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上海交通大学学报（医学版） 2006年第2期26卷 207-209页

作者：孙超李定国上海交通大学医学院新华医院消化内科上海200092

肝干细胞用于肝病治疗的研究日益增多,尤其是骨髓分离骨髓源性肝干细胞。文章就骨髓源性肝干细胞的分离、培养、纯化、诱导分化、检测及肝内移植的可能机制和应用前景进行综述。

关键词：骨髓源性肝干细胞肝脏基因治疗肝病

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骨髓源性肝干细胞定向分化及脾内移植研究

中华实验外科杂志 2004年第5期21卷 551-553,i001页

作者：蔡云峰陈积圣闵军魏菁何劲松莫隽全中山大学孙逸仙纪念医院肝胆外科广州510120

目的　寻找骨髓源性肝干细胞的表面标记 ,进行定向分化及脾内移植研究。方法　流式细胞仪检测淤胆大鼠骨髓中干细胞群体的数量变化 ,寻找肝干细胞标记 ,免疫磁珠分离 ,进行体外诱导分化和肝再生模型的脾内移植 ,观察细胞形态的变化 ,免... 详细信息

目的　寻找骨髓源性肝干细胞的表面标记 ,进行定向分化及脾内移植研究。方法　流式细胞仪检测淤胆大鼠骨髓中干细胞群体的数量变化 ,寻找肝干细胞标记 ,免疫磁珠分离 ,进行体外诱导分化和肝再生模型的脾内移植 ,观察细胞形态的变化 ,免疫组织化学和免疫荧光技术检测白蛋白、AFP、CK8/18等肝细胞标记的表达。结果　淤胆鼠 β2微球蛋白阴性 (β2 m-)细胞数量较对照组数量明显增高 ,分别为 (6.17± 2 .70 ) %和 (0 .79± 0 .61) % (P 细胞体外培养及脾内移植均可出现肝细胞样细胞 ,白蛋白、AFP、CK8/18表达阳性。结论　β2m 细胞在体内外具有向肝细胞分化的能力 ,脾内移植是肝干细胞移植可供选择的部位之一。

关键词：骨髓源性肝干细胞定向分化脾内移植细胞形态免疫组织化学免疫荧光技术

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骨髓源性肝干细胞的研究

中国组织化学与细胞化学杂志 2002年第4期11卷 480-484页

作者：周播江钟翠平复旦大学上海医学院人体解剖学和组织胚胎学系上海200032

近年来全球掀起了有关干细胞的研究热潮，除血液干细胞、胚胎干细胞和神经干细胞外，肝干细胞也是引人注目的内容之一。肝干细胞的存在与否曾是一个争议性问题，目前已趋于肯定。自从Petersen et al有关骨髓细胞能分化为肝上皮细胞系的... 详细信息

近年来全球掀起了有关干细胞的研究热潮，除血液干细胞、胚胎干细胞和神经干细胞外，肝干细胞也是引人注目的内容之一。肝干细胞的存在与否曾是一个争议性问题，目前已趋于肯定。自从Petersen et al有关骨髓细胞能分化为肝上皮细胞系的论文发表后，关于血源性干细胞能转化为肝实质细胞的事实引起了广泛的关注。

关键词：骨髓源性肝干细胞血源性干细胞细胞分化研究进展

肝损伤大鼠骨髓源性肝干细胞的筛选分化与扩增

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上海交通大学学报（医学版） 2006年第3期26卷 255-258页

作者：孙超李定国陈源文汪保灿孙巧玲上海交通大学医学院新华医院消化内科上海200092

目的探讨利用肝损伤早期和淤胆血清培养体系从大鼠骨髓细胞中筛选、诱导分化和扩增肝干细胞亚群,以快速、高效地获取骨髓源性肝干细胞。方法建立淤胆型肝损伤大鼠模型和制备含5%淤胆血清病理条件培养液,以促进骨髓源性肝干细胞的体内、... 详细信息

目的探讨利用肝损伤早期和淤胆血清培养体系从大鼠骨髓细胞中筛选、诱导分化和扩增肝干细胞亚群,以快速、高效地获取骨髓源性肝干细胞。方法建立淤胆型肝损伤大鼠模型和制备含5%淤胆血清病理条件培养液,以促进骨髓源性肝干细胞的体内、外筛选和扩增,采用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测培养2周时骨髓细胞各种肝干细胞标志表达。结果病理条件培养液培养2周的骨髓细胞形成肝细胞样集落,细胞表达胚胎期肝干细胞特征性蛋白。结论淤胆型肝损伤早期大鼠体内环境和含淤胆血清体外病理微环境可能有效地从骨髓细胞中筛选骨髓源性肝干细胞,从而为临床细胞移植治疗各种肝脏疾病提供种子细胞。

关键词：骨髓源性肝干细胞细胞培养干细胞肝损伤

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骨髓源性肝干细胞的研究进展

世界华人消化杂志 2003年第7期11卷 1035-1036页

作者：杨明智彭志海上海市第一人民医院普外科上海市20080

近年来干细胞研究取得了很大进展,但是人类胚胎在研究中的应用一直备受争议,因此有关成人体内某些干细胞的受重视程度日益增加.骨髓中的某些干细胞可以演变成为与其组织发育或再生来源无关的细胞类型.卵圆细胞是一种存在于肝脏实质的专... 详细信息

近年来干细胞研究取得了很大进展,但是人类胚胎在研究中的应用一直备受争议,因此有关成人体内某些干细胞的受重视程度日益增加.骨髓中的某些干细胞可以演变成为与其组织发育或再生来源无关的细胞类型.卵圆细胞是一种存在于肝脏实质的专能干细胞,研究首先发现了人及动物肝内存在骨髓来源的卵圆细胞,之后体外骨髓干细胞向肝干细胞的成功诱导,使这种现象的存在得到了进一步证实.骨髓干细胞分化为肝干细胞的发现提示他可能参与了体内肝组织细胞的再生及损伤的修复与替代,并为难治性肝病的治疗提供了新的思路.但是,就目前研究状况而言,许多方面尚存在疑问,骨髓源性肝干细胞的临床应用价值如何还有待于进一步研究.

关键词：骨髓源性肝干细胞肝卵圆细胞骨髓干细胞人类胚胎

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骨髓源性肝干细胞和肝病

胃肠病学和肝病学杂志 2008年第1期17卷 4-7页

作者：迟宝荣吉林大学第一医院消化内科吉林长春130021

近年来,随着干细胞研究的热潮,肝干细胞也已成为消化领域中的一个热门课题.肝干细胞可界定为与肝脏胚胎发育和再生有关的各种具有干细胞特性的细胞总称,而并非指某一特定种类的细胞,可分化为具有肝细胞部分或全部表型及功能的细胞是肝... 详细信息

近年来,随着干细胞研究的热潮,肝干细胞也已成为消化领域中的一个热门课题.肝干细胞可界定为与肝脏胚胎发育和再生有关的各种具有干细胞特性的细胞总称,而并非指某一特定种类的细胞,可分化为具有肝细胞部分或全部表型及功能的细胞是肝干细胞的共同特点.

关键词：骨髓源性肝干细胞肝病

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骨髓源性肝干细胞的研究进展

世界华人消化杂志 2004年第10期12卷 2435-2437页

作者：钟晓琳李昌平四川省泸州医学院附属医院消化内科四川省泸州市646000

骨髓干细胞的横向分化/转分化是近年来研究的热点,骨髓源性肝干细胞是在一定条件下能向肝细胞横向分化/转分化的骨髓干细胞,他的发现为肝病治疗带来了新的希望.近年来对骨髓源性肝干细胞的分化机制、分化环境及条件、分离和培养的研究... 详细信息

骨髓干细胞的横向分化/转分化是近年来研究的热点,骨髓源性肝干细胞是在一定条件下能向肝细胞横向分化/转分化的骨髓干细胞,他的发现为肝病治疗带来了新的希望.近年来对骨髓源性肝干细胞的分化机制、分化环境及条件、分离和培养的研究进一步深入,使其在细胞移植、基因治疗等方面有广阔的前景.现就骨髓源性肝干细胞的研究进展及其在临床治疗中应用前景综述如下.

关键词：骨髓源性肝干细胞研究进展治疗细胞移植

H3K27me2在大鼠骨髓源性肝干细胞分化过程中的变化

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山东大学学报（医学版） 2014年第6期52卷 28-32页

作者：黎冠宏王薇李继业阿斯楞潘润华廖彩仙南方医科大学南方医院肝胆外科广东广州510515 内蒙古医科大学附属医院普外科内蒙古呼和浩特010050

目的研究大鼠骨髓源性肝干细胞(BMDLSC)向肝细胞诱导分化过程中H3K27二甲基化变化情况,初步探讨H3K27二甲基化与BMDLSC向肝细胞分化过程的关系。方法分离收集大鼠骨髓细胞,通过免疫磁珠分选获得BMDLSC,而后体外诱导其分化为肝细胞,RT-PC... 详细信息

目的研究大鼠骨髓源性肝干细胞(BMDLSC)向肝细胞诱导分化过程中H3K27二甲基化变化情况,初步探讨H3K27二甲基化与BMDLSC向肝细胞分化过程的关系。方法分离收集大鼠骨髓细胞,通过免疫磁珠分选获得BMDLSC,而后体外诱导其分化为肝细胞,RT-PCR动态检测其白蛋白(ALB)及甲胎蛋白(AFP)的mRNA表达水平,通过Western blotting及免疫荧光染色检测第0、7、14天核小体组蛋白H3K27二甲基化的水平。结果分离纯化的BMDLSC在体外诱导分化过程中ALB的表达水平逐渐升高,而AFP的表达水平则先升高后下降;新鲜分离的BMDLSC H3K27无明显甲基化,诱导分化后第7天H3K27二甲基化水平较前升高,第14天进一步升高。结论 BMDLSC经体外诱导后定向分化为肝细胞,在分化过程中H3K27二甲基化水平逐渐升高,H3K27二甲基化修饰变化可能参与BMDLSC细胞向肝细胞分化的调控。

关键词：骨髓源性肝干细胞肝细胞分化 H3K27me2

自体骨髓源性肝干细胞体外扩增后移植治疗肝炎后肝硬化的临床研究

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自体骨髓源性肝干细胞体外扩增后移植治疗肝炎后肝硬化的临床研究

作者：秦安成南方医科大学

学位级别：硕士

目前肝移植是治疗末期肝病的一种有效的治疗方法,但由于供体缺乏、免疫排斥和高额费用等一系列的问题,以至于肝移植的临床运用受到限制,难以满足众多的肝病患者治疗的需求。众多的肝病学家们也一直在探索一种可以补充的甚至于能够代替... 详细信息

目前肝移植是治疗末期肝病的一种有效的治疗方法,但由于供体缺乏、免疫排斥和高额费用等一系列的问题,以至于肝移植的临床运用受到限制,难以满足众多的肝病患者治疗的需求。众多的肝病学家们也一直在探索一种可以补充的甚至于能够代替肝移植来治疗肝脏疾病的方法。随着细胞学等相关学科的发展,使得应用肝干细胞来治疗肝脏疾病成为可能。肝干细胞可以分化为与其自身的基因一致的肝细胞及胆管细胞,作为肝干细胞的一种,骨髓源性肝干细胞(Bone marrow derived liver stem cells, BMDLSC)的发现,为肝脏疾病治疗提供了新的思路和手段。利用骨髓源性肝干细胞移植的方法来修复因疾病而损伤肝脏,这是一种全新的肝病治疗方法,该技术可以修补因等各种原因损伤而减少的肝细胞数量,可以重建因为肝损伤而遭到破坏的肝脏的组织结构。近年来,国内外已有众多专家在研究如何利用肝干细胞来治疗肝硬化等终末期肝病的课题。取得了一定的成果,但也存在许多尚待解决的问题。在现有的文献资料中,绝大多数学者所采用的技术路线是：直接将抽取的骨髓进行肝动脉或门静脉输注移植,或者将骨髓进行简单的离心分离后再经肝动脉或门静脉输注移植。这种直接利用骨髓源性肝干细胞进行移植的技术路线,虽然在方法上相对简单易行,但最终效果都不够理想,原因是BMDLSC在骨髓细胞中的含量非常稀少,即使移植较大量的骨髓,BMDLSC的移植数量也往往不足。我们采用的技术路线是骨髓源性肝干细胞经体外培养扩增后再行肝内移植。这种技术路线在我们的前期动物实验已经证实是安全有效的,可以增加可供移植细胞中BMDLSC的数量,可以减少BMDLSC移植的骨髓需要量,从而提高BMDLSC移植的肝病治疗效果。自2004年开始探索利用骨髓源性肝干细胞修复肝脏疾病损伤的研究,建立了骨髓源性肝干细胞在体外培养、扩增的有效技术,可以有效的增加骨髓源性肝干细胞的移植数量,使移植细胞的数量和移植细胞定居在肝脏并发挥治疗作用的数量都得到增加。本研究主要观察临床应用自体骨髓源性肝干细胞体外扩增后肝内移植治疗肝炎后肝硬化的安全性与有效性。目的探索临床自体骨髓源性肝干细胞在体外培养与扩增后肝内移植治疗肝炎后肝硬化的安全性及其效果。材料和方法1.病例选择：2008年1月至2009年4月入住南方医院肝胆外科治疗的肝炎后肝硬化患者中,符合入选条件的病人12例,其中女性3人、男性9人,平均年龄48.8岁(39-60岁)。病人按入院先后的半随机方法分为治疗组6例和对照组6例。所有的病人都有明确的乙肝病史,肝功能检查轻度至中度异常,Child-Pugh肝功能评分A-C级,组织病理学检查显示肝内广泛的纤维组织增生,肝小叶结构被破坏,假小叶及再生结节形成,符合临床肝炎后肝硬化的诊断标准。2.自体骨髓源性肝干细胞的采集、体外培养与扩增：治疗组患者在接受脾切除、门奇静脉断流术治疗前一周,在严格无菌操作条件下以髂后上棘为穿刺点行骨髓穿刺术抽取骨髓30-40mL,并用肝素盐水抗凝后,送专门的实验室进行骨髓源性肝干细胞的分离、体外培养、扩增;在无菌的细胞培养室中利用密度梯度离心法分离出富含CD117阳性细胞和CD184阳性细胞的骨髓单个核细胞群,然后将细胞在体外培养扩增7天,扩增方案采用含10%自体血清的高糖DMEM培养基体系中加促肝细胞生长素(HGPF)、促血小板生长素(TPO)和白细胞介素3(IL-3),此方案在严格无菌的层流细胞培养室中完成;将细胞制成细胞悬液,供临床移植使用,在前期的实验中用流式细胞计数法测定扩增细胞中CD117阳性细胞和CD184阳性细胞的数量变化。3.体外扩增的自体骨髓源性肝干细胞的肝内移植：在患者接受门奇静脉断流术中缝合关闭腹腔前,治疗组中,以1mL注射器针头穿刺肝固有动脉,经肝动脉缓慢注入经体外培养与扩增处理的自体骨髓源性肝干细胞悬液(体积10毫升,细胞平均浓度0.5×107／ml),对照组经肝动脉缓慢注入等体积的生理盐水。术前术后两组病人予以相同方案的预防感染、保护肝脏与对症支持等治疗。4.观察指标与方法4.1症状与体征：内容包括精神、食欲、体力、黄疽、腹水、下肢水肿、肝性脑病等。4.2、影像学检查：术前及术后3个月行肝脏CT及B超检查,依据CT所示肝脏体积和肝脏密度(CT值)来评定肝硬化的程度及其变化。4.3、实验室检查：术前及术后3个月分别检查(1)肝功能：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血清白蛋白、血清总胆红素;(2)凝血功能：凝血酶原时间;(3)肝纤维化指标：透明质酸(HA)、人Ⅲ型前胶原(HPCⅢ),此外我们还记录了患者在移植术后的2周及1个月的上述的实验

关键词：骨髓源性肝干细胞扩增移植肝炎后肝硬化

大鼠骨髓源性肝干细胞向肝细胞分化过程中H3K27me2的变化

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大鼠骨髓源性肝干细胞向肝细胞分化过程中H3K27me2的变化

作者：黎冠宏南方医科大学

学位级别：硕士

骨髓源性肝干细胞(bone marrow-derived liver stem cell, BMDLSC),指骨髓中拥有肝细胞分化潜能的间充质干细胞,属于非胚胎来源的成体干细胞。BMDLSC是肝细胞在肝外的重要来源,拥有自我更新及分化的多潜能性,可以在特定条件下定向分化... 详细信息

骨髓源性肝干细胞(bone marrow-derived liver stem cell, BMDLSC),指骨髓中拥有肝细胞分化潜能的间充质干细胞,属于非胚胎来源的成体干细胞。BMDLSC是肝细胞在肝外的重要来源,拥有自我更新及分化的多潜能性,可以在特定条件下定向分化为肝细胞。胚胎干细胞是全能细胞,也具有分化为肝细胞的能力。相比胚胎干细胞,BMDLSC拥有取材方便、分离较简单,易于体外培养、研究成本低、不存在胚胎伦理学问题等优点,因而备受关注。肝干细胞因自我更新及分化的潜能,在应用于肝细胞再生及肝组织工程方面被寄予厚望,成为了全世界研究的热点之一。目前大鼠骨髓干细胞体外诱导分化为肝细胞的研究并不少见,但其具体分化调控机制仍不明确。研究表明,表观遗传学在调控干细胞的自我更新及分化中起重要作用,与分化、组织再生、衰老、DNA的损伤与修复、肿瘤发生均起着不可忽视的作用。表观遗传学包括DNA甲基化、组蛋白修饰及染色体重塑等内容,其中组蛋白修饰则包括组蛋白甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化、ADP核糖基化,这些修饰以及其组合在时间和空间上和生物功能之间的关系,可以作为一种重要的表观遗传标记或语言,因此被称为“组蛋白密码”。其中组蛋白H3修饰变化对细胞的分化、发育的调节尤为突出。在胚胎干细胞的研究中发现,分化过程会诱导产生组蛋白修饰酶,这些酶在动态调节过程中起到了明显抑制作用。通过H3K27去甲基化酶的作用,可以减少靶基因启动子区的H3K27me2甲基化水平,从而解除对基因的抑制,增强基因的表达。有人在对人胚胎干细胞分化的研究中发现,H3K27甲基化及H3K4甲基化能够共同影响转录因子,在人胚胎干细胞早期分化过程中其甲基化修饰变化会通过抑制或激活基因的表达,从而影响分化的进行。还有其它相关研究也证实了H3K27的甲基化与转录起始位点联系紧密。Ferrari等人报道H3K27me2存在于大约70%的总组蛋白H3和染色质分布区域,并通过抑制作用防止细胞的非特异性表达的增强。Pasini等人通过去除PcG蛋白能够显著减少胚胎干细胞中H3K27me2的表达,并最终引起许多发育调节基因的上调。目前骨髓干细胞的组蛋白修饰变化研究较少,BMDLSC体外诱导分化为肝细胞的过程中,组蛋白H3K27me2是否也存在着变化,是否也起着调节作用,目前尚未见报道。本研究将利用免疫磁珠分选法从大鼠骨髓干细胞中分离纯化大鼠BMDLSC,而后通过成熟的诱导方案,在体外诱导BMDLSC定向分化为肝细胞,分别检测不同诱导时间的细胞ALB、AFP的mRNA水平,并以Western blot动态观察分化过程中不同时间点的H3K27me2的表达水平,以验证体外诱导分化肝细胞可行性,并阐明BMDLSC在体外诱导分化为肝细胞的过程中组蛋白H3K27me2的变化,为进一步了解BMDLSC分化过程中组蛋白修饰的调控机制提供理论依据。 1.材料和方法 1.1实验动物雄性Vista大鼠,30只,周龄5-6周,体重90-100g,购于南方医科大学实验动物中心,清结级,生长于SPF级条件下。 1.2主要试剂 One-Step RT-PCR半定量检测试剂盒(大连TaKaRa), Thy-1标记小鼠抗大鼠抗体(美国biolegend), lineage cell depletion kit(德国Miltenyi Biotec),肝细胞生长因子(美国PeproTech EC),10%胎牛血清、DMEM培养基(干粉)(美国Invitrogen),FITC标记山羊抗兔抗体(北京博奥森生物技术有限公司),Ant i-Hi stone H3(dimethyl K27,英国Abcam) 1.3实验方法 1.3.1大鼠骨髓单核细胞的分离与提取乙醚麻醉后颈椎脱臼法处死大鼠,无菌取胫骨和股骨,剪开两端骨骺,培养液DMEM/MCDB201反复冲洗骨髓腔,冲出骨髓细胞,红细胞裂解液裂解红细胞,过30u m滤网成单细胞悬液。配制密度为1.077kg/L的Percoll液,室温下以2200r/min离心30min;吸取Percoll分离液表面的白膜层,以DMEM培养液洗涤2次,诱导液重悬。台盼蓝染色计算细胞活力,细胞活力>95%才被使用。收集中间的白膜层细胞即大鼠骨髓单个核细胞。 1.3.2骨髓干细胞的免疫磁珠分选及流式细胞术检测先用lineage cell depletion kit作阴性分选,获得Lin(-)细胞。取上一步骤所得的单个核细胞在室温下1500r/min离心10mmin,弃去上清液,用PBS进行细胞重悬,按lineage cell depletion kit说明书以10μl/07加入生物素抗体,单克隆抗原簇***45R(B220).***-1(Ly-6G/C).***119,充

关键词：骨髓源性肝干细胞肝细胞分化 H3K27me2