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马疱疹病毒1型UL56蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

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现代畜牧科技 2024年第4期 1-6页

作者：张玉鉴撒瑞雪吴桂灵杨凯舒张嗣玉李银涛齐晋卫杨贤斌邓智超刘建华新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 新疆草食动物新药研究与创制重点实验室新疆乌鲁木齐830052

为制备马疱疹病毒1型(EHV-1)UL56蛋白(pUL56)的多克隆抗体。该研究根据GenBank中EHV-1 YM2019株全基因组序列,采用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白,与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠并制备pUL56多克隆抗体,经Western blot与间接ELISA试验测定多... 详细信息

为制备马疱疹病毒1型(EHV-1)UL56蛋白(pUL56)的多克隆抗体。该研究根据GenBank中EHV-1 YM2019株全基因组序列,采用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白,与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠并制备pUL56多克隆抗体,经Western blot与间接ELISA试验测定多克隆抗体反应性。结果显示,纯化后的pUL56可以与EHV-1阳性血清发生反应;pUL56多克隆抗体的效价为1∶128 000,并能与pUL56特异性结合。本研究成功制备具有良好反应性的pUL56多克隆抗体,为pUL56功能特性及EHV-1致病机制的研究奠定理论基础。

关键词：马疱疹病毒1型 UL56蛋白原核表达多克隆抗体

马疱疹病毒1型gB-gD融合基因真核表达载体的构建与表达

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当代畜牧 2024年第2期 54-57页

作者：蔡炜帆刘建华邓智超撒瑞雪张嗣玉新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

为构建马疱疹病毒1型gBgD融合基因真核表达载体,笔者将gB与gD的抗原优势区直接相连,经密码子优化后由公司合成目的基因,双酶切后将gBgD融合基因连接至pcDNA3.1载体,经PCR、酶切与测序验证后转染HEK293T细胞,用Western bolt验证蛋白的体... 详细信息

为构建马疱疹病毒1型gBgD融合基因真核表达载体,笔者将gB与gD的抗原优势区直接相连,经密码子优化后由公司合成目的基因,双酶切后将gBgD融合基因连接至pcDNA3.1载体,经PCR、酶切与测序验证后转染HEK293T细胞,用Western bolt验证蛋白的体外表达,将质粒导入小鼠体内,用IHC验证蛋白的体内表达。结果显示,重组质粒pcDNA3.1-gB-gD经PCR和双酶切均能显示2337 bp的清晰条带,与预期大小相符且测序正确。Western blot检测显示在87kDa处出现了清晰条带,与预期大小相符。IHC检测显示黄棕色特异性免疫沉淀。本研究成功构建了马疱疹病毒1型gBgD融合基因真核表达载体,在体外和体内均成功表达了反应原性良好的gBgD融合蛋白,为EHV-1新型DNA疫苗的研究奠定了基础。

关键词：马疱疹病毒1型 gB gD 真核表达 DNA疫苗

马疱疹病毒1型ORF2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

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现代畜牧兽医 2024年第6期 1-5页

作者：杨贤斌吴桂灵撒瑞雪杨凯舒张嗣玉齐晋卫李银涛刘建华新疆农业大学动物医学学院新疆草食动物新药研究与创制重点实验室

研究旨在克隆马疱疹病毒1型（EHV-1） ORF2基因，通过大肠杆菌原核表达系统获得ORF2蛋白，制备多克隆抗体。根据EHV-1 YM2019株全基因组序列（GenBank:MT063054）设计1对引物，将ORF2基因克隆至pET-28a-ORF2原核表达载体中，通过Transet... 详细信息

研究旨在克隆马疱疹病毒1型（EHV-1） ORF2基因，通过大肠杆菌原核表达系统获得ORF2蛋白，制备多克隆抗体。根据EHV-1 YM2019株全基因组序列（GenBank:MT063054）设计1对引物，将ORF2基因克隆至pET-28a-ORF2原核表达载体中，通过Transetta (DE3)感受态细胞，异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达ORF2蛋白，使用Ni-NTA琼脂糖纯化树脂纯化，免疫BALB/c小鼠，检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示：ORF2基因成功克隆至原核表达载体pET-28a中，并通过大肠杆菌表达系统得到ORF2蛋白，大小约为38 ku，以包涵体的形式存在。通过Ni-NTA纯化树脂获得纯度较高的重组蛋白，能够与EHV-1阳性血清特异性结合；间接ELISA方法检测多克隆抗体的效价为1∶64 000,RK-13表达的ORF2蛋白可被多克隆抗体能特异性识别。研究表明，大肠杆菌表达的ORF2重组蛋白具有良好反应原性，ORF2蛋白制备的多克隆抗体效价高、特异性强，可为ORF2蛋白的生物学功能和基因缺失疫苗的研究奠定基础。

关键词：马疱疹病毒1型 ORF2蛋白原核表达多克隆抗体制备

马疱疹病毒1型gD囊膜蛋白磷酸化位点的鉴定及其对亚细胞定位的影响

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动物医学进展 2023年第6期44卷 70-76页

作者：段琦颖贾万欣肖楚宁屈春惠李斌王世民新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

为了研究蛋白质磷酸化修饰对马疱疹病毒1型(EHV-1)gD囊膜蛋白高尔基体驻留的影响,通过蛋白质修饰质谱技术鉴定gD囊膜蛋白磷酸化位点,利用Overlap PCR技术构建磷酸化位点突变型真核表达质粒pCAGGS-gD-S391A-myc及pCAGGS-gD-S391D-myc,并... 详细信息

为了研究蛋白质磷酸化修饰对马疱疹病毒1型(EHV-1)gD囊膜蛋白高尔基体驻留的影响,通过蛋白质修饰质谱技术鉴定gD囊膜蛋白磷酸化位点,利用Overlap PCR技术构建磷酸化位点突变型真核表达质粒pCAGGS-gD-S391A-myc及pCAGGS-gD-S391D-myc,并转染至Hela细胞,经Western blot检测野生型及突变型gD囊膜蛋白表达情况,利用间接免疫荧光技术鉴定gD囊膜蛋白及其突变体的亚细胞定位。质谱结果显示,EHV-1 gD囊膜蛋白的S391位点发生磷酸化修饰;测序结果表明,成功构建模拟磷酸化突变型质粒pCAGGS-gD-S391D-myc及模拟去磷酸化突变型质粒pCAGGS-gD-S391A-myc;间接免疫荧光结果显示,模拟磷酸化突变体gD-S391D-myc与野生型gD-myc定位情况类似,都驻留于高尔基体;而模拟去磷酸化突变体gD-S391A-myc可转运至细胞膜。S391位点的磷酸化修饰对gD囊膜蛋白驻留于高尔基体起到重要作用,阻断该位点磷酸化修饰可促进gD囊膜蛋白转运至细胞膜,为进一步研究gD高尔基体驻留机制提供参考。

关键词：马疱疹病毒1型 gD囊膜蛋白磷酸化亚细胞定位

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马疱疹病毒1型gp2基因分子特征

中国兽医杂志 2022年第6期58卷 19-24,28页

作者：刘建华吴桂灵胡月加尔肯贾钦瑞孙文程撒瑞雪张嗣玉冉多良新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

为了探索α疱疹病毒亚科的马疱疹病毒特有基因gp2的功能及分子结构,本试验以EHV-1 XJ2015株为研究对象,扩增其gp2基因并测序,继而进行遗传进化分析、氨基酸序列差异性分析和蛋白质性质分析。结果显示,30株EHV-1病毒gp2蛋白氨基酸序列相... 详细信息

为了探索α疱疹病毒亚科的马疱疹病毒特有基因gp2的功能及分子结构,本试验以EHV-1 XJ2015株为研究对象,扩增其gp2基因并测序,继而进行遗传进化分析、氨基酸序列差异性分析和蛋白质性质分析。结果显示,30株EHV-1病毒gp2蛋白氨基酸序列相似性达90.38%;gp2蛋白预测包括1个信号肽、1个螺旋跨膜结构域和1个核外运信号;gp2蛋白二级结构以无规卷曲为主,高达88%,极性分子居多,亲水性氨基酸占52.02%,第25~130位和第273~565位氨基酸亲水性和抗原性较强,易形成潜在的抗原表位。由此可见,gp2基因属于EHV-1较保守的基因,gp2蛋白是分泌型蛋白,且具有良好的抗原性。本试验为进一步解析EHV-1 gp2基因及其编码蛋白功能、制作基因工程疫苗和诊断试剂提供了生物信息学依据。

关键词：马疱疹病毒1型 gp2基因分子结构功能生物信息学分析

马疱疹病毒1型gD囊膜蛋白互作蛋白的鉴定分析

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动物医学进展 2023年第3期44卷 21-25页

作者：陈琳晖段琦颖王世民新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

旨在筛选并分析与马疱疹病毒1型(EHV-1)gD囊膜蛋白相互作用的宿主蛋白。用免疫共沉淀和LCMS/MS质谱技术鉴定出与EHV-1 gD囊膜蛋白互作的宿主蛋白,并进行生物信息学分析。免疫共沉淀联合质谱分析鉴定到229个与EHV-1 gD囊膜蛋白互作的宿... 详细信息

旨在筛选并分析与马疱疹病毒1型(EHV-1)gD囊膜蛋白相互作用的宿主蛋白。用免疫共沉淀和LCMS/MS质谱技术鉴定出与EHV-1 gD囊膜蛋白互作的宿主蛋白,并进行生物信息学分析。免疫共沉淀联合质谱分析鉴定到229个与EHV-1 gD囊膜蛋白互作的宿主蛋白,对蛋白功能分析发现大多数蛋白与形成细胞骨架有关,细胞骨架不仅能支撑细胞形态,还参与物质运输,结果提示有部分蛋白参与囊泡运输并在其中发挥重要作用,还存在与囊泡形成直接相关的蛋白——网络蛋白重链,为探究EHV-1二次囊膜化的形成过程和研究gD囊膜蛋白与囊泡间的关系奠定了基础。

关键词：马疱疹病毒1型囊膜蛋白质谱互作蛋白

马疱疹病毒1型XJ2015株的增殖、纯化及鉴定

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中国生物制品学杂志 2021年第3期34卷 282-285页

作者：贾钦瑞鲍子磊车传忠郑学功翟少华冉多良新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

目的评价蔗糖密度梯度离心法对马疱疹病毒1型(equine herpesvirus-1,EHV-1)XJ2015株的纯化效果。方法病毒增殖后,收获病毒液,经硫酸铵浓缩、蔗糖密度梯度离心法纯化EHV-1,电镜下观察病毒形态,SDS-PAGE、Western blot、BCA及马体致病性... 详细信息

目的评价蔗糖密度梯度离心法对马疱疹病毒1型(equine herpesvirus-1,EHV-1)XJ2015株的纯化效果。方法病毒增殖后,收获病毒液,经硫酸铵浓缩、蔗糖密度梯度离心法纯化EHV-1,电镜下观察病毒形态,SDS-PAGE、Western blot、BCA及马体致病性试验鉴定病毒纯化效果。结果纯化后的EHV-1电镜下可见完整的病毒颗粒且形态典型,直径约120 nm,效价可达10^(10.02) TCID_(50)/0.1 mL,回收率为61.7%;SDS-PAGE及Western blot分析显示,纯化病毒杂蛋白显著减少且具有良好的反应原性;纯化后病毒感染马匹出现原发性感染临床症状并出现排毒现象。结论利用蔗糖密度梯度离心法可获得高纯度的纯化病毒株EHV-1-XJ-2015,为进一步研究EHV-1的致病机理及减毒、灭活疫苗的研发提供了参考。

关键词：马疱疹病毒1型蔗糖密度梯度离心纯化鉴定

马疱疹病毒1型gp2基因缺失株的构建及生长特性分析

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中国兽医学报 2021年第7期41卷 1242-1246,1263页

作者：胡月贾钦瑞吴桂灵车传忠刘建华加尔肯冉多良新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

构建针对马疱疹病毒1型(equine herpesvirus-1,EHV-1)XJ2015株的转移载体pUC-gp2^(-)LR和pUC-gp2^(-)LR-EGFP;将EHV-1 XJ2015基因组与pUC-gp2^(-)LR-EGFP共转染至RK-13细胞,利用EGFP基因筛选获得EHV-1 XJ2015-gp2^(-)/EGFP+毒株,以此毒株基因组与pUC-gp2^(-)LR共转染至RK-13细胞,筛选去除EGFP基因的EHV-1 XJ2015-gp2^(-)毒株并通过生长曲线、蚀斑形态、易感细胞连续传代评价其增殖能力和遗传稳定性。结合荧光观察、空斑纯化和PCR检测,获得能稳定遗传的EHV-1 XJ2015-gp2^(-),该毒株的生长曲线与亲本株存在差异,增殖能力下降约2个病毒滴度;两者的空斑面积平均值分别为0.378 mm^(2)和1.698 mm^(2),差异极显著(P<0.01)。结果表明,成功获得EHV-1 gp2基因缺失株,该毒株的体外生长动力学较亲本毒弱,为研制EHV-1减毒活疫苗奠定了基础。

关键词：马疱疹病毒1型 gp2基因基因缺失生物学特性

马疱疹病毒1型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

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中国兽医学报 2021年第12期41卷 2345-2350页

作者：胡月刘建华王雪竹车传忠吴桂灵加尔肯冉多良新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

为快速准确地检测马疱疹病毒1型(equine herpesvirus 1,EHV-1),本研究根据EHV-1基因组序列进化分析筛选出特异性较高的ORF68基因的保守区域设计引物与探针,建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果显示该方法线性关系良好,相关系数为... 详细信息

为快速准确地检测马疱疹病毒1型(equine herpesvirus 1,EHV-1),本研究根据EHV-1基因组序列进化分析筛选出特异性较高的ORF68基因的保守区域设计引物与探针,建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果显示该方法线性关系良好,相关系数为0.999;灵敏度高,最低检测量为10.2拷贝/μL,比常规PCR敏感1000倍;特异性强,检测EHV-2、EHV-4、EHV-5、马动脉炎病毒和马流感病毒均无交叉反应;重复性好,组内及组间样本检测的Ct值均小于等于2%;对2020年收集的60份伴有呼吸道症状的马匹鼻试子进行检测分析显示本方法的阳性检出率(26.67%)高于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR(23.33%)和常规PCR(21.67%)。本研究建立了一种快速、灵敏、稳定、特异性强的TaqMan荧光定量PCR检测方法,可用于EHV-1的快速诊断和核酸定量检测,为EHV-1的防控工作提供了有力手段。

关键词：马疱疹病毒1型 ORF68基因荧光定量PCR TaqMan探针