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氧化铈仿生骨膜调控免疫-神经血管微环境促骨缺损修复的研究

氧化铈仿生骨膜调控免疫-神经血管微环境促骨缺损修复的研究

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作者：万千千中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

近年来创伤、炎症、肿瘤等原因导致骨缺损发生率一直居高不下,如何优化骨缺损修复治疗方案是亟待解决的难题。其中,改善缺损局部微环境,协调免疫活动、神经血管长入等局部反应和组织再生过程对于进一步促进骨缺损修复具有重要意义。骨... 详细信息

近年来创伤、炎症、肿瘤等原因导致骨缺损发生率一直居高不下,如何优化骨缺损修复治疗方案是亟待解决的难题。其中,改善缺损局部微环境,协调免疫活动、神经血管长入等局部反应和组织再生过程对于进一步促进骨缺损修复具有重要意义。骨膜在骨日常代谢以及骨缺损修复过程中发挥关键的调控作用:(1)骨膜内丰富分布的神经血管为骨组织提供神经血管支配来源;(2)骨膜含有丰富的局部免疫细胞和干细胞储备,在条件刺激下积极响应调节骨代谢和骨再生;(3)骨膜具有对细胞的选择性屏障能力,可为骨缺损修复维持良好的修复空间。针对天然骨膜的结构和功能,构建仿生膜材料,覆盖于缺损表面以调节骨缺损修复微环境,配合具备骨诱导性和骨传导性的骨缺损填充材料,有望进一步促进骨缺损修复。目前已有研究设计出针对促进血管化或调节巨噬细胞极化的仿骨膜类材料。然而,现有材料对神经生长及局部复杂免疫微环境的调控能力不足,改善骨缺损修复效果有限。氧化铈具有调控微环境的运用潜力,相关研究报道氧化铈纳米颗粒能够促进骨组织再生与血管再生,也有研究报道其具有免疫调节与神经保护作用。利用氧化铈构建仿生骨膜调控骨缺损修复局部微环境,可能是进一步改善骨缺损修复治疗效果的潜在方案。然而传统氧化铈纳米颗粒在体内降解代谢问题上存在争议,且构建材料需要依靠复杂的纳米颗粒制备技术,这大大掣肘其相关生物材料的发展。仿生矿化是在体外利用生物矿化的原理,以有机支架为模板诱导无机元素在其内有序沉积,形成具有精美有序结构的有机-无机复合材料。氧化铈作为无机成分,具备作为矿化基材的潜力,有望在天然膜材料鸡蛋膜内形成氧化铈仿生矿化。这种仿生矿化方案在简化材料制备方式的同时,能够制备出独特状态的氧化铈矿化成分,作为负载于鸡蛋膜有机支架上的生物活性成分,发挥调节骨缺损修复微环境的作用。本研究借鉴仿生矿化领域前沿研究成果,首次提出了利用聚丙烯酸(High molecular weight polyacrylic acid,HPAA)预处理有机支架材料,诱导乙酰丙酮铈缓慢水解形成无定形氧化铈,实现鸡蛋膜纤维内部仿生矿化的方案。氧化铈仿生骨膜是以无定形氧化铈(III价,IV价组成)无机矿物在鸡蛋膜有机支架(胶原成分和糖胺聚糖成分)内部有序沉积为特征的氧化铈仿生矿化鸡蛋膜材料,具有良好的生物安全性。利用于小鼠颅骨缺损模型,将仿生骨膜与骨缺损填充材料Bio-Oss配合使用,探索仿生骨膜调节缺损局部免疫反应、神经血管长入以及改善骨再生和骨膜再生的效果。随后,通过氯膦酸盐脂质体注射构建小鼠体内单核巨噬细胞清除模型,研究单核巨噬细胞在骨缺损修复过程中的作用。并结合体外细胞实验和共培养技术探索氧化铈仿生骨膜对巨噬细胞早期破骨分化和分泌功能的影响及作用机制,初步探讨巨噬细胞分化形成的破骨前体细胞在组织再生过程中的调节作用。本实验构建的仿生骨膜有望作为骨缺损修复治疗方案的辅助手段改善骨缺损修复效果,同时破骨前体细胞促组织再生作用机制有望为新型骨缺损修复材料的设计提供新思路和新作用靶点。1.研究方法在第一部分实验中,通过以鸡蛋膜为矿化模板、氧化铈为矿化基材、胶原酶和聚丙烯酸为支架预处理剂的氧化铈仿生矿化方案,以由下而上的方式实现氧化铈在鸡蛋膜纤维胶原及糖胺聚糖内的均匀有序沉积,构建氧化铈仿生矿化的鸡蛋膜材料。随后,我们对材料性能进行系列评价:采用透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)、扫描电子显微镜(Scanning electron microscopy,SEM)、扫描透射电子显微镜能谱分析技术(Scanning transmission electron microscopy-energy dispersed X-ray analysis,STEM-EDX)观察氧化铈仿生矿化后鸡蛋膜显微结构特点和矿化分布特征;运用衰减全反射-傅里叶变换红外光谱仪(Attenuated total reflection–fourier transform infrared spectroscopy,ATR-FTIR)、Raman光谱、X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)、热重分析(Thermogravimetric analysis,TGA)判断矿化前后鸡蛋膜支架内的矿物成分及矿化程度,并初步分析矿化原理;结合X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)分析矿化材料内铈元素的价态分布;原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)评价分析鸡蛋膜矿化前后弹性性能变化;采用人来源口腔黏膜成纤维细胞(Human oral mucosa fibroblast cells,h OMFs)模拟结缔组织细胞对膜的穿透过程,结合鬼笔环肽染色评价材

关键词：仿生矿化仿生骨膜氧化铈骨缺损修复微环境破骨前体细胞免疫-神经血管耦联

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