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利用马铃薯x病毒表达载体在植物中表达非洲猪瘟病毒p30蛋白

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东北农业大学学报 2023年第10期54卷 21-27,78页

作者：武晓云范馨月栾雅梦柴孟竹姜雪杨英帅王宇婷郭亚婷程晓非东北农业大学植物保护学院哈尔滨150030

由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的非洲猪瘟疫病(ASF)具有极高发病率和致死率,是我国一类动物疫病,对我国养猪产业造成重大威胁和巨大经济损失。p30蛋白是ASFV最主要结构蛋白之一,具有强烈免疫原性,是ASFV疫苗研发... 详细信息

由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的非洲猪瘟疫病(ASF)具有极高发病率和致死率,是我国一类动物疫病,对我国养猪产业造成重大威胁和巨大经济损失。p30蛋白是ASFV最主要结构蛋白之一,具有强烈免疫原性,是ASFV疫苗研发重要靶标。利用马铃薯x病毒(Potato virus x,PVx)侵染性克隆,构建表达p30蛋白重组PVx载体,通过农杆菌浸润法验证在模式植物本氏烟中表达p30蛋白可行性。结果表明,重组PVx载体接种本氏烟后5 d,植株系统叶片出现花叶症状;接种11 d后,植株系统叶片明显坏死。RT-PCR和Western blot检测表明p30蛋白在本氏烟中成功表达。研究结果为进一步规模化生产植物源p30蛋白奠定坚实基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 p30蛋白马铃薯x病毒植物表达

兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯x病毒弱毒疫苗的创制

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中国烟草科学 2023年第1期44卷 44-50页

作者：刘春菊杜传印魏军刘宏李斐方敏于成明原雪峰山东潍坊烟草有限公司山东潍坊261061 山东农业大学植物保护学院山东泰安271018

黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯x病毒(PVx)在烟草中普遍存在、危害严重,对烟草产业健康发展有重大影响。为预防田间烟草上黄瓜花叶病毒和马铃薯x病毒,需要构建能够同时预防CMV和PVx的弱毒疫苗。本研究首先构建了CMV RNA2的2b蛋白提前终止突... 详细信息

黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯x病毒(PVx)在烟草中普遍存在、危害严重,对烟草产业健康发展有重大影响。为预防田间烟草上黄瓜花叶病毒和马铃薯x病毒,需要构建能够同时预防CMV和PVx的弱毒疫苗。本研究首先构建了CMV RNA2的2b蛋白提前终止突变体pCB301-CMVFny-R2-2bPT,在此突变体中插入200 bp的PVx保守序列(5890-6089)获得突变体质粒pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVx5890-6089。该突变体质粒与含野生型CMVFny RNA1和CMVFny RNA3的质粒等量混合后通过农杆菌浸润方法分别接种中烟100、红花大金元和林烟草,接种后烟草症状与野生型CMVFny-RNA1+RNA2+RNA3混合接种烟草症状相比显示弱侵染性。疫苗遗传稳定性检测证实疫苗载体中插入的PVx 200 bp保守片段稳定存在,CMV和PVx强毒株系攻毒试验表明该弱毒疫苗在中烟100上对CMV和PVx同时具备交叉保护作用。

关键词：交叉保护黄瓜花叶病毒马铃薯x病毒弱毒疫苗

同时快速检测马铃薯x病毒、Y病毒和S病毒试纸条的研制

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中国农业科技导报 2022年第1期24卷 211-217页

作者：张微李志新赵雪张金鹏付春江刘卫平于倩倩黑龙江省农业科学院克山分院黑龙江齐齐哈尔161600

为实现在马铃薯种薯生产田现场同时快速检测马铃薯x病毒(PVx)、Y病毒(PVY)和S病毒(PVS),采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,利用抗体与胶体金相结合的特性制备金原子与PVx、PVY和PVS抗体结合物(简称金标抗体),通过三维划膜喷金仪将金... 详细信息

为实现在马铃薯种薯生产田现场同时快速检测马铃薯x病毒(PVx)、Y病毒(PVY)和S病毒(PVS),采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,利用抗体与胶体金相结合的特性制备金原子与PVx、PVY和PVS抗体结合物(简称金标抗体),通过三维划膜喷金仪将金标抗体喷射于玻璃纤维上作为金标垫,将PVx抗体、PVY抗体和PVS抗体分别划线于硝酸纤维素膜作为检测线,将羊抗兔抗体划线于硝酸纤维素膜作为质控线,进行三重胶体金试纸条的制备。结果表明,研制的三重试纸条能够在5 min内同时检出PVx、PVY和PVS 3种病毒。PVx病汁液检测稀释限度可达10^(4)倍(W/V),PVY病汁液检测稀释限度可达2×10^(3)倍(W/V),PVS病汁液检测稀释限度可达10^(3)倍(W/V),即对PVx检测更灵敏。利用研制的三重检测试纸条检测危害马铃薯的其他3种常见病毒,未出现交叉反应。对田间采集的马铃薯叶片进行检测,发现利用试纸条与酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测的结果完全一致。三重检测试纸条具有操作简便,反应快捷的特点,特别适用于田间及口岸一线的检测。

关键词：马铃薯x病毒马铃薯Y病毒马铃薯S病毒三重检测试纸条

马铃薯x病毒外壳蛋白的表达水平与变偶密码子使用频率的相关性

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微生物学报 2003年第5期43卷 569-576页

作者：冯德江蔡华雅刘翔徐军望朱祯中国科学院遗传与发育生物学研究所北京100101

把经密码子修饰的马铃薯x病毒 (PotatoVirusx ,PVx)外壳蛋白 (CoatProtein,CP)基因和未修饰的野生型外壳蛋白基因与CaMV 3 5S启动子融合后 ,构建成相应的植物表达载体 ,利用农杆菌介导转化烟草。分别对修饰CP和野生CP的转基因烟草进行We... 详细信息

把经密码子修饰的马铃薯x病毒 (PotatoVirusx ,PVx)外壳蛋白 (CoatProtein,CP)基因和未修饰的野生型外壳蛋白基因与CaMV 3 5S启动子融合后 ,构建成相应的植物表达载体 ,利用农杆菌介导转化烟草。分别对修饰CP和野生CP的转基因烟草进行Westernblot和ELISA分析 ,结果表明经密码子修饰的PVx外壳蛋白的表达量是野生型蛋白表达量的 1 3～1 5。Northernblot结果表明修饰和未修饰的外壳蛋白在转录水平上是一致的。以上结果暗示外源基因中稀有密码子的数量可能是限制外源基因表达的一个因素。

关键词：马铃薯x病毒外壳蛋白表达水平变偶密码子基因修饰基因表达

马铃薯x病毒云南分离物单克隆抗体的制备及其检测应用

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2005年第5期31卷 608-612页

作者：吴建祥周雪平浙江大学生物技术研究所浙江杭州310029

用马铃薯x病毒(Potato virusx,PVx)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗PVx单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞2B12和4E7,并分别制备它们的单抗腹水.2株单克隆抗体腹水间接ELISA效价在10-6以上... 详细信息

用马铃薯x病毒(Potato virusx,PVx)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗PVx单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞2B12和4E7,并分别制备它们的单抗腹水.2株单克隆抗体腹水间接ELISA效价在10-6以上,2B12和4E7的抗体类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链.利用这些单克隆抗体建立了抗原包被的间接ELISA(ACP-ELISA)检测PVx的方法.病叶经1∶600倍稀释、提纯PVx病毒浓度为2 ng/mL(每孔的病毒绝对量为0.2 ng)时,该方法仍能检测到病毒.利用ACP-ELISA方法测定了田间样品,发现PVx在马铃薯上发病很普遍.

关键词：马铃薯x病毒单克隆抗体 ACP—ELISA

靶向马铃薯Y病毒和马铃薯x病毒的syn-tasiRNA设计及其抗病毒作用

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靶向马铃薯Y病毒和马铃薯X病毒的syn-tasiRNA设计及其抗病毒作用

作者：高倩内蒙古农业大学

学位级别：硕士

马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是人类发现最早的全球性植物病毒病之一,严重威胁到马铃薯、烟草、番茄等经济作物的产量,现今由于PVY寄主的广泛性和传播途径的多样性给防治带来了极大的困难。反式作用小干扰RNA(trans acting small in... 详细信息

马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是人类发现最早的全球性植物病毒病之一,严重威胁到马铃薯、烟草、番茄等经济作物的产量,现今由于PVY寄主的广泛性和传播途径的多样性给防治带来了极大的困难。反式作用小干扰RNA(trans acting small interfering RNA,tasiRNA)是一种RNA干扰途径,通过特异性地反式裂解目标基因的m RNA来诱导植物抗病性的产生,具有高效性和持久性的特点。利用其特殊作用方式产生的人工tasiRNA(synthetic tasiRNA,syn-tasiRNA)也成为了培育抗病毒马铃薯种质的新策略,并得到广泛应用,syn-tasiRNA可以靶向敲除单个基因或多个不同的基因,使得植物获得安全性更高、防治效果更好的抗病毒能力。本论文对内蒙古地区的13个马铃薯品种进行了抗病能力的筛选。以马铃薯Y病毒CP基因为靶标,设计并构建了syn-tais RNAs双元表达载体。运用农杆菌介导法转化到本氏烟中,对植物的抗PVY病毒能力进行了鉴定。在靶向马铃薯Y病毒CP基因的syn-tais RNAs双元表达载体基础上,构建靶向马铃薯x病毒CP基因的双元表达载体,检测对两种病毒的抗性。主要研究结果如下:(1)对13个马铃薯种质的204份材料进行抗PVY病毒鉴定,结果显示有83份0级抗性植株,3份1级抗性植株,14份3级抗性植株,54份5级抗性植株,32份7级抗性植株,18份9级抗性植株。其中入选病级0级率较高的品种有:马铃薯V7小薯、冀张薯12小薯、马铃薯沃土、马铃薯实验Ⅰ、马铃薯实验Ⅱ这5个品种可以作为抗PVY的初步鉴定结果。(2)设计并成功构建了靶向马铃薯Y病毒CP基因的syn-tasiRNA双元表达载体p MDC32-syn-tasiR-CPpvy1～3。并在本氏烟上进行瞬时表达p MDC32-syn-tasiRCPpvy1～3,接种PVY病毒进行抗病毒性检测。结果表明,病毒接种后14 d,注射p MDC32-syn-tasiR-CPpvy2的植物没有PVY病毒侵染的症状,也没有检测到病毒的CP蛋白。而注射缓冲液、p MDC32-syn-tasiR-CPpvy1和p MDC32-syn-tasiR-CPpvy3的对照植物表现出明显的病毒侵染症状,并有大量病毒CP蛋白积累。这说明syn-tasiRCPpvy2成功靶向并沉默PVY CP基因,有效抑制了病毒侵染。(3)在syn-tasiR-CPpvy2载体的基础上,设计并成功构建了2个同时靶向马铃薯Y病毒CP基因和马铃薯x病毒(potato virus x,PVx)CP基因的syn-tasiRNA双元表达载体p MDC32-syn-tasiR-CPpvy/pvx3和p MDC32-syn-tasiR-CPpvy/pvx5。并在本氏烟上进行瞬时表达p MDC32-syn-tasiR-CPpvy/pvx3和p MDC32-syn-tasiRCPpvy/pvx5后,接种PVY和PVx病毒检测其抗病毒性。结果说明,在接种病毒14d后,处理的植物没有表现出任何病毒侵染症状,对PVY和PVx均表现出高抗性。说明表达syn-tasiR-CPpvy/pvx3和syn-tasiR-CPpvy/pvx5可以多靶向沉默PVY CP基因和PVx CP基因,从而阻止了病毒对植物的复合侵染。

关键词：马铃薯马铃薯Y病毒马铃薯x病毒反式作用小干扰RNA 靶向沉默

马铃薯x病毒山西分离物外壳蛋白基因的克隆和核苷酸序列分析

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应用与环境生物学报 2008年第5期14卷 599-603页

作者：白云凤白冬梅张维锋田芙蓉山西省农业科学院作物遗传研究所太原030031 山西省大同市农业局山西大同037000

对GenBank公布的马铃薯x病毒的基因组核苷酸序列和外壳蛋白基因的核苷酸序列进行了同源性比对分析．结果表明，马铃薯x病毒外壳蛋白基凶核苷酸序列的同源性要高于基因组全序列的同源性，并且外壳蛋白基因3端核苷酸序列的同源性又高于5... 详细信息

对GenBank公布的马铃薯x病毒的基因组核苷酸序列和外壳蛋白基因的核苷酸序列进行了同源性比对分析．结果表明，马铃薯x病毒外壳蛋白基凶核苷酸序列的同源性要高于基因组全序列的同源性，并且外壳蛋白基因3端核苷酸序列的同源性又高于5＇端．设计一对特异性引物，以马铃薯感病植株的总RNA为模板，经RT-PCR扩增得到了马铃薯x病毒外壳蛋白基因．该基因含714个核苷酸，编码238个氨基酸．核苷酸序列比对结果表明，该基因与Genbank公布的马铃薯x病毒其他分离物的外壳蛋白基因的同源性为80．2％～97．5％，且3’端的同源性要高于5’端．上述结果预示，RNA干扰抗病毒基因工程中，利用马铃薯x病毒外壳蛋白基因的3’端比用5’端是更好的策略．

关键词：马铃薯x病毒外壳蛋白基因克隆核苷酸序列分析

马铃薯x病毒25kD运动蛋白基因和外壳蛋白基因介导的抗病性研究

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作物学报 2005年第7期31卷 827-832页

作者：刘晓玲宋云枝刘红梅温孚江朱常香白庆荣山东农业大学植物保护学院山东农业大学生命科学院

以马铃薯x病毒(potatovirusx,PVx)的RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT PCR)方法分别扩增出长度为681bp的非翻译马铃薯x病毒25kD运动蛋白基因(PVx p25)和长度为714bp的非翻译马铃薯x病毒外壳蛋白基因(PVx CP)。并分别构建植物表达... 详细信息

以马铃薯x病毒(potatovirusx,PVx)的RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT PCR)方法分别扩增出长度为681bp的非翻译马铃薯x病毒25kD运动蛋白基因(PVx p25)和长度为714bp的非翻译马铃薯x病毒外壳蛋白基因(PVx CP)。并分别构建植物表达载体pROKⅡp25和pROKⅡCP。利用农杆菌介导方法转化烟草NC89。经卡那霉素筛选、PCR检测,共获得转非翻译PVx p25的转基因植株78株,转非翻译PVx CP的转基因植株83株。抗病性试验表明,转非翻译PVx p25的78株中有31株对PVx的侵染表现高度抗病,抗性比例为39.7%;转非翻译PVx CP的83株中有11株对PVx的侵染表现高度抗病,抗性比例为13.3%。分子生物学检测和抗病性分析表明,抗病性均为RNA介导的病毒抗性。研究结果初步证明,转非翻译PVx p25可以更有效地获得抗PVx转基因植株。

关键词：马铃薯x病毒运动蛋白外壳蛋白 RNA介导的病毒抗性

马铃薯x病毒载体介导的人成纤维细胞生长因子21(hFGF21)在烟草中的表达

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2013年第4期41卷 45-51页

作者：付宏岐薛萍杨莉芳庞实锋渭南职业技术学院陕西渭南714000 广东医学院生物教研室广东湛江524023

【目的】利用马铃薯x病毒(PVx)表达载体(pgR107),在本氏烟草中表达人成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor 21,FGF21),旨在寻求一种低成本、方便、安全,且保持hFGF21蛋白生物活性的方法。【方法】将包含组氨酸(His)标签序列的... 详细信息

【目的】利用马铃薯x病毒(PVx)表达载体(pgR107),在本氏烟草中表达人成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor 21,FGF21),旨在寻求一种低成本、方便、安全,且保持hFGF21蛋白生物活性的方法。【方法】将包含组氨酸(His)标签序列的hFGF21-smGFP融合基因和hFGF21基因克隆进PVx表达载体,构建重组表达质粒pgR107-His-hFGF21-smGFP和pgR107-His-hFGF21。采用冻融法将质粒pgR107-His-hFGF21-smGFP、pgR107-smGFP和pgR107-His-hFGF21转入根瘤农杆菌GV3101中,通过农杆菌介导注射侵染接种本氏烟的叶片,采用SDS-PAGE、Western blotting和ELISA检测hFGF21-smGFP和hFGF21蛋白的表达情况。烟草叶片表达的融合蛋白经Ni-NTA柱纯化后,再用重组牛肠激酶(rbEK)裂解,获得纯度较高的重组hFGF21活性蛋白。hFGF21调节葡萄糖吸收活性用微量化的GOD-POD法检测。【结果】成功构建了植物病毒双元表达载体pgR107-His-hFGF21-smGFP和pgR107-His-hFGF21。表型观察发现,侵染第7天,烟草外源蛋白积累最高,smGFP和hFGF21-smGFP蛋白的积累主要在细胞质中。SDS-PAGE、Western blotting和ELISA分析表明,hFGF21重组蛋白可在烟草中有效表达,表达量高达500μg/g(鲜叶质量)。生物活性检测结果表明,纯化的hFGF21蛋白可以促进3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的吸收。【结论】利用PVx病毒载体,在本氏烟草中表达的重组hFGF21蛋白具备生物活性。

关键词：成纤维细胞生长因子21(FGF21) 融合蛋白烟草马铃薯x病毒