、IL-17的影响

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南方医科大学学报 2015年第11期35卷 1633-1637页

作者：陈玉姣欧阳晴晴王然毋静赵进军杨敏南方医科大学南方医院风湿免疫科广东广州510515

目的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对骨髓源性肥大细胞(BMMCs)分泌MMP-3、MMP-9、IL-17的影响。方法原代培养小鼠BMMCs,将培养8周的BMMCs种植于12孔板中。细胞分为4个组:BMMCs+PBS组(对照组)、BMMCs+2 ng/m L TNF-α组(2 ng/m L组)、BMMCs+10 ng/m L TNF-α组(10 ng/m L组)、BMMCs+50 ng/m L TNF-α组(50 ng/m L组),不同浓度TNF-α与BMMCs作用后,在12、24 h收集细胞,用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR),在m RNA水平检测MMP-3、MMP-9、IL-17的表达。结果培养12 h后,2 ng/m L组、10 ng/m L组、50 ng/m L组MMP-3、MMP-9、IL-17 m RNA的表达均高于对照组(P0.05),其余各组之间MMP-3、MMP-9、IL-17m RNA的表达显著升高(P性和时间依赖性。

关键词：骨髓源性肥大细胞肿瘤坏死因子-α MMP-3 MMP-9 IL-17

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负载布鲁菌WboA-S2株对骨髓源性肥大细胞的活化作用的体外研究

负载布鲁菌WboA-S2株对骨髓源性肥大细胞的活化作用的体外研究

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作者：王晓曼河北大学

学位级别：硕士

目的：探讨BMMC对布鲁菌的识别机制及应答效应以及Wbo A基因在诱导机体免疫应答中所发挥的作用,为研发以Wbo A-S2株为靶抗原的新型布鲁菌疫苗和布鲁菌病的防治提供实验依据和研究新思路。方法：1.采用IL-3和SCF体外诱导的方法制备BMMC;... 详细信息

目的：探讨BMMC对布鲁菌的识别机制及应答效应以及Wbo A基因在诱导机体免疫应答中所发挥的作用,为研发以Wbo A-S2株为靶抗原的新型布鲁菌疫苗和布鲁菌病的防治提供实验依据和研究新思路。方法：1.采用IL-3和SCF体外诱导的方法制备BMMC;根据BMMC培养状态及甲苯胺蓝染色对BMMC进行鉴定;2.分别用布鲁菌Wbo A-S2株和S2株按感染复数(MOI)100:1负载BMMC,并以正常BMMC为对照,负载15min,30min,45min,60min后分别进行甲苯胺蓝染色和瑞氏-吉姆萨染色,观察负载不同菌种后的不同时间点BMMC的形态学变化,以观察布鲁菌对BMMC的活化效应及Wbo A基因产物在活化肥大细胞中的作用;3.以FITC标记的布鲁菌WboA-S2株、S2株负载BMMC后激光共聚焦显微镜观察BMMC对布鲁菌Wbo A-S2株和S2株的摄取状态;4.分别用布鲁菌WboA-S2株和S2株按感染复数(MOI)100:1负载BMMC,并以正常BMMC为对照,负载3h,6h,12h,24h后用ELISA法检测上清中TNF-α,IFN-γ,组胺,IL-1,IL-6,IL-12的含量,以观察负载布鲁菌Wbo AS2株和S2株后BMMC释放生物活性介质的情况;5.RT-PCR法检测正常BMMC的TLR2、4、8与9 m RNA的表达;6.分别用布鲁菌Wbo A-S2株和S2株按感染复数(MOI)100:1负载BMMC,并以正常BMMC为对照,负载12h,24h后收集细胞,采用RT-PCR法观察BMMC载菌后不同时间点TLR2,TLR4,TLR8和TLR9 m RNA表达的变化;7.采用流式细胞术检测BMMC负载布鲁菌Wbo A-S2株和S2株后12h TLR4和TLR8蛋白的表达。结果：1.负载布鲁菌Wbo A-S2株和S2株后BMMC的形态学变化(1)甲苯胺蓝染色后光学显微镜下观察:正常BMMC内有很多颗粒;负载布鲁菌Wbo A-S2株和S2株后15min,两组BMMC即发生明显的脱颗粒;随着负载时间的延长,BMMC内的颗粒逐渐减少,至负载后60min,BMMC胞质内几乎无颗粒存在,且Wbo A-S2株负载组较S2株负载组脱颗粒更明显。(2)瑞氏-吉姆萨染色后光学显微镜下观察:负载布鲁菌Wbo A-S2株和S2株后15min,两组BMMC体积均开始增大;负载后30min,BMMC胞膜内陷,细胞质中开始出现空泡,但两组胞膜均完整;负载后45min,BMMC胞质中空泡明显增多增大,胞膜出现泡沫化;负载后60min,BMMC胞质中几乎全是空泡,Wbo A-S2株负载组的BMMC细胞膜较S2株负载组较完整。(3)激光共聚焦检测结果:BMMC负载布鲁菌Wbo A-S2株和S2株1h时,Wbo AS2株和S2株均位于BMMC胞膜上,说明布鲁菌并未被摄入到肥大细胞内,而是粘附在细胞膜表面。2.布鲁菌WboA-S2株和S2株对BMMC的激活作用(1)BMMC负载布鲁菌WboA-S2株和S2株后,两组在各个时间点上清中TNF-α的含量均明显高于正常对照组(P0.05),而Wbo A-S2株负载组显著高于同一时间点S2株负载组以及正常对照组(P<0.01),且随着负载时间的延长,IL-6的含量有增加趋势,至12h达高峰,24h时又开始下降。(3)BMMC负载布鲁菌Wbo A-S2株和S2株后,两组在各个时间点上清中组胺的含量均明显高于正常对照组(P<0.05),随着负载时间的延长,S2株负载组上清中组胺的含量呈增加趋势,而Wbo A-S2株负载组各个时间点之间无明显变化。而且,负载24h时,S2株负载组明显高于Wbo A-S2株负载组(P<0.05)。(4)在布鲁菌Wbo A-S2株负载组和S2株负载组各个时间点的上清中均未检测到IFN-γ,IL-1,IL-12。3.BMMC对布鲁菌Wbo A-S2株和S2株的识别机制(1)正常小鼠BMMC在m RNA水平表达TLR2,4和8,不表达TLR9。(2)负载布鲁菌WboA-S2株和S2株的BMMC在12h,24h TLR4都有明显变化,两组TLR4在负载12h时的表达均明显高于正常对照组,但Wbo A-S2株负载组的BMMC TLR4 m RNA的表达明显高于S2株负载组,24h时两组表达均明显减少。(3)S2株负载组在12h时TLR8 m RNA的表达有上升趋势,但与正常对照组相比无明显变化,而Wbo A-S2株负载组的

关键词：骨髓源性肥大细胞布鲁菌 WboA- S2株 S2 株细胞因子 TLR

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肥大细胞对眼眶成纤维细胞生长的影响

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中国临床解剖学杂志 2004年第3期22卷 294-296,300页

作者：鲁桂兰吴中耀李永平颜建华程浩郑健墚张文忻中山大学中山眼科中心广州510060

目的:探讨肥大细胞对眼眶成纤维细胞生长的影响。方法:将分离纯化的小鼠骨髓源性肥大细胞(BMMC)与眼眶成纤维细胞(OFb)共育,共育分为两组:两种细胞接触共育组和非接触共育组,眼眶成纤维细胞单独培养为对照组;应用光镜、电镜及细胞生长... 详细信息

目的:探讨肥大细胞对眼眶成纤维细胞生长的影响。方法:将分离纯化的小鼠骨髓源性肥大细胞(BMMC)与眼眶成纤维细胞(OFb)共育,共育分为两组:两种细胞接触共育组和非接触共育组,眼眶成纤维细胞单独培养为对照组;应用光镜、电镜及细胞生长计数等方法研究肥大细胞对眼眶成纤维细胞生长的影响。结果:与BMMC接触共育的OFb增殖活跃,呈复层生长,单位面积内细胞计数明显增加;接触共育组中OFb的增殖数分别与非接触共育组和对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05);电镜见接触共育组OFb中粗面内质网(RER)增生扩张,BMMC与OFb紧密接触,部分BMMC有脱颗粒现象。结论:肥大细胞对眼眶成纤维细胞的生存和增殖有显著的促进作用,并使其功能活跃,这种作用主要是通过两种细胞间的紧密接触而实现的。

关键词：骨髓源性肥大细胞眼眶成纤维细胞共育增殖

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肥大细胞在类风湿关节炎中的作用

肥大细胞在类风湿关节炎中的作用

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作者：欧阳晴晴南方医科大学

学位级别：硕士

第一部分骨髓源性肥大细胞对软骨细胞表达Ⅱ型胶原以及糖胺多糖(GAG)的影响研究背景类风湿关节炎(RA)是一种病因不明的慢性系统性自身免疫性疾病,关节软骨和骨的破坏是其主要的病理基础[1],世界范围内RA年发病率约为3/10000,总患病率... 详细信息

第一部分骨髓源性肥大细胞对软骨细胞表达Ⅱ型胶原以及糖胺多糖(GAG)的影响研究背景类风湿关节炎(RA)是一种病因不明的慢性系统性自身免疫性疾病,关节软骨和骨的破坏是其主要的病理基础[1],世界范围内RA年发病率约为3/10000,总患病率约为1%。近十年来,RA的治疗发展迅速,联合使用抗风湿药物及新的生物制剂使疗效明显改善,如英夫利昔单抗、依那西普、Abatacept、阿那白滞素、Tocilizumab等。其中抗TNF-α是治疗RA和脊柱关节病的一个重要进展,但循证医学研究发现仍有30-40%患者症状得不到明显改善或根本无效[2],其它如抗IL-1或IL-6单克隆抗体疗效则更差,说明除TNF-α、IL-1、IL-6等细胞因子外,还有其他机制参与RA的发病。肥大细胞及其相关细胞因子在RA发病机制中的作用是近年来的研究热点之一,肥大细胞约占正常关节滑膜细胞总数的3%,其功能可能是参与修复损伤或清除病原体。有研究表明,在正常关节中,活化的肥大细胞数仅占其总数1%-5%,但在RA患者的滑膜中,活化的肥大细胞数高达10%-15%。滑膜肥大细胞常聚集于血管翳和软骨交接及血管翳侵入骨皮质处[3],通过多种途径在RA中发挥致病作用,导致软骨和骨的损害。滑膜肥大细胞可与其它细胞相互作用,促使血管渗透性增加、激活滑膜细胞、促进血管增生、参与基质的重塑等继而导致软骨和骨的破坏,滑膜肥大细胞可能通过产生大量碱性成纤维细胞生长因子、白三烯C4和血小板源性生长因子等调节因子促使成纤维样细胞增殖[4],并可调节成纤维样细胞的促炎性活性,如促使成纤维细胞表达组织蛋白酶、基质金属蛋白酶等效应分子,导致软骨和骨的破坏。除此之外,滑膜肥大细胞还分泌多种细胞因子参与RA的发病,如TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-5和IL-6等。类风湿关节炎的一大病理特征就是关节软骨的破坏,其细胞学基础是软骨细胞外基质的降解。软骨细胞外基质的两大主要成份是Ⅱ型胶原与蛋白聚糖[5],占正常关节软骨干重的90%左右。蛋白聚糖含有很多成分,其中GAG是其主要成分之一,Ⅱ型胶原和其他胶原成分构成关节软骨的网状骨架,蛋白聚糖和透明质酸相互交联形成毛刷样结构,将软骨深埋在其中。关节软骨的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖使关节软骨具有很好的弹性和抗压性[6],Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的丢失和降解,导致关节软骨的弹性丧失,最终导致关节软骨的损害。因此,我们实验主要从肥大细胞对软骨细胞表达Ⅱ型胶原和GAG的影响入手来研究肥大细胞与关节软骨破坏之间的关系,从而为RA的治疗探寻一个新的靶点。研究方法一、实验分组原代培养小鼠骨髓源性的肥大细胞(BMMCs)和关节软骨细胞共培养,分为4个组：软骨细胞组(对照组)、软骨细胞+BMMCs组(BMMCs组)、软骨细胞+BMMCs+色甘酸二钠组(DSCG组)、软骨细胞+BMMCs+Compound48/80组(C48/80组),每组设3个复孔,两个时间点24h与48h。二、原代培养小鼠骨髓源性的肥大细胞 (1)将1只5周龄雌性C57BL/6小鼠处死,置于75%酒精中消毒3分钟。 (2)剪开小鼠后肢皮肤,取下后肢的股骨,置于含3ml15%胎牛血清RPMI-1640的中皿中,在体视镜下剔除股骨上的肌肉组织和结缔组织修,然后超净台上剪断股骨两端。 (3)用lml注射器将骨髓冲洗出来,直至骨髓腔变成白色,将细胞吹匀后加入RPMI-1640培养液进行培养,并加入重组小鼠IL-3和SCF各10μg/ml,培养3日后初次换液,随后可4-7日换液一次,培养4-6周后基本都为肥大细胞。三、原代培养小鼠关节软骨细胞 (1)将2只5周龄雌性C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死后,置于75%酒精中消毒3分钟。 (2)剪开小鼠后肢皮肤,将后肢整个分离,置于不含血清DMEM的平皿中。 (3)在体视镜下分离股骨头软骨帽、腓骨软骨带和胫骨软骨帽,修剪软骨附带的滑膜组织和结缔组织,剪成1mm3以下碎块,0.25%胰酶在37℃振荡(200次/分)消化30分钟,PBS清洗2次,加入0.3%的Ⅳ型胶原酶,在37℃孵箱中振荡消化(200次6/分)1小时,300g离心取上清。 (4)在超净台上加入培养液后进行培养,3日后初次换液,随后可5-7日换液一次。待培养细胞达80%以上时,胰酶消化细胞,按1：2-3传代。四、各组软骨细胞内II型胶原的表达对照组、BMMCs、DSCG组以及C48/80组每孔加入200μl裂解液,冰上裂解30min,将细胞裂解液转移到1.5ml EP管中,14000转离心取上清,即为各组软骨细胞内的总蛋白。一部分煮沸,Western Blotting检测各组软骨细胞的内II型胶原的表达,一部分直接用ELISA检测软骨细胞内II型胶原的表达。五、各组软骨细胞内糖胺多糖(GAG)的测定对照组、BMMCs组、DSCG组以及C48/80组每孔加入200μl裂解液,冰上裂解30min,将细

关键词：骨髓源性肥大细胞 Ⅱ型胶原糖胺多糖组织蛋白酶S CAIA模型

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