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RXR motif在倍半萜合酶催化产物特异性中的作用

RXR motif在倍半萜合酶催化产物特异性中的作用

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作者：郝庆刚河北大学

学位级别：硕士

萜类化合物普遍存在于植物、微生物的次级代谢产物中。随着越来越多的萜类化合物的发现,对萜类合酶的研究也更加深入,这不仅可以帮助我们从理论上认识萜类化合物的合成机制,理解萜类合酶结构和功能的关系,还可以帮助在药物、香精等应用... 详细信息

萜类化合物普遍存在于植物、微生物的次级代谢产物中。随着越来越多的萜类化合物的发现,对萜类合酶的研究也更加深入,这不仅可以帮助我们从理论上认识萜类化合物的合成机制,理解萜类合酶结构和功能的关系,还可以帮助在药物、香精等应用方面的研究更进一步。萜类合酶不同的催化机理是揭示萜类化合物数量和结构多样性的关键,对其保守基序DDXXD、NSE/DTE、RXR的研究更是其中的重点。本文选取了倍半萜合酶保守基序RXR作为研究切入口,探讨在两种不同的倍半萜合酶催化机制中该保守基序对催化产物特异性的影响,并做了如下工作:1.为探讨RXR基序对倍半萜环化酶产物特异性的影响,我们选择对青蒿紫穗槐二烯合酶(Artemisia annua Amorpha-4,11-diene synthase,ADS)R262、R264进行单突变,并将R262K和T296A/V/I进行联合突变,发现:R262辅助farnesyl diphosphate(FPP)离子化释放焦磷酸基团需要侧链氨基的存在,但是环化反应中间产物nerolidyl diphosphate((R,E)-NPP)的离子化不需要R262的协助就可以实现。推测T296A/V/I可以和R262K通过其他氨基孙或底物碳骨架发生相互作用,而且这种相互作用的结果跟底物构象有关,双突变不能作用于(E,E)-FPP,但是可以催化(R,E)-NPP、(S,E)-NPP分别生成对应的amorpha-4,7(11)-diene和farnesene,以及二者共有的nerolidol、α-bisabolol,作用于(Z,E)-FPP时,双突变可以抑制R262K环化反应中阳离子中间体对水的捕获。R264K对产物没有影响。2.为探讨RXR基序对反式倍半萜环化酶产物特异性的影响,我们选择反式环化酶烟草马兜铃烯合酶(Tobacco 5-epi-aristolochene synthase,TEAS)R264、R266进行单突变,发现:虽然TEAS催化(Z,E)-FPP经历顺式异构,但是R264K并不能明显增加产物中萜醇的生成;底物伯碳位焦磷酸基团的释放需要266位侧链含氨基的残基协助,但是叔碳位焦磷酸的基团则不需要该位点发挥作用。R266K突变体使酶丧失活性。3.倍半萜合酶RXR基序中的第一个R可以辅助FPP离子化,并引入水分子猝灭环化过程形成的阳离子中间体生成萜醇,第二个R作用机制尚不明确。而且,RXR对底物构象具有特异性。

关键词：紫穗槐二烯合酶马兜铃烯合酶 RXR基序定点突变

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倍半萜合酶C末端在其功能中的作用

倍半萜合酶C末端在其功能中的作用

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作者：赵慧芳河北大学

学位级别：硕士

萜类化合物数量众多,结构多样,普遍存在于植物和微生物的次级代谢产物中。随着越来越多的萜类化合物的发现,对萜类合酶的研究也更加深入,这不仅可以帮助我们从理论上认识萜类化合物的合成机制,理解萜类合酶结构和功能的关系,还有助于进... 详细信息

萜类化合物数量众多,结构多样,普遍存在于植物和微生物的次级代谢产物中。随着越来越多的萜类化合物的发现,对萜类合酶的研究也更加深入,这不仅可以帮助我们从理论上认识萜类化合物的合成机制,理解萜类合酶结构和功能的关系,还有助于进一步研究其在药物、香精等方面的应用。以本实验室前期初步实验结果(ADS的C末端6个氨基酸截短活性下降)为基础,利用软件对催化机制不同的三种倍半萜合酶进行比较,在相应位置进行截短,明确C末端保留几个氨基酸能够保留其原有活性,以探讨此效应是否有普遍性,具体工作如下:1.为探讨C末端对倍半萜环化酶功能的影响,我们选择对黄花蒿紫穗槐二烯合酶(amorpha-4,11-diene synthase,ADS)C末端进行点突变,取纯化后的蛋白在相同酶浓度下对相同浓度底物进行体外催化,催化生成的产物经GC-FID分析,同时用MG法测定酶动力学参数Km和Kcat,发现:C1-C10截短不改变酶催化生成的产物,C1-C6截短从酶动力学参数上来看,其活性没有明显变化,C7-C10活性降低,没有用此方法测出动力学参数。2.为探讨C末端对非环化倍半萜合酶功能的影响,我们选择对非环化酶法呢烯合酶((E)-β-farnesene,BFS)C末端进行点突变,取纯化后的蛋白在相同酶浓度下对相同浓度底物进行体外催化,催化生成的产物经GC-FID分析,同时用MG法测定酶动力学参数Km和Kcat,发现:C1-C10截短不改变酶催化生成的产物,C1-C6截短从酶动力学参数上来看,其活性没有明显变化,C7-C10活性降低,没有用此方法测出动力学参数。3.为探讨C末端对反式倍半萜环化酶功能的影响,我们选择反式环化酶烟草马兜铃烯合酶(5-epi-aristolochene synthase,EAS)C末端进行点突变,取纯化后的蛋白在相同酶浓度下对相同浓度底物进行体外催化,催化生成的产物经GC-FID分析,同时用MG法测定酶动力学参数Km和Kcat,发现:C1-C10截短不改变酶催化生成的产物,C1-C6截短从酶动力学参数上来看,其活性没有明显变化,C7-C10活性降低,没有用此方法测出动力学参数。结合三种倍半萜合酶的结构信息,我们发现三种酶C末端1-10个氨基酸的截短不会改变产物,α螺旋上的氨基酸会降低酶活性,而α螺旋以外的氨基酸的截短与野生型相比,在活性上没有明显变化。

关键词：紫穗槐二烯合酶法呢烯合酶马兜铃烯合酶 C末端截短定点突变

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