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香蕉枯萎病菌myosin-1基因的功能分析及外施dsRNA介导的抗性评估

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植物病理学报 2022年第3期52卷 321-333页

作者：曾凡云刘远征王艳玮漆艳香张欣谢艺贤彭军中国热带农业科学院环境与植物保护研究所农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室海口571101 中国热带农业科学院海口实验站海口571101

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.***.cubense,Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。SMART在线软件分析myosin-1基因具有肌球蛋白马达蛋白(myosin motor ... 详细信息

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.***.cubense,Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。SMART在线软件分析myosin-1基因具有肌球蛋白马达蛋白(myosin motor domain,MMD),肌动蛋白尾结构TH1(myosin tail)和Src家族同源结构域SH3(src homology domain 3),与禾谷镰刀菌中氰烯菌酯靶标基因myosin-5具高度的蛋白同源性,相似性高达83%。利用Split-marker基因重组技术获得Foc4的myosin-1基因敲除突变体,Δmyosin-1突变株丧失了对氰烯菌酯的敏感性,菌丝生长缓慢,产孢量减少且孢子畸形,对香蕉致病力严重下降,证实myosin-1是氰烯菌酯在Foc4中的作用靶标基因。外施靶向myosin-1体外转录的dsRNA,能抑制菌丝的生长,降低菌丝活性;菌丝膨胀扭曲分枝增多,出现典型的球状结构,与氰烯菌酯处理后的表型一致。在盆栽活体人工接种实验中,体外施用dsRNA可以明显抑制枯萎病外部症状的发展,推迟发病时间,赋予寄主抗性,结果说明体外施用dsRNA可以作为新型杀菌剂防治香蕉枯萎病。综上,myosin-1基因作为氰烯菌酯在Foc4中的靶标基因具有高度的序列保守,在调控菌丝生长发育,产孢以及致病力等方面发挥重要作用,而外施dsRNA具有防治香蕉枯萎菌的巨大潜力。

关键词：香蕉枯萎病菌 myosin-1基因基因敲除氰烯菌酯 dsRNA

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种内切多聚半乳糖醛酸酶基因的比较

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中国南方果树 2023年第2期52卷 84-88页

作者：曾蕊王莉范煜周而勋上海农林职业技术学院上海201699 华南农业大学植物保护学院/广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室广州510642

通过基因克隆和测序方法,对来自国内外尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporum f. sp.cubense(简称Foc) 1号和4号小种的6个菌株endo-PG基因同源性、与其他真菌的亲缘关系以及endo-PG基因和氨基酸序列进行分析,为香蕉枯萎病菌致病机制... 详细信息

通过基因克隆和测序方法,对来自国内外尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporum f. sp.cubense(简称Foc) 1号和4号小种的6个菌株endo-PG基因同源性、与其他真菌的亲缘关系以及endo-PG基因和氨基酸序列进行分析,为香蕉枯萎病菌致病机制的研究奠定基础。结果表明,同小种的endo-PG序列同源性高,亲缘关系近,不同小种的同源性较低,亲缘关系较远;总体来说,4号小种比1号小种同源性更高,亲缘关系更近。在全基因序列分析中,没有发现明显的基因差异可以作为区分2个小种致病性差异的依据。根据预测的CDS序列翻译成氨基酸序列比对,发现6个菌株的endo-PG基因编码的氨基酸变异并没有引起相关保守结构域的变化,推测6个菌株的致病性可能与endo-PG基因的调控相关。

关键词：香蕉枯萎病菌生理小种内切多聚半乳糖醛酸酶基因序列比较 Cavendish香蕉

香蕉枯萎病菌4号生理小种β1-微管蛋白基因的功能分析

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热带作物学报 2018年第6期39卷 1153-1160页

作者：刘远征漆艳香曾凡云丁兆建何壮彭军张欣谢培兰谢艺贤海南大学热带农林学院海南海口570228 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所海南海口571101

本研究克隆并鉴定香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)β1-微管蛋白(β1-tub)基因,采用Split-marker同源重组技术获得Foc4的β1-tub基因敲除突变体,通过测定突变体菌株的生长速度、产孢量、致病力及对多菌灵敏感性,研究β1-tub基因在香蕉枯... 详细信息

本研究克隆并鉴定香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)β1-微管蛋白(β1-tub)基因,采用Split-marker同源重组技术获得Foc4的β1-tub基因敲除突变体,通过测定突变体菌株的生长速度、产孢量、致病力及对多菌灵敏感性,研究β1-tub基因在香蕉枯萎病菌的生长发育及对多菌灵抗药性中的作用。结果表明:与Foc4野生型菌株相比,敲除突变体生长缓慢、菌丝畸形及产孢量增加,对巴西蕉苗的致病力明显减弱,但对多菌灵的抗性水平无明显变化。由此推测β1-tub基因可能在Foc4的生长发育、产孢及致病力等方面具有重要的作用。

关键词：香蕉枯萎病菌 β1-微管蛋白基因敲除致病力

香蕉枯萎病菌4号生理小种β2-微管蛋白基因敲除与表型分析

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果树学报 2018年第12期35卷 1467-1477页

作者：刘远征漆艳香曾凡云丁兆建何壮彭军张欣谢艺贤中国热带农业科学院环境与植物保护研究所海口571101 海南大学热带农林学院海口570228 中国热带农业科学院海口实验站海口570102

【目的】克隆并鉴定香蕉枯萎病菌(Foc4)β2-微管蛋白(β2-tub)基因,阐明β2-tub在多菌灵的抗药性及在病原菌致病过程中发挥的作用。【方法】采用PCR技术克隆了β2-tub的序列全长,并对其进行生物信息学分析。应用Splitmarker同源重组技... 详细信息

【目的】克隆并鉴定香蕉枯萎病菌(Foc4)β2-微管蛋白(β2-tub)基因,阐明β2-tub在多菌灵的抗药性及在病原菌致病过程中发挥的作用。【方法】采用PCR技术克隆了β2-tub的序列全长,并对其进行生物信息学分析。应用Splitmarker同源重组技术获得Foc4的β2-tub基因敲除突变体,并对其突变体的生物学表型、致病力及其对多菌灵的敏感性进行测定。【结果】生物信息学分析表明,Foc4β2-tub基因全长为1 694 bp,cDNA编码区全长1 347 bp,由4个内含子和5个外显子组成,编码蛋白含448个氨基酸。Foc4对多菌灵表现为敏感(EC50=0.51μg·mL^(-1)),与Foc4相比,β2-tub基因敲除突变体对多菌灵的敏感性(EC50=0.36μg·mL^(-1))表现显著增强,差异显著(p <0.05)。与Foc4相比,β2-tub基因敲除突变体的生物学表型没有变化,对巴西蕉苗的致病力明显减弱。【结论】β2-tub基因具有高度保守性,β2-tub基因敲除突变体对细胞壁选择性压力、氧化压力和渗透压力均没有影响,但致病力下降,同时β2-tub基因的变化会引起Foc4对多菌灵抗性的改变。

关键词：香蕉枯萎病菌 β2-微管蛋白基因敲除致病力

香蕉枯萎病菌4号生理小种小分泌蛋白FocTR4-SSP1的互作蛋白鉴定

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香蕉枯萎病菌4号生理小种小分泌蛋白FocTR4-SSP1的互作蛋白鉴定

中国植物病理学会2023年学术年会

作者：张耀月宋汉达罗梅董章勇仲恺农业工程学院植物健康创新研究院

香蕉枯萎病是由尖孢镰孢菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.***.cubense,Foc)侵染引起的维管束毁灭性病害,根据其侵染寄主种类不同可分为3个生理小种,我国主要分布有1号(Foc1)和4号(Foc4)生理小种,其中4号生理小种危害最为严重,严重威... 详细信息

香蕉枯萎病是由尖孢镰孢菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.***.cubense,Foc)侵染引起的维管束毁灭性病害,根据其侵染寄主种类不同可分为3个生理小种,我国主要分布有1号(Foc1)和4号(Foc4)生理小种,其中4号生理小种危害最为严重,严重威胁着我国香蕉产业的发展。小分泌蛋白(Small Secreted Protein,SSP)是植物病原菌上特异的一类小分泌蛋白,富含半胱氨酸,在植物的免疫反应中扮演着重要角色。本研究利用生物信息学方法预测到香蕉枯萎病菌FocTR4-14013中候选的效应蛋白,其中分离鉴定到了一个小分泌蛋白FocTR4-SSP1,该蛋白长度为147个氨基酸,富含半胱氨酸,N端含有一个18个氨基酸的信号肽序列。利用农杆菌介导的烟草瞬时表达系统进行亚细胞定位发现FocTR4-SSP1定位在细胞质,通过酵母双杂交技术在香蕉cDNA酵母文库中筛选到一个与FocTR4-SSP1互作的蛋白:四肽重复蛋白Tetratricopeptide repeat protein 1 (Ma-TRP1),进一步的双分子荧光互补(BIFC)技术发现FocTR4-SSP1与Ma-TRP1在植物体内存在互作关系。有证据表明TPR蛋白与植物免疫有关,因此我们猜测FocTR4-SSP1可能通过与Ma-TPR1的互作参与调控寄主的免疫反应。研究拟进一步试验探索FocTR4-SSP1调控Ma-TPR1蛋白的过程,为研究香蕉抗枯萎病菌的致病机制提供新的理论基础。

关键词：香蕉枯萎病菌小分泌蛋白酵母双杂交互作蛋白

香蕉枯萎病菌mi1R138靶标基因的鉴定与功能研究

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香蕉枯萎病菌mi1R138靶标基因的鉴定与功能研究

中国植物病理学会2023年学术年会

作者：何嘉慧钟家祺金龙祺姜子德李敏慧华南农业大学植物保护学院

尖孢镰孢菌古巴转化型(Fusarium oxysporum f.***.cubense,Foc)所引起的香蕉枯萎病是香蕉生产上最具毁灭性的病害,对全球香蕉生产及贸易造成严重威胁。近年来研究发现真菌存在一种非编码小分子RNA——microRNA-like RNA (milRNA),并证实m... 详细信息

尖孢镰孢菌古巴转化型(Fusarium oxysporum f.***.cubense,Foc)所引起的香蕉枯萎病是香蕉生产上最具毁灭性的病害,对全球香蕉生产及贸易造成严重威胁。近年来研究发现真菌存在一种非编码小分子RNA——microRNA-like RNA (milRNA),并证实milRNAs能够在病原真菌-寄主植物互作过程中起跨界调控作用,但香蕉枯萎病菌中是否存在milRNA的跨界调控尚未见报道。课题组前期通过小分子RNA高通量测序技术鉴定出香蕉枯萎病菌中依赖于FoQDE2合成且致病相关的milRNA——Foc-milR138。为进一步阐明香蕉枯萎病菌的Foc-milR138如何跨界调控寄主香蕉上的基因表达从而调控致病过程,本研究通过比较香蕉枯萎病菌侵染寄主不同时间的转录组数据,并结合psRNATarget软件在线预测milRNA的靶标基因,筛选出Foc-milR138在寄主香蕉(Musa acuminnata subsp.malaccensis)上的候选靶标基因MaLysm。利用烟草瞬时表达体系将香蕉MaLysm基因和Foc-milR138共同表达在烟草叶片,再通过qRT-PCR和Western Blot分别在转录水平和翻译水平验证了Foc-milR138与MaLysm基因的靶向调控关系。生物信息学分析显示该基因编码一种LysM类受体激酶蛋白,具有识别真菌细胞壁几丁质成分从而激发免疫反应功能。利用农杆菌介导的瞬时转化方法,将Malysm异源表达在本氏烟草叶片中,通过绿色荧光观察到其亚细胞定位于细胞膜。后续笔者会继续对香蕉MaLysm基因的功能进行研究,以期全面揭示香蕉枯萎病菌在致病过程中通过生成Foc-milR138靶向寄主香蕉功能基因的致病机理。

关键词：香蕉枯萎病菌 milRNA 跨界调控靶标基因鉴定 MaLysm

香蕉枯萎病菌自噬基因Atg7的致病功能研究

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香蕉枯萎病菌自噬基因Atg7的致病功能研究

中国植物病理学会2023年学术年会

作者：唐锐薛治峰张廷萍秦世雯云南大学农学院资源植物研究院

香蕉枯萎病由尖孢镰孢菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.***.cubense,Foc)引起的真菌维管束病害,在全球香蕉产区均有发生,严重危害香蕉产业发展。Foc致病1号小种(Foc1)侵染粉蕉(ABB)和龙牙蕉(AAB)等品种,而致病4号小种(Foc4)能侵染绝... 详细信息

香蕉枯萎病由尖孢镰孢菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.***.cubense,Foc)引起的真菌维管束病害,在全球香蕉产区均有发生,严重危害香蕉产业发展。Foc致病1号小种(Foc1)侵染粉蕉(ABB)和龙牙蕉(AAB)等品种,而致病4号小种(Foc4)能侵染绝大多数香蕉品种,包括抗Foc1的主栽Cavendish (AAA)品种。已有研究表明,侵染Cavendish香蕉时,孢子萌发和菌丝生长的差异是造成两者致病性差异的主要原因。而细胞自噬是调控植物病原真菌分生孢子萌发和菌丝生长的重要细胞过程,因此推测其与Foc致病性分化密切相关。本研究通过分析Foc降解香蕉细胞壁的转录组发现,自噬基因Atg7在Foc1突破巴西蕉细胞壁防御时被显著抑制,而在Foc1降解粉蕉细胞壁时以及Foc4降解2种细胞壁时均正常表达。本研究对Foc1-Atg7进行了过表达以及对Foc4-Atg7进行敲除发现,氮饥饿诱导后,过表达菌株Foc1-OEAtg7的自噬小体的数量显著多于野生型Foc1,而敲除突变体Foc4-ΔAtg7未观察到自噬小体或自噬溶酶体,验证了Atg7是Foc自噬体形成的重要基因。相较于野生型Foc1,Foc1-OEAtg7对粉蕉的定殖能力和致病力显著增强,且能造成巴西蕉致病。Foc4-ΔAtg7对巴西蕉的致病力显著降低,而互补菌株Foc4-ΔAtg7::ATG7和野生型Foc4致病力无显著差异。Foc1-OEAtg7菌株在3种氮源(KNO、甘氨酸和尿嘧啶)和9种碳源(果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、甘油、Tween 80、果胶、羧甲基纤维素钠和木聚糖)环境下,生长较野生型Foc1快;Foc4-ΔAtg7在2种氮源(KNO和甘氨酸)和6种碳源(麦芽糖、甘露醇、甘油、Tween80、果胶和羧甲基纤维素钠)环境下,生长较互补菌株Foc4-ΔAtg7::ATG7和野生型Foc4慢。另外,过表达Atg7未能提高Foc1抵御渗透胁迫、氧化胁迫和细胞壁抑制剂的能力,但缺失Atg7却造成Foc4对渗透胁迫、氧化胁迫和细胞壁抑制剂的抗性降低。以上结果说明,细胞自噬对Foc致病性有显著影响,其中Atg7是造成香蕉枯萎病菌2个小种致病性分化的自噬基因,深入研究该基因的致病分子机制,将为Foc寄主专化性研究提供新的视角,并为香蕉枯萎病的防治提供新的杀菌剂靶标位点。

关键词：香蕉枯萎病菌生理小种寄主专化性自噬基因

香蕉枯萎病菌4号生理小种smy1基因的功能分析

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热带作物学报 2019年第12期40卷 2447-2455页

作者：何壮漆艳香曾凡云丁兆建梁峻玮张欣彭军谢培兰谢艺贤海南大学热带农林学院海南海口570228 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所海南海口571101

Smy1是一种参与调控真菌生长的驱动蛋白。本研究克隆了香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc 4)驱动蛋白基因smy1,并采用同源重组技术获得smy1敲除的野生型Foc 4的smy1敲除突变体。通过测定突变体菌丝形态、生长速度、产生孢子量、对香蕉苗的致... 详细信息

Smy1是一种参与调控真菌生长的驱动蛋白。本研究克隆了香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc 4)驱动蛋白基因smy1,并采用同源重组技术获得smy1敲除的野生型Foc 4的smy1敲除突变体。通过测定突变体菌丝形态、生长速度、产生孢子量、对香蕉苗的致病力及对氰烯菌酯的敏感性,用于研究smy1在香蕉枯萎病菌的生长发育及对氰烯菌酯抗药性中的作用。结果表明,与野生型Foc 4相比,smy1敲除突变体生长缓慢、菌丝畸形、产孢量增加,对巴西蕉苗的致病力减弱,但对氰烯菌酯的抗性水平变化不大。由此推断smy1基因可能在Foc 4的生长发育、产孢以及致病力等方面具有重要作用。

关键词：香蕉枯萎病菌基因敲除致病力 smy1基因

香蕉枯萎病菌milR133靶标基因的鉴定与功能研究

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香蕉枯萎病菌milR133靶标基因的鉴定与功能研究

中国植物病理学会2023年学术年会

作者：张芙蓉曾敬苑曼琳姜子德李敏慧华南农业大学植物保护学院

由尖孢镰孢菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.***.cubense,Foc)引起的香蕉枯萎病,被称为"香蕉的癌症",此病成为全球香蕉产业持续健康发展的主要障碍。病原菌在与植物互作的过程中,会分泌大量的细胞壁降解酶(cell wall degrading enzyme... 详细信息

由尖孢镰孢菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.***.cubense,Foc)引起的香蕉枯萎病,被称为"香蕉的癌症",此病成为全球香蕉产业持续健康发展的主要障碍。病原菌在与植物互作的过程中,会分泌大量的细胞壁降解酶(cell wall degrading enzymes,CWDEs)来解聚寄主植物细胞壁的多糖成分,从而破坏植物细胞壁结构,其中大多数的CWDEs是糖基水解酶(glycoside hydrolases,GHs)。实验室前期在香蕉枯萎病菌中筛选出一个依赖Argonaute蛋白FoQDE2合成的类微小RNA (Foc-milR133),该milRNA在病原菌侵染初期显著高表达,是香蕉枯萎病菌致病相关的milRNA。为进一步阐明Foc-milR133如何调控香蕉枯萎病菌的致病机制,本研究利用eGFP标记的靶基因鉴定方法,通过烟草瞬时表达系统,验证了Foc-milR133能够靶向抑制香蕉枯萎病菌FoRohin1的翻译。生物信息学分析发现FoRohin1编码一种GH16家族的糖基水解酶,N端具有信号肽序列;在烟草叶片瞬时表达该基因可显著激活植物的免疫反应,而当FoRohin1与Foc-milR133共表达时寄主免疫反应被明显抑制;转录模式分析显示FoRohin1在香蕉枯萎病菌侵染寄主24 h和48 h后转录水平明显比纯培养时降低,而Foc-milR133在此阶段则显著地高表达。通过对香蕉枯萎病菌FoRohin1基因敲除,以及对敲除突变体的表型分析和致病力测定,我们研究了该基因的功能。结果发现ΔFoRohin1的生长和产孢与野生型XJZ2菌株相比基本不受影响;但对荧光增白剂的耐受性显著降低;对香蕉苗的致病力检测结果显示ΔFoRohin1敲除突变体的致病力明显高于野生型菌株。上述实验结果表明FoRohin1虽然编码细胞壁降解酶,但在香蕉枯萎病菌侵染初期并非作为致病因子而发挥功能,而是具有激活植物抗病反应的功能。推测该基因极有可能编码一种效应子在病原菌与寄主识别过程中发挥重要的作用。本研究揭示了FocmilR133通过调控其靶标基因FoRohin1表达,从而调控枯萎病菌对寄主香蕉的致病力,为香蕉枯萎病菌的致病机理研究提供有力的分子证据。

关键词：香蕉枯萎病菌 milRNA GH16糖基水解酶致病机理