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骨形态蛋白2 siRNA靶向抑制对体外培养人脐动脉平滑肌细胞成骨样分化及钙化的影响

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上海交通大学学报（医学版） 2010年第11期30卷 1329-1333,1347页

作者：孙明姝郭永平顾乐怡严玉澄倪兆慧钱家麒上海交通大学医学院附属仁济医院肾内科上海200001 青岛大学医学院附属医院风湿免疫科青岛266003

目的研究骨形态蛋白2(BMP2)小分子干扰RNA(siRNA)靶向抑制对人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)由白介素6(IL-6)诱导刺激的成骨样分化和细胞层钙化的影响。方法以体外培养的原代HUASMC作为实验对象。建立RNA干扰(RNAi)实验平台,通过FAM标记阴... 详细信息

目的研究骨形态蛋白2(BMP2)小分子干扰RNA(siRNA)靶向抑制对人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)由白介素6(IL-6)诱导刺激的成骨样分化和细胞层钙化的影响。方法以体外培养的原代HUASMC作为实验对象。建立RNA干扰(RNAi)实验平台,通过FAM标记阴性对照siRNA优化转染条件;将BMP2基因的4条候选siRNA分别转染原代HUASMC,Real-TimePCR检测BMP2mRNA表达,筛选有效抑制siRNA。将复苏的原代HUASMC分为siRNA转染组(转染有效抑制siRNA)和模拟转染组(对照组,不转染siRNA),两组均加入重组人IL-6(rhIL-6)(10ng/mL)刺激孵育,Real-TimePCR检测刺激孵育12、48h时点成骨样转化相关基因BMP2、骨特异性碱性磷酸酶(BAP)、骨钙素(OC)和骨桥蛋白(OPN)mRNA表达。将复苏的原代HUASMC分为siRNA转染组、对照组和空白组(不予rhIL-6刺激孵育,其余处理与对照组相同),siRNA转染组和对照组均加入rhIL-6(50ng/mL)刺激孵育,甲氧-酚酞络合酮法检测rhIL-6刺激孵育前及孵育后2、4d时点各组HUASMC细胞层钙盐含量,以总蛋白含量校正。结果成功建立合适的RNAi实验平台。10ng/mLrhIL-6刺激孵育后12h时点,siRNA转染组HUASMC BMP2和BAPmRNA表达明显低于对照组(P0.05);在siRNA转染组,50ng/mLrhIL-6刺激孵育后2、4d时点的细胞层钙盐含量均明显低于对照组(P2d时点的细胞层钙盐含量明显高于空白组(P2基因的siRNA靶向抑制,能显著抑制由IL-6诱导刺激的成骨样分化和钙化。

关键词：骨形态蛋白2 RNA干扰成骨细胞分化钙化人脐动脉平滑肌细胞

骨形态蛋白2联合丹酚酸B诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究

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骨形态蛋白2联合丹酚酸B诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分...

作者：高辰玮河北北方学院

学位级别：硕士

心血管疾病一直是全球发病率、死亡率居先的疾病,由于人们生活水平的提高,冠状动脉心脏病(coronary heart disease, CHD)的发病率和死亡率不断上升。急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是目前重要的死亡原因之一。丧失的... 详细信息

心血管疾病一直是全球发病率、死亡率居先的疾病,由于人们生活水平的提高,冠状动脉心脏病(coronary heart disease, CHD)的发病率和死亡率不断上升。急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是目前重要的死亡原因之一。丧失的心肌细胞由瘢痕组织取代,而不是通过再生得到补充,造成心脏收缩功能下降,最终导致慢性充血性心力衰竭(chronic congestive heart failure, CCHF)。理想的治疗措施应该是不仅形态学方面达到修复,而且功能方面也能修复。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)因其易于获得、增殖能力强大、可在体外大量扩增、具有多向分化潜能的优点成为目前研究较多的组织工程供体细胞。鉴于注入种子细胞的状态是治疗成功的关键,因此诱导剂的选择至关重要。常用诱导药物主要包括化学药物、各种细胞因子和中药有效成分,物理干预如电刺激、磁场预干预及机械力作用也被提及,生物因素如模拟心肌微环境、组织裂解液共培养及相关基因的导入均开始出现。其中不乏使用两种处理方法联合作用于培养过程者。鉴于此,本实验选用骨形态蛋白2(bone morphogenetic protein2, BMP-2)和丹酚酸B(Salvianolic acid B, Sal-B)作为诱导剂,体外诱导BMSCs向心肌样细胞分化,观察分化过程中细胞形态的变化和特异基因的表达,同时比较联合应用诱导剂是否较单独应用一种诱导剂更有利于细胞的分化。以此寻找一种更佳的诱导方法,提高细胞分化率,为临床应用BMSCs恢复心肌功能提供实验基础。实验首先分离大鼠BMSCs进行体外培养并鉴定,熟悉其生长规律、培养条件和表型特性。利用骨髓贴壁分离法自3周龄SD大鼠的四肢长骨骨髓中分离培养BMSCs。镜下可见：原代细胞培养12h已部分贴壁,24h后形态开始变化,部分细胞形态伸展、体积增大,贴附于瓶壁。72h可见部分细胞伸出突起,突起圆钝而光滑,细胞呈梭形、菱形或多边形,核大而饱满,外观似成纤维细胞样。传代后不贴壁生长的小圆形造血干细胞逐渐弃去,视野中多见多角形及梭形细胞,细胞形态逐渐趋于一致,排列整齐,生长速度加快,传代时间缩短。免疫细胞化学法鉴定细胞表面标志,显示分离得到的BMSCs细胞纤维连接受体CD29为阳性,造血干细胞标志CD34为阴性,说明其表达基质细胞抗原,不表达泛白细胞抗原,符合间充质干细胞的特点。描记生长曲线发现BMSCs在接种初24h基本未增殖;第2d至3d生长缓慢;第4d生长速度开始加快,进入对数生长期;第7d细胞增值速度开始减慢;进入平台期。在各代细胞中生长规律相近,经过冻存的细胞生长规律基本不发生变化,活力不受影响,传代时间基本相近。此后以生长良好、形态均一的第2代大鼠BMSCs为实验对象,培养48h后分为4组,第1、2、3组分别加入含BMP-2、 Sal-B、BMP-2+Sal-B的诱导培养基,第4组作为空白对照组。诱导分化3d后换用普通生长培养基常规培养28d。从形态学和分子水平对诱导后的细胞进行检测。镜下可见：诱导培养48h后,各组细胞贴壁、伸展,周围伸出长短不一、粗细不等的突起,细胞呈现多角形、梭形等多种形态;7d细胞形态逐渐成为较均一的长梭形,排列方向也渐趋一致;28d相互连接,排列亦呈现明显的方向性,部分排列成旋涡状。制备标本用于检测。苏木精-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色观察细胞形态,过氧化物酶-链霉卵白素(streptavidin/peroxidase, SP)法进行免疫细胞化学染色检测结蛋白(desmin)、α肌节肌动蛋白(α-sarcomeric actin)、心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T, cTnT)、心肌肌钙蛋白Ⅰ (cardiac troponin Ⅰ, cTnI)和P38有丝分裂原蛋白激酶(P38mitogen-activated protein kinases, P38-MAPK)抗体。结果显示,3组BMSCs诱导后均阳性表达α-sarcomeric actin、cTnI、cTnT、desmin、P38-MAPK抗体,空白对照组阴性表达以上抗体。免疫荧光染色观察细胞中α-sarcomeric actin和cTnT两种抗体共表达的情况。分化后的细胞单个或成群分布,细胞多呈梭形或有分支,核圆形,有1-2个核,多位于细胞中央。部分细胞只表达α-sarcomericactin,部分细胞只表达cTnT,大部分细胞同时表达两种抗体。透射电子显微镜(transmission electronic microscopy, TEM)观察结果显示胞核位于细胞中央,呈卵圆形,细胞器丰富而发达,含有大量的粗面内质网和线粒体,也有糖原和核糖体。胞质内可见平行

关键词：骨髓间充质干细胞心肌细胞细胞分化骨形态蛋白2 丹酚酸B

骨形态蛋白2促进大段骨缺损的修复的实验研究

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骨形态蛋白2促进大段骨缺损的修复的实验研究

骨形态蛋白2在糖尿病肾病大鼠肾内小动脉中表达的意义

第六届西部骨科论坛暨贵州省骨科年会

作者：简月奎贵州省人民医院

背景单纯骨形态发生蛋白2修复骨缺损只有骨诱导性,单纯异种脱蛋白骨只有骨传导性。目的:评估骨形态发生蛋白2复合异种脱蛋白骨修复山羊大段长骨缺损的效果。设计、时间及地点:随机分组设计、动物对照观察实验,于2005—03/2007—02在解... 详细信息

背景单纯骨形态发生蛋白2修复骨缺损只有骨诱导性,单纯异种脱蛋白骨只有骨传导性。目的:评估骨形态发生蛋白2复合异种脱蛋白骨修复山羊大段长骨缺损的效果。设计、时间及地点:随机分组设计、动物对照观察实验,于2005—03/2007—02在解放军第三军医大学创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。材料山羊24只用于制备大段长骨缺损模型。市售猪股骨用于制备脱蛋白骨。重组骨形态发生蛋白2为美国Biosource公司产品。方法:山羊右侧胫骨中下段截除胫骨总长度20%制备节段性骨缺损模型。24只山羊按植入材料的不同分为3组,单纯异种脱蛋白骨组、自体骨组和异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组,每组8只。主要观察指标植入后4,8,12,16,20,24周X射线评估骨缺损情况。植入后24周取新生骨组织进行双能X射线、组织学、生物力学检测修复效果。结果:植入后12,24周自体骨组和异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组X射线评分均高于单纯异种脱蛋白骨组,差异有显著性意义(P骨组和异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组骨密度和骨矿含量均高于单纯异种脱蛋白骨组,差异有显著性意义(P骨组和异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组之间比较差异均无显著性意义(P>0.05)。植入后24周生物力学测试表明,自体骨组>异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组>单纯异种脱蛋白骨组。植入后24周,自体骨组、异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组,新生骨与最初两断端连成一体,新生骨骨小梁排列整齐有序。单纯异种脱蛋白骨组,新生骨与最初两断端部分相连。结论:重组骨形态发生蛋白2复合异种脱蛋白骨修复山羊胫骨大段缺损成骨能力与自体骨相当。

关键词：骨形态蛋白2 骨缺损组织工程

来源： cnki会议评论

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贵州医药 2010年第8期34卷 675-678页

作者：赵安菊黄颂敏欧三桃焦桂萍王里贵州省人民医院干医科贵阳550002 四川大学华西医院肾内科 610041

目的观察骨形态蛋白2（BMP-2）在糖尿病肾病（DN）大鼠肾实质内小动脉上的表达及其变化规律,探讨其对糖尿病肾病血管病变的影响。方法设对照组（N组）、DN组两组,建立STZ诱导的DN大鼠模型。茜素红染色观察肾实质内小动脉周围钙盐沉积,... 详细信息

目的观察骨形态蛋白2（BMP-2）在糖尿病肾病（DN）大鼠肾实质内小动脉上的表达及其变化规律,探讨其对糖尿病肾病血管病变的影响。方法设对照组（N组）、DN组两组,建立STZ诱导的DN大鼠模型。茜素红染色观察肾实质内小动脉周围钙盐沉积,并分别采用免疫组化及mRNA原位杂交法检测BMP-2在肾实质内小动脉上的蛋白表达及基因定位。结果（1）茜素红染色DN组第4~12周时偶见肾内小动脉少许点状红色钙盐沉积,第24周时可见肾实质内小动脉及周围组织有较多红色点片状沉积;N组茜素红染色为阴性。（2）DN组肾实质内小动脉BMP-2蛋白及mRNA在4周时已有表达,随时间延长表达逐渐增强,各时间点均明显高于N组;N组各时间点表达差异无统计学意义。结论（1）DN大鼠肾内小动脉钙化前即已有BMP-2的表达;（2）BMP-2可能是糖尿病血管钙化的重要转录因子及早期生物学标志之一;（3）肾内小动脉上BMP-2的表达变化可能参与DN进展。

关键词：糖尿病肾病血管钙化骨形态蛋白2

人骨形态蛋白-2对椎间盘细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的影响

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中国组织化学与细胞化学杂志 2007年第3期16卷 283-287页

作者：顾海伦段景柱王欢中国医科大学附属盛京医院骨二科沈阳110001

目的研究人骨形态蛋白(human bone morphogenetic protein-2,hBMP-2)对体外培养人腰椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原和aggrecan的影响。方法人退变髓核细胞体外分离培养,通过免疫组织化学鉴定椎间盘细胞。利用ELISA法检测对照组和不同剂量hBMP-2... 详细信息

目的研究人骨形态蛋白(human bone morphogenetic protein-2,hBMP-2)对体外培养人腰椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原和aggrecan的影响。方法人退变髓核细胞体外分离培养,通过免疫组织化学鉴定椎间盘细胞。利用ELISA法检测对照组和不同剂量hBMP-2(10ng/ml和100ng/ml)组Ⅱ型胶原和aggrecan的表达水平。用RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原和aggrecan的mRNA表达水平。结果加入hBMP-2后Ⅱ型胶原和aggrecan表达增加,并存在剂量依赖关系(P<0.01)。在第6天RT-PCR结果显示hBMP-2组aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA的表达高于对照组,并且随剂量增高aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA的表达量逐渐增加。结论hBMP-2可促进体外培养人腰椎间盘细胞合成代谢,Ⅱ型胶原和aggrecan表达量增加,并存在剂量依赖关系,提示hBMP-2可能对退变椎间盘具有修复功能。

关键词：骨形态蛋白2 椎间盘细胞基因表达胶原蛋白多糖

骨形态发生蛋白2复合异种脱蛋白骨支架材料修复山羊大段骨缺损

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中国组织工程研究与临床康复 2008年第36期12卷 7017-7021页

作者：唐敏田晓滨简月奎贵州省人民医院药剂科贵州省贵阳市550002 贵州省人民医院骨科贵州省贵阳市550002

背景:单纯骨形态发生蛋白2修复骨缺损只有骨诱导性,单纯异种脱蛋白骨只有骨传导性。目的:评估异种脱蛋白骨复合骨形态发生蛋白2修复山羊大段长骨缺损的效果。设计、时间及地点:随机分组设计、动物对照观察实验,于2005-03/2007-02在解放... 详细信息

背景:单纯骨形态发生蛋白2修复骨缺损只有骨诱导性,单纯异种脱蛋白骨只有骨传导性。目的:评估异种脱蛋白骨复合骨形态发生蛋白2修复山羊大段长骨缺损的效果。设计、时间及地点:随机分组设计、动物对照观察实验,于2005-03/2007-02在解放军第三军医大学创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。材料:山羊24只用于制备大段长骨缺损模型。市售猪股骨用于制备脱蛋白骨。重组骨形态发生蛋白2为美国Biosource公司产品。方法:山羊右侧胫骨中下段截除胫骨总长度20%制备节段性骨缺损模型。24只山羊按植入材料的不同分为3组,单纯异种脱蛋白骨组、自体骨组和异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组,每组8只。主要观察指标:植入后4,8,12,16,20,24周X射线评估骨缺损情况。植入后24周取新生骨组织进行双能X射线、组织学、生物力学检测修复效果。结果:植入后12,24周自体骨组和异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组X射线评分均高于单纯异种脱蛋白骨组,差异有显著性意义(P骨组和异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组骨密度和骨矿含量均高于单纯异种脱蛋白骨组,差异有显著性意义(P骨组和异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组之间比较差异均无显著性意义(P>0.05)。植入后24周生物力学测试表明,自体骨组>异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组>单纯异种脱蛋白骨组。植入后24周,自体骨组、异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组,新生骨与最初两断端连成一体,新生骨骨小梁排列整齐有序。单纯异种脱蛋白骨组,新生骨与最初两断端部分相连。结论:重组骨形态发生蛋白2复合异种脱蛋白骨修复山羊胫骨大段缺损成骨能力与自体骨相当。

关键词：骨形态蛋白2 骨缺损组织工程

ERK/Smad通路在BMP2介导的牙髓干细胞增殖、分化中的作用

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中国老年学杂志 2023年第3期43卷 688-693页

作者：沈玉芹崔娟娟鲁晓娟皖西卫生职业学院附属医院口腔科安徽六安237000 安徽医科大学第一附属医院口腔科

目的探讨细胞外调节蛋白激酶(ERK)/SMAD家族(Smad)通路在骨形态蛋白(BMP)-2诱导的人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖、分化中的调节作用。方法将前磨牙hDPSCs分为空白组、荧光蛋白(GFP)组、BMP2组(80 ng/ml)、BMP2+ERK通路抑制剂(U0126)组(80 ng... 详细信息

目的探讨细胞外调节蛋白激酶(ERK)/SMAD家族(Smad)通路在骨形态蛋白(BMP)-2诱导的人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖、分化中的调节作用。方法将前磨牙hDPSCs分为空白组、荧光蛋白(GFP)组、BMP2组(80 ng/ml)、BMP2+ERK通路抑制剂(U0126)组(80 ng/ml+25μmol/L);空白组正常培养不做任何处理,GFP组转染重组腺病毒空载体溶液作为对照,BMP2组转染BMP2重组腺病毒溶液,BMP2+U0126组在BMP2组基础上加入U0126溶液进行干预培养。各组均培养7 d后,用CCK-8检测hDPSCs细胞的增殖能力;用碱性磷酸酶(ALP)染色法及茜素红染色法检测其分化能力;用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测BMP2、Runt转录因子蛋白(Runx)2、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和骨唾液蛋白(BSP)基因表达;用蛋白Western印迹法检测各组细胞中ERK1/2及其磷酸化(p)-ERK1/2、Smad1/5/8及其磷酸化蛋白(p-Smad1/5/8)、Runx2、DSPP、BSP蛋白表达水平。结果hDPSCs分离培养的第3代hDPSCs呈长梭形且阳性表达CD29、CD44及波形蛋白,阴性表达CD34及角蛋白。与空白组比较,BMP2组细胞ALP染色区域所占百分比、矿化结节能力和BMP2、Runx2、DSPP、BSP mRNA表达水平及p-ERK1/2/ERK1/2、p-Smad1/5/8/Smad1/5/8、Runx2、DSPP、BSP蛋白表达水平均明显升高(P0.05)外,其余上述指标均明显降低(P0.05)。结论ERK/Smad通路在BMP2介导的hDPSCs细胞增殖、分化作用中处于激活活化状态,发挥重要作用。

关键词：人牙髓干细胞骨形态蛋白2 细胞外调节蛋白激酶/SMAD家族通路细胞增殖细胞分化

血管钙化大鼠肾动脉BMP2/Smad1/Runx2信号通路的表达

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四川大学学报（医学版） 2016年第2期47卷 180-183页

作者：覃春美魏晓龚财判吴蔚桦刘建樊均明欧三桃泸州医学院附属医院肾病内科泸州646000

目的观察血管钙化大鼠模型肾动脉上骨形态蛋白2(BMP2)/Smad1/Runt相关转录因子2(Runx2)信号通路的表达及其变化规律,探讨BMP2/Smad1/Runx2信号通路激活在肾动脉钙化中的作用。方法将24只雄性SD大鼠随机分为对照组和钙化组,钙化组建立维... 详细信息

目的观察血管钙化大鼠模型肾动脉上骨形态蛋白2(BMP2)/Smad1/Runt相关转录因子2(Runx2)信号通路的表达及其变化规律,探讨BMP2/Smad1/Runx2信号通路激活在肾动脉钙化中的作用。方法将24只雄性SD大鼠随机分为对照组和钙化组,钙化组建立维生素D3和尼古丁诱导的大鼠血管钙化模型,对照组给予生理盐水和花生油。6周后采用Von Kossa染色检测肾动脉钙化程度,钙离子试剂盒测定大鼠肾动脉钙含量,实时荧光定量PCR检测肾动脉组织中BMP2、Smad1、Runx2mRNA水平,免疫组化法观察BMP2、Smad1、Runx2及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果 Von Kossa染色见钙化组大鼠肾动脉有大量黑色颗粒沉淀。钙化组血管钙含量高于对照组(P2、Smad1、Runx2 mRNA的水平升高(P2/Smad1/Runx2信号通路蛋白在肾动脉的表达亦同步上调,而α-SMA的表达较对照组下降(P2mRNA(r=0.655,P2mRNA(r=0.734,P2/Smad1/Runx2通路的表达变化与肾动脉钙化的严重程度相关,提示BMP2/Smad1/Runx2信号通路参与了肾动脉钙化的发生发展。

关键词：血管钙化骨形态蛋白2 信号通路大鼠

壳聚糖/BMP-2质粒温敏水凝胶复合体生物相容性及修复大鼠颅骨缺损的研究

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临床和实验医学杂志 2023年第14期22卷 1461-1465页

作者：李慧吉秋霞程梦琳首都医科大学附属北京友谊医院口腔科北京100050 青岛大学附属医院口腔科山东青岛266071

目的构建壳聚糖(CS)/骨形态发生蛋白2(BMP2)质粒温敏水凝胶复合体CS/壳聚糖纳米粒(CSn)(pDNA-BMP2)-GP,研究其生物相容性及其在大鼠颅骨缺损再生中的作用。方法将1 mL CS/CSn-GP复合体注入18只SD大鼠左、右后肢大腿肌袋内,于第3天、第... 详细信息

目的构建壳聚糖(CS)/骨形态发生蛋白2(BMP2)质粒温敏水凝胶复合体CS/壳聚糖纳米粒(CSn)(pDNA-BMP2)-GP,研究其生物相容性及其在大鼠颅骨缺损再生中的作用。方法将1 mL CS/CSn-GP复合体注入18只SD大鼠左、右后肢大腿肌袋内,于第3天、第1、2、4、6、9周随机处死3只大鼠,取注射部位及邻近组织,苏木精和伊红染色后观察其炎症反应。将32只SD大鼠按照随机数字表法分为两组:CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP组、CS/CSn-GP组,各16只。在大鼠颅骨人字缝的左右两侧,各做一直径为5 mm的骨缺损,在每只实验鼠左侧的颅骨缺损区不放入任何材料,作为空白组,右侧分别植入各组材料。术后分别于第4、8周时随机处死6只大鼠,取出样本进行CT测量颅骨缺损面积及苏木精和伊红染色评价骨再生情况。结果苏木精和伊红切片显示,复合体注入肌袋后,未见明显炎症反应;术后第4、8周,在骨修复质量及速度上,CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP组明显优于空白组和CS/CSn-GP组。术后第4、8周,颅骨缺损面积CT结果显示:CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP组骨缺损面积分别为(0.06683±0.00248)、(0.02017±0.00816)S/cm^(2),均明显低于空白组[(0.15033±0.01748)、(0.05150±0.01183)S/cm^(2)]和CS/CSn-GP组[(0.12650±0.00706)、(0.03883±0.00422)S/cm^(2)],差异均有统计学意义(P骨临界尺寸骨缺损内的新骨形成,骨质量优于其他组。

关键词：大鼠壳聚糖纳米粒组织工程支架骨形态蛋白2 温敏水凝胶