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马铃薯腐烂茎线虫RPA-LFD可视化快速检测方法的建立

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植物病理学报 2022年第6期52卷 984-992页

作者：高波马娟李秀花王容燕陈书龙河北省农林科学院植物保护研究所河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心农业部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室保定071000

马铃薯腐烂茎线虫是为害我国甘薯和马铃薯的一种重要植物病原线虫,也是我国重要的检疫性有害生物。为实现对该线虫的准确、快速且可视化的检测,本研究以马铃薯腐烂茎线虫rDNA-ITS序列为靶标构建了重组酶聚合酶结合侧流层析试纸条(RPA-L... 详细信息

马铃薯腐烂茎线虫是为害我国甘薯和马铃薯的一种重要植物病原线虫,也是我国重要的检疫性有害生物。为实现对该线虫的准确、快速且可视化的检测,本研究以马铃薯腐烂茎线虫rDNA-ITS序列为靶标构建了重组酶聚合酶结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)的可视化快速检测体系。该体系可在39℃条件下15 min内特异性地完成对马铃薯腐烂茎线虫的检测,对A型(甘薯种群)和B型(马铃薯种群)单头线虫(J4)的检出底限均为3125-1头线虫,可以直接对土壤和甘薯茎中的马铃薯腐烂茎线虫进行检测,灵敏度可达1头(J4)/10 g土壤和1头(J4)/2 g甘薯茎组织。该体系操作简便、成本低廉、结果可视,可为马铃薯腐烂茎线虫的早期预警和口岸检疫提供技术支撑。

关键词：马铃薯腐烂茎线虫重组酶聚合酶扩增侧流层析试纸条 rDNA-ITS 可视化快速检测

马铃薯腐烂茎线虫电压门控钙离子通道α2δ亚基基因克隆及其功能分析

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马铃薯腐烂茎线虫电压门控钙离子通道α2δ亚基基因克隆及其功能...

作者：陈雪伶湖南农业大学

学位级别：硕士

αδ亚基是电压门控钙离子通道（voltage-gated calcium channel,VGCC）的辅助亚基之一,对高压激活（high voltage activated,HVA）钙离子通道的转运和功能发挥重要作用。目前,关于αδ亚基的研究主要集中于哺乳动物,而关于植物寄生线... 详细信息

αδ亚基是电压门控钙离子通道（voltage-gated calcium channel,VGCC）的辅助亚基之一,对高压激活（high voltage activated,HVA）钙离子通道的转运和功能发挥重要作用。目前,关于αδ亚基的研究主要集中于哺乳动物,而关于植物寄生线虫的αδ亚基尚未见有关报道。克隆马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）αδ亚基,并对其表达及功能进行分析,对进一步明确植物寄生线虫VGCC的功能有重要意义。本研究以Ditylenchus destructor为实验材料,克隆得到马铃薯腐烂茎线虫DdCaαδ亚基基因,对其基因序列及在不同龄期的表达水平进行了分析;通过RNA干扰,沉默马铃薯腐烂茎线虫L型与非L型VGCCα以及αδ亚基,对DdCaαδ亚基在线虫中的生物学功能进行了研究。取得的主要研究结果如下:1.以马铃薯腐烂茎线虫c DNA为模板,通过RT-PCR和RACE技术克隆得到马铃薯腐烂茎线虫DdCaαδ亚基基因。DdCaαδ基因的开放阅读框为3825 bp,氨基酸序列分析显示其含有一个αδ亚基典型结构域VWA结构域,且在该结构域中包含一个金属离子粘附位点MIDAS基序。2.通过荧光定量PCR结果显示:DdCaαδ基因在马铃薯腐烂茎线虫的各个发育阶段均有表达,其中卵期的表达量最高,其次是J3和J4期,J2期的表达量最低。3.通过RNA-DIG原位杂交实验表明,DdCaαδ基因主要表达于马铃薯腐烂茎线虫的体壁肌肉、食道腺、雌虫子宫与后阴子宫囊以及雄虫交合刺等部位。3.通过ds RNA浸泡法分别对马铃薯腐烂茎线虫αδ亚基（DdCaαδ）、L型α亚基（DdCa1D）和非L型α亚基（DdCa1A）进行沉默,并使用多靶标基因共沉默的方法将两个基因进行同时沉默,初步分析了DdCaαδ亚基的生物学功能。结果表明,经ds RNA浸泡24 h后各靶标基因表达量均显著下调;沉默DdCaαδ亚基基因后6 h和24 h的线虫沙柱通过率分别下降至25.33%与44.67%,甘薯对线虫的吸引率下降至12.00%,繁殖系数下降至35.20%;沉默DdCa1D亚基基因后6 h和24 h的线虫沙柱通过率分别下降至23.67%与42.00%,吸引率下降至7.33%,口针收缩次数下降至33.00;DdCaαδ与DdCa1D亚基基因共同沉默后6 h和24 h的线虫沙柱通过率分别进一步下降至19.67%与41.00%,吸引率下降至5.67%,口针收缩次数降低至27.33。沉默DdCa1A亚基基因后线虫分泌蛋白含量下降至19740.00μg/m L,繁殖系数下降至22.23;DdCaαδ与DdCa1A亚基基因共同沉默后线虫分泌蛋白含量进一步下降至19664.44μg/m L,繁殖系数下降至17.20。根据RNA干扰实验结果推测,L型VGCC介导马铃薯腐烂茎线虫的迁移能力、趋化性与口针收缩,Non-L型VGCC介导马铃薯腐烂茎线虫的蛋白分泌与繁殖,且辅助亚基DdCaαδ对L型与Non-L型VGCC的这些生物学功能具有一定的辅助作用。同时,单独沉默DdCaαδ亚基基因也会影响马铃薯腐烂茎线虫的迁移能力、趋化性与繁殖系数。

关键词：马铃薯腐烂茎线虫电压门控钙离子通道 DdCavα2δ 基因克隆原位杂交 RNA干扰

马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶新基因(Dd-cpl-1)的克隆与序列分析

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生物工程学报 2011年第1期27卷 60-68页

作者：王高峰彭德良孙建华黄文坤彭焕龙海波天津师范大学生命科学学院天津300387 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193

L型半胱氨酸蛋白酶基因(Cathepsin L-like cysteine proteinase gene)为与植物寄生线虫寄生能力相关的多功能基因。运用RT-PCR和RACE的方法从马铃薯腐烂茎线虫Ditylenchus destructor中克隆出1个L型半胱氨酸蛋白酶新基因Dd-cpl-1(GenBank登录号为GQ180107)。该基因Dd-cpl-1 cDNA全长序列含有1个1 131 bp的开放性阅读框(ORF),编码376个氨基酸残基,其5′末端及3′末端分别含有29 bp和159 bp的非编码区(UTR)。Dd-cpl-1内含子外显子结构分析结果表明,其基因组序列包含7个内含子,且各内含子两端剪接位点序列遵守GT/AG规则。Dd-cpl-1基因推定的蛋白Dd-CPL-1与松材线虫L型半胱氨酸蛋白酶高度同源,一致性达到77%。以不同物种中L型半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列进行比对分析,推测推定的蛋白Dd-CPL-1含有L型半胱氨酸蛋白酶基因家族高度保守的催化三联体(Cys183,His322和Asn343)以及ERFNIN基系和GNFD基系。半胱氨酸蛋白酶系统发育分析表明,Dd-cpl-1属于由L型半胱氨酸蛋白酶组成的进化分支。Dd-cpl-1的这些序列特征进一步表明其为L型半胱氨酸蛋白酶基因。这是首次在马铃薯腐烂茎线虫中克隆到的L型半胱氨酸蛋白酶,为今后在蛋白水平对其进行进一步的功能分析提供基础。

关键词：马铃薯腐烂茎线虫 L型半胱氨酸蛋白酶 Dd-cpl-1

两种亚菊属植物挥发油及其主要成分对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性

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中国生物防治学报 2022年第3期38卷 549-554页

作者：解子仪逯佩玉宁安琪刘芯莹王俊龙张继梁俊玉西北师范大学生命科学学院兰州730070

为探究植物挥发油对马铃薯腐烂茎线虫的防治效果,本研究用丝裂亚菊和光苞亚菊挥发油及其主要组分对该线虫进行触杀毒杀活性的测试。采用药物浸泡法,将提取的两种植物挥发油及其主要的共有组分桉叶油醇和马鞭草烯醇作用于马铃薯腐烂茎线... 详细信息

为探究植物挥发油对马铃薯腐烂茎线虫的防治效果,本研究用丝裂亚菊和光苞亚菊挥发油及其主要组分对该线虫进行触杀毒杀活性的测试。采用药物浸泡法,将提取的两种植物挥发油及其主要的共有组分桉叶油醇和马鞭草烯醇作用于马铃薯腐烂茎线虫,测试致死中浓度,进而将桉叶油醇和马鞭草烯醇按不同比例进行复配混合,测试两者复配后的杀线虫活性,结果显示:处理 24 h 后,丝裂亚菊和光苞亚菊的挥发油均对马铃薯腐烂茎线虫有一定的触杀毒杀活性,致死中浓度(LC_(50))分别为 1.50 mg/mL 和 1.23 mg/mL;处理48 h后,丝裂亚菊和光苞亚菊的挥发油对马铃薯腐烂茎线虫的致死中浓度(LC_(50))分别为1.06 mg/mL和 0.70 mg/mL,较处理 24 h 后杀虫作用更显著。处理 24 h 后,桉叶油醇(LC_(50)=0.49 mg/mL)与马鞭草烯醇(LC_(50)=1.09 mg/mL)的杀线虫活性强于两种亚菊属植物挥发油;桉叶油醇和马鞭草烯醇以 2:6、4:4和 3:5 的体积比混配后,其 LC_(50)(0.18、0.17 和 0.20 mg/mL)都明显比两种化合物单独处理时要低,说明这两种化合物在挥发油中发挥了协同杀线虫的作用,且效果明显。本研究可为亚菊属植物挥发油及其主要组分绿色防控马铃薯腐烂茎线虫奠定基础。

关键词：丝裂亚菊光苞亚菊桉叶油醇马鞭草烯醇马铃薯腐烂茎线虫当归

杜鹃属植物内生真菌的分离及对赤拟谷盗和马铃薯腐烂茎线虫的防治作用

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中国生物防治学报 2023年第5期39卷 1113-1123页

作者：王旭东李秋月王佳丽姬颖马晓倩李媛梁俊玉西北师范大学生命科学学院兰州730070

本文以千里香杜鹃、头花杜鹃、烈香杜鹃、陇蜀杜鹃4种杜鹃属植物为材料,通过组织分离法分离其内生真菌,测定内生真菌粗提物的抗虫活性,筛选出具有良好抗虫活性的菌株,并对这些菌株进行形态学及分子生物学鉴定,以此初步筛选出对赤拟谷盗... 详细信息

本文以千里香杜鹃、头花杜鹃、烈香杜鹃、陇蜀杜鹃4种杜鹃属植物为材料,通过组织分离法分离其内生真菌,测定内生真菌粗提物的抗虫活性,筛选出具有良好抗虫活性的菌株,并对这些菌株进行形态学及分子生物学鉴定,以此初步筛选出对赤拟谷盗和马铃薯腐烂茎线虫具有较好抗虫活性的内生真菌菌株。结果表明:从4种杜鹃属植物中分离得到22株内生真菌菌株,共发酵产生44种粗提物,其中LS-Y-2菌丝体粗提物对赤拟谷盗具有一定触杀活性(LD_(50)=69.31μg/adult);LS-Y-2菌液粗提物、TH-Z-1菌液粗提物和LS-Y-4菌丝体粗提物对马铃薯腐烂茎线虫具有较好杀虫活性,其LC_(50)分别为0.06、0.07、0.18 mg/m L;LS-Y-2菌液粗提物和LS-Y-4菌液粗提物在质量浓度为2 mg/mL时,对赤拟谷盗的拒食率为84.28%和73.12%。通过形态学和分子生物学鉴定发现,LS-Y-2和LS-Y-4属于链格孢属真菌、TH-Z-1属于栓菌属真菌。综上,链格孢属真菌LS-Y-2、LS-Y-4和栓菌属真菌TH-Z-1对赤拟谷盗和马铃薯腐烂茎线虫具有一定防治作用。

关键词：杜鹃属内生真菌粗提物赤拟谷盗马铃薯腐烂茎线虫

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防治马铃薯腐烂茎线虫病的植物源药剂筛选

河南农业科学 2022年第4期51卷 95-102页

作者：彭静文赵远征王真王玉凤张妞王东周洪友内蒙古农业大学园艺与植物保护学院内蒙古呼和浩特010018 内蒙古自治区农牧业科学院植物保护研究所内蒙古呼和浩特010031 乌兰察布市农林科学研究所内蒙古乌兰察布012000

为探究植物源农药对马铃薯腐烂茎线虫的防治效果,采用直接触杀法,测定6种植物源农药对马铃薯腐烂茎线虫的室内毒力并观测其行为形态变化,同时测定其对线虫体液渗透的影响,最终对效果最优的植物源农药进行防效验证。室内毒力测定结果表明... 详细信息

为探究植物源农药对马铃薯腐烂茎线虫的防治效果,采用直接触杀法,测定6种植物源农药对马铃薯腐烂茎线虫的室内毒力并观测其行为形态变化,同时测定其对线虫体液渗透的影响,最终对效果最优的植物源农药进行防效验证。室内毒力测定结果表明,处理24 h后,5%香芹酚AS对马铃薯腐烂茎线虫的毒力最强,半数致死质量浓度(LC;)为39.542 mg/L。5%香芹酚AS及5%桉油精EC处理线虫后,线虫虫体僵直、死亡线虫虫体内出现泡状结构或空腔。此外,6种植物源农药在LC;条件下加剧了马铃薯腐烂茎线虫体液渗漏,且植物源药剂处理后的线虫悬浮液电导率明显高于无菌水对照,24 h时5%香芹酚AS处理线虫悬浮液电导率最高,为70.40μS/cm。防效试验结果表明,5%香芹酚AS灌根处理后发病率和病情指数与清水对照差异显著,室内、田间防效分别达65.73%、53.55%。综上所述,5%香芹酚AS毒力较高、防治效果较好,可作为防治马铃薯腐烂茎线虫的推荐药剂应用于生产。

关键词：植物源农药马铃薯腐烂茎线虫毒力测定体液渗漏防效

马铃薯腐烂茎线虫Dd-mel-26基因的克隆与功能分析

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生物技术通报 2021年第7期37卷 107-117页

作者：高波马娟李秀花李焦生王容燕陈书龙河北省农林科学院植物保护研究所河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心农业农村部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室保定071000

为更深入地了解马铃薯腐烂茎线虫并寻找具有RNAi应用价值的靶标基因资源,本研究从马铃薯腐烂茎线虫基因库中选取了一个潜在致死基因底物特异性适配体基因Dd-mel-26。利用RACE技术对该基因进行了克隆,并通过生物信息学、荧光定量PCR技术... 详细信息

为更深入地了解马铃薯腐烂茎线虫并寻找具有RNAi应用价值的靶标基因资源,本研究从马铃薯腐烂茎线虫基因库中选取了一个潜在致死基因底物特异性适配体基因Dd-mel-26。利用RACE技术对该基因进行了克隆,并通过生物信息学、荧光定量PCR技术以及dsRNA体外浸泡诱导线虫靶基因沉默的方法对该基因进行了功能分析。结果显示,Dd-mel-26基因的cDNA全长为1594 bp,包含一个1158 bp的开放阅读框,预测编码一个含385个氨基酸的蛋白质,分子量为43.52 kD,等电点为5.4。基因组结构中包含10个外显子和9个内含子序列。Dd-MEL-26蛋白属于MATH-BTB蛋白家族,不具有信号肽,预测其在细胞核中与相关的蛋白互作从而行使其功能。系统进化分析结果显示Dd-MEL-26蛋白与植物寄生线虫聚为一组,且与象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)的亲缘关系最近。通过dsRNA体外浸泡法将该基因沉默后显著地增加了线虫的繁殖量和垂直迁移力。因此,Dd-mel-26基因在一定条件下可以正调控马铃薯腐烂茎线虫的繁殖和垂直移动,但将该基因做为RNAi靶标从而实现对该线虫的防治可能需要更加深入的研究。

关键词：马铃薯腐烂茎线虫甘薯茎线虫病 Dd-mel-26基因 MATH-BTB基因家族

马铃薯腐烂茎线虫的遗传变异及其与生态因子的相关性

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农业生物技术学报 2012年第1期20卷 62-69页

作者：黄文坤何旭峰丁中彭德良中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室湖南农业大学生物安全科技学院

马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)是世界范围内广泛分布的检疫性线虫,严重危害多种作物。马铃薯腐烂茎线虫为适应不同的生活环境而发生相应的遗传变异,可以通过不同地理种群之间遗传结构的差异来研究环境生态因子对种群遗传结... 详细信息

马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)是世界范围内广泛分布的检疫性线虫,严重危害多种作物。马铃薯腐烂茎线虫为适应不同的生活环境而发生相应的遗传变异,可以通过不同地理种群之间遗传结构的差异来研究环境生态因子对种群遗传结构的影响。利用简单重复序列区间(inter-simple sequence repeat,SSR)分子标记技术研究了我国马铃薯腐烂茎线虫5个群体的遗传多样性、遗传变异,分析了遗传多样性与生态因子的相关性。研究结果表明,马铃薯腐烂茎线虫具有较高的遗传多样性。在种群水平,安徽省太和县种群的遗传多样性最高,河北省昌黎县的遗传多样性最低;在群体水平,5个群体的遗传多样性大小分别为安徽>山东>江苏>河北>北京。5个群体间具有较小程度的遗传变异,遗传分化系数(Gst)为0.0725;不同种群间具有频繁的基因交流(Nm=6.3933)。相关分析表明马铃薯腐烂茎线虫的Shannon遗传多样性与海拔、经度、纬度、年降雨量等成正相关关系,与年均温、最高温、最低温等成负相关关系;马铃薯腐烂茎线虫的遗传距离与地理距离成正相关关系。研究结果认为马铃薯腐烂茎线虫对低温具有较强的适应性,适于在华北、东北等地生长发育,将加强北方地区马铃薯种苗和种薯的管理,对防止马铃薯腐烂茎线虫进一步扩散蔓延提供指导意义。

关键词：马铃薯腐烂茎线虫简单重复序列区间(ISSR) 遗传变异生态因子相关分析

马铃薯腐烂茎线虫2-Cys型过氧化物还原酶基因的克隆及低剂量杀线虫剂对其表达的影响

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农业生物技术学报 2013年第6期21卷 698-706页

作者：何旭峰彭焕彭德良黄文坤贺文婷丁中湖南农业大学生物安全科学技术学院/植物病虫害生物学与防控湖南重点实验室中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室

过氧化物还原酶(Peroxiredoxins,Prx)属抗氧化蛋白超家族,其催化活性依赖于半胱氨酸的存在。在该家族成员中,2-cysteine型过氧化物还原酶(2-Cys Prx)在抵抗外源性ROS保护植物线虫表皮免受氧化性损害以及线虫生长发育方面具有重要作用。... 详细信息

过氧化物还原酶(Peroxiredoxins,Prx)属抗氧化蛋白超家族,其催化活性依赖于半胱氨酸的存在。在该家族成员中,2-cysteine型过氧化物还原酶(2-Cys Prx)在抵抗外源性ROS保护植物线虫表皮免受氧化性损害以及线虫生长发育方面具有重要作用。为了解低剂量杀线虫剂对2-Cys Prx基因表达的影响,本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆了马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)2-Cys Prx基因,并利用Real-time PCR检测了马铃薯腐烂茎线虫经低剂量(10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001μg/mL)杀线虫剂甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和涕灭威处理24 h后,2-Cys Prx基因表达量的变化。结果表明,该基因cDNA全长为784 bp,编码196个氨基酸,命名为Dd-Prx-1(GenBank登录号:JQ609353)。同源性分析结果表明,Dd-Prx-1与其他线虫的2-Cys Prx具有较高的同源性。Dd-Prx-1的基因组由6个外显子和5个内含子组成。蛋白质预测N端没有明显的信号肽,但有一个含有23个亲水氨基酸的跨膜结构域。qRT-PCR分析结果表明,经低剂量甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和涕灭威处理后,马铃薯腐烂茎线虫Dd-Prx-1基因的表达量与对照相比较无显著性差异(P线虫应对低剂量杀线虫剂的机制提供了基础资料。

关键词：马铃薯腐烂茎线虫过氧化物还原酶杀线虫剂基因表达