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血清Ⅲ型马立克病病毒单克隆抗体的制备及在疫苗蚀斑计数中的应用

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中国兽医学报 2024年第2期44卷 258-263页

作者：李文超刘丹杨承槐李启红李欣张莹毛娅卿李俊平沈阳工学院生命工程学院辽宁抚顺113122 中国兽医药品监察所北京100081

通过制备马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)血清Ⅲ型特异性单克隆抗体,并对其特性进行鉴定,为建立鸡马立克病(Marek’s disease,MD)二价活疫苗间接免疫荧光蚀斑计数方法奠定基础。以纯化的MDV血清Ⅲ型HVT Fc-126株免疫BALB/c小... 详细信息

通过制备马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)血清Ⅲ型特异性单克隆抗体,并对其特性进行鉴定,为建立鸡马立克病(Marek’s disease,MD)二价活疫苗间接免疫荧光蚀斑计数方法奠定基础。以纯化的MDV血清Ⅲ型HVT Fc-126株免疫BALB/c小鼠,采用常规单克隆抗体技术,经间接免疫荧光方法筛选杂交瘤细胞株;选取1株制备MDVⅢ型单克隆抗体,建立MD二价活疫苗的间接免疫荧光蚀斑计数方法。结果筛选出2株稳定分泌抗MDV血清Ⅲ型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并选择1D2株单抗建立了检测MD二价活疫苗的间接免疫荧光蚀斑计数方法,可快速准确地计数二价活疫苗中血清Ⅲ型病毒的蚀斑形成单位数(Plaque forming unit,PFU),与琼脂覆盖法相比,敏感性和特异性大大提高。因此,制备的MDV单克隆抗体具有良好的血清型特异性,可用于MD二价活疫苗的间接免疫荧光蚀斑计数。

关键词：马立克病病毒血清型单克隆抗体二价疫苗蚀斑计数

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马立克病病毒PCR检测方法建立与应用

北方牧业 2024年第9期 17-17页

作者：杨柳鲍佳茵陈松管艳庆许利军刘华格王学静陈立功河北农业大学动物医学院河北保定071001 涿州市农业农村局河北涿州072750 保定市畜牧工作站河北保定071001 河北省畜牧兽医研究所河北保定071001

马立克病(Marek’s disease,MD)是由马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染引起的一种免疫抑制性疾病,引发感染鸡的T淋巴细胞组织增生和传染性肿瘤,是危害养禽业的主要免疫抑制病之一。MDV鸡体内发育成熟后,随着皮屑的脱落而进... 详细信息

马立克病(Marek’s disease,MD)是由马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染引起的一种免疫抑制性疾病,引发感染鸡的T淋巴细胞组织增生和传染性肿瘤,是危害养禽业的主要免疫抑制病之一。MDV鸡体内发育成熟后,随着皮屑的脱落而进入外界环境中,通过水平传播感染其他鸡只,造成MD的流行。meq基因和病毒编码的端粒酶RNA与MDV直接致瘤相关,其中meq基因对MDV诱导的T淋巴细胞转化至关重要,故meq基因可导致MDV感染鸡T淋巴细胞瘤的形成。常规PCR方法,具有效率高、特异性强、敏感性高等优点,可用于MD的初步诊断和病毒鉴定。因此,建立一种能快速检测MDV的PCR方法对养禽业的健康发展具有重要意义。

关键词：马立克病病毒免疫抑制病养禽业 PCR检测方法感染鸡病毒鉴定传播感染组织增生

马立克病病毒超强毒株GX0101感染宿主部分病毒基因表达水平及致病阶段分析

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畜牧兽医学报 2016年第8期47卷 1635-1644页

作者：马圣明滕蔓余祖华党露李会珍丁轲邓瑞广罗俊河南科技大学动物科技学院动物疫病与公共安全重点实验室洛阳471003 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室农业部动物免疫学重点实验室河南省动物免疫学重点实验室郑州450002 河南农业大学牧医工程学院郑州450002

旨在探讨马立克病病毒（MDV）超强毒株GX0101对宿主的感染过程及致病阶段,即＂Cornell模型＂,为进一步使用该毒株研究MDV的致病或致瘤机制奠定基础。用GX0101接种1日龄SPF鸡,建立了感染宿主的动物模型;然后用RT-qPCR分析10个具有代表性... 详细信息

旨在探讨马立克病病毒（MDV）超强毒株GX0101对宿主的感染过程及致病阶段,即＂Cornell模型＂,为进一步使用该毒株研究MDV的致病或致瘤机制奠定基础。用GX0101接种1日龄SPF鸡,建立了感染宿主的动物模型;然后用RT-qPCR分析10个具有代表性的MDV蛋白编码基因在感染不同时间点的动态基因转录水平。结果显示,GX0101感染发病鸡的临床症状及剖检病变与典型的马立克病一致;MDV编码的结构蛋白基因gB、gE和UL6、非结构蛋白基因UL42和UL52、立早期基因ICP4、水平传播相关基因UL13以及磷酸化蛋白基因pp38具有相似的转录水平和趋势,均在GX0101感染后7d上升至第一个峰值,10d降至低谷,14d又逐渐升高并在21d达到第二个峰值,30~60d逐渐下降并处于较低的转录水平;MDV编码的原癌基因meq和毒力相关基因RLORF6在GX0101感染7d即持续升高,并在14~60d的试验周期内较长时间处于高转录水平。结合作者此前研究及本文结果分析,GX0101感染宿主的＂Cornell模型＂：早期增殖性-限制性感染期为1~7d,潜伏感染期约为10d前后,晚期溶细胞性感染及免疫抑制期发生于14~21d,而T细胞转化及淋巴瘤形成阶段可能在14d前后就已经开始。

关键词：马立克病病毒超强毒株 GX0101 实时荧光定量PCR 基因表达致病阶段

马立克病病毒1型LZ1309株的分离鉴定与生物特性分析

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中国兽医科学 2015年第5期45卷 490-496页

作者：李慧敏罗琼刘郁夫郭凯赵兵温良海陈瑞爱华南农业大学兽医学院广东广州510642 广东大华农动物保健品股份有限公司分子免疫学实验室广东广州510642

从免疫马立克病(MD)HVT和CVI988疫苗的甘肃某规模化鸡场采集MD阳性病鸡抗凝全血,分离淋巴细胞,接种于鸡胚成纤维细胞,分离出1株马立克病病毒(MDV)。病毒蚀斑纯化后经PCR和间接免疫荧光鉴定,该毒株为MDV1型毒株,命名为LZ1309株。PCR扩增... 详细信息

从免疫马立克病(MD)HVT和CVI988疫苗的甘肃某规模化鸡场采集MD阳性病鸡抗凝全血,分离淋巴细胞,接种于鸡胚成纤维细胞,分离出1株马立克病病毒(MDV)。病毒蚀斑纯化后经PCR和间接免疫荧光鉴定,该毒株为MDV1型毒株,命名为LZ1309株。PCR扩增并测序致瘤基因meq。核苷酸同源性分析结果显示,与国内分离株LS株的同源性最高(99.9%),与CVI988株的同源性最低(98.8%)。氨基酸序列分析显示,氨基酸突变位点符合国内强毒株的特征。为掌握LZ1309株的致病力,进行了LZ1309株攻毒试验。结果显示,LZ1309株攻毒组鸡的死亡率为13.3%,攻毒组鸡体重显著降低,肝、脾、腺胃乳头和心脏均出现肿瘤结节,胸腺和法氏囊严重萎缩。PCR检测攻毒鸡的器官组织,均能扩增到MDV1型强毒株meq基因的特异性条带。本研究成功分离鉴定出1株MDV强毒株,此结果为研究国内MDV毒力演化、致病机理和疫苗研发奠定了重要基础。

关键词：马立克病病毒分离鉴定生物特性致病性

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马立克病病毒Meq单克隆抗体的制备

中国兽医科学 2016年第9期46卷 1073-1078页

作者：高俊娜张幸星连雪孙海伟郇文彬张训海 JUNG Yong-Sam 陈鸿军钱莺娟南京农业大学动物医学院江苏南京210095 安徽科技学院家禽疫病防控监测安徽省重点实验室安徽凤阳233100 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为研制马立克病病毒RB1B超强毒株致瘤蛋白Meq单克隆抗体,本研究通过聚合酶链式反应（PCR）扩增马立克病病毒（Md5）meq基因5′端第1~507位核苷酸,将其克隆入原核表达载体p Cold-TF,转化到BL21（DE3）感受态中,经异丙基硫代半乳糖苷（IPT... 详细信息

为研制马立克病病毒RB1B超强毒株致瘤蛋白Meq单克隆抗体,本研究通过聚合酶链式反应（PCR）扩增马立克病病毒（Md5）meq基因5′端第1~507位核苷酸,将其克隆入原核表达载体p Cold-TF,转化到BL21（DE3）感受态中,经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,对表达产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行检测。用融合蛋白His-Meq169腹腔免疫BALB/c小鼠,利用间接免疫荧光（IFA）和Western-blot检测多抗血清;血清检测阳性后,取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,利用IFA和有限稀释法筛选阳性单克隆杂交瘤细胞株,最后筛选出了4株阳性杂交瘤细胞株,即1C11、3E4、3G10和5H11。将获得的单抗经IFA方法检测强毒株Md5或弱毒株CVI988感染的CEF细胞,结果显示,Meq单抗可特异性识别MDV感染形成的细胞空斑。这为进一步研究Meq的生物学功能奠定了基础。

关键词：马立克病病毒 Meq 原核表达单克隆抗体

马立克病病毒与禽网状内皮增生病病毒的混合感染及在传代过程中的重组

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畜牧兽医学报 2016年第1期47卷 128-134页

作者：宿靖伟滕蔓罗俊迟佳琦余祖华禹乐乐胡博张改平河南省农业科学院动物免疫学重点实验室农业部动物免疫学重点实验室河南省动物免疫学重点实验室郑州450002 河南农业大学牧医工程学院郑州450002 河南科技大学动物科技学院动物疫病与公共安全重点实验室洛阳471003

旨在了解国内鸡群马立克病病毒(MDV)和禽网状内皮增生病病毒(REV)的混合感染及自然重组状况,探讨两种病原的基因重组对MDV病原学特性的潜在影响及危害。利用PCR扩增、序列测定及间接免疫荧光试验(IFA),对来自河南商品蛋鸡群的17个MDV分... 详细信息

旨在了解国内鸡群马立克病病毒(MDV)和禽网状内皮增生病病毒(REV)的混合感染及自然重组状况,探讨两种病原的基因重组对MDV病原学特性的潜在影响及危害。利用PCR扩增、序列测定及间接免疫荧光试验(IFA),对来自河南商品蛋鸡群的17个MDV分离株进行研究。结果表明,其中两个毒株HNGS206和HNXZ103的病毒基因组中存在REV—LTR的重组插入。进一步的IFA结果显示,HNGS206和HNXZ103并非MDV与REV的自然重组流行毒株,这两个毒株基因组中LTR的插入发生于临床病例鸡混合感染后的病毒分离及传代培养过程中。结果提示,虽然目前国内鸡群中MDV和REV的混合感染较为普遍,但MDV与REV自然重组毒株的流行状况仍需要进一步的流行病学监测。

关键词：马立克病病毒禽网状内皮增生病病毒流行病学混合感染病毒传代基因重组

马立克病病毒中meq基因对CEF细胞chTERT mRNA转录水平的影响

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中国生物制品学杂志 2007年第10期20卷 721-724页

作者：潘风光郑梅竹周玉卢士英罗翔丹艾永兴吉林大学军需科技学院长春130062 吉林大学人兽共患病研究所长春130062 吉林大学畜牧兽医学院长春130062

目的研究鸡马立克病病毒(MDV)meq基因对鸡胚成纤维细胞(CEF)的端粒酶催化亚单位基因(chTERT) mRNA转录水平的影响,并探讨meq基因与端粒酶活性的关系。方法构建重组载体pcDNA-meq,转染CEF细胞,利用Taq- Man探针,经实时荧光定量RT-PCR检测... 详细信息

目的研究鸡马立克病病毒(MDV)meq基因对鸡胚成纤维细胞(CEF)的端粒酶催化亚单位基因(chTERT) mRNA转录水平的影响,并探讨meq基因与端粒酶活性的关系。方法构建重组载体pcDNA-meq,转染CEF细胞,利用Taq- Man探针,经实时荧光定量RT-PCR检测meq基因对CEF细胞chTERT mRNA转录水平的影响,并用TRAP法测定端粒酶活性。结果meq基因能激活CEF细胞中chTERT mRNA的转录,在48h的转录水平是72h的16倍,端粒酶活性在转染后48h是转染后72h的12倍。结论meq基因可能是MDV基因组中的主要致瘤基因,可以在体外导入正常的CEF细胞中,激活端粒酶的活性。

关键词：马立克病病毒 meq基因 chTERT基因端粒酶活性鸡胚成纤维细胞

马立克病病毒pUL56蛋白对DF-1细胞免疫通路相关基因的转录调控研究

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病毒学报 2022年第3期38卷 684-693页

作者：张金城马德青徐贝贝冯伟民陈鑫韦天超韦平黄腾广西大学动物科学技术学院南宁530004

马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)UL56基因编码α-疱疹病毒同源蛋白pUL56。为全面了解该病毒蛋白与宿主细胞的互作关系,本研究首先将表达红色荧光蛋白标记的MDV pUL56质粒转染鸡DF-1细胞系,瞬时表达蛋白的细胞经流式细胞术分选... 详细信息

马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)UL56基因编码α-疱疹病毒同源蛋白pUL56。为全面了解该病毒蛋白与宿主细胞的互作关系,本研究首先将表达红色荧光蛋白标记的MDV pUL56质粒转染鸡DF-1细胞系,瞬时表达蛋白的细胞经流式细胞术分选,富集阳性细胞群进行高通量测序及mRNA转录组分析。测序结果显示,表达pUL56的DF-1细胞存在914个差异表达基因,其中462个上调,452个下调。通过GO、KEGG和Reactome通路富集分析,发现富集的显著差异表达基因分布于先天性免疫反应、细胞因子产生等相关信号通路。在此基础上,随机选取了I型干扰素信号通路和促炎症细胞因子基因进行RT-qPCR验证,IFI6、IFIH1、CD83、HSP90AA1、IL-1β和IL-8L1基因的表达量均为上调,而IL-12β表达则下调,该结果与高通量测序相符。本研究提示pUL56作为非结构蛋白,可能对宿主细胞过程有广泛的调节作用。

关键词：马立克病病毒 pUL56 转录组信号通路差异表达基因

马立克病病毒miR-M4对病毒致病性的影响

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中国兽医科学 2016年第3期46卷 282-289页

作者：余祖华丁轲马圣明滕蔓贾艳艳郁川何雷张春杰河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室河南洛阳471003 河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室河南省动物免疫学重点实验室河南郑州450002

为了研究马立克病病毒(M D V)-m i R-M4对超强毒MDV(vv MDV)致病性的影响,采用细菌人工染色体(bacterialartificial chromosome,BA C)技术和Red/ET重组突变技术构建了缺失MDV-mi R-M4基因的MDV感染性BAC克隆株G X 0101Δmi R-M4,然后将GX0101Δmi R-M4感染1日龄SPF鸡,通过对生长性能、免疫器官发育、死亡率和致瘤率的研究来评价其对致病性的影响。结果显示,GX0101Δmi R-M4毒株在整个试验周期对鸡的生长均无显著影响(P>0.05),但可诱导法氏囊和胸腺发生萎缩;接种后第90天感染鸡的累计死亡率为18%,肿瘤发生率为22%,与亲本株GX0101 BAC相比分别降低了82%和6%,且眼观无可见肿瘤的肝的显微肿瘤发生率也低于GX0101 BAC组。以上结果表明,MDV-mi R-M4基因的缺失可降低vv MDV的致死率和致瘤率,MDV-mi R-M4在MDV的致病性方面具有重要的调控作用。

关键词：马立克病病毒细菌人工染色体技术 MDV-miR-M4 致病性