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人乳头瘤病毒16/18型E7双特异亲和体融合颗粒酶B的免疫亲和毒素制备和鉴定

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病毒学报 2023年第5期39卷 1326-1335页

作者：余丽君李妍姮黄智羡杨佳妮谢自新张丽芳李文姝温州医科大学微生物学与免疫学教研室温州325000

制备人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)16/18型双特异性亲和体(Affibody,Z_(HPV16-18E7))融合颗粒酶B(Grb)的免疫亲和毒素,并鉴定其诱导靶细胞凋亡效应。于实验室前期已构建的Z_(HPV16-18E7)的N-端、中间、及C-端,偶联Grb构建不... 详细信息

制备人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)16/18型双特异性亲和体(Affibody,Z_(HPV16-18E7))融合颗粒酶B(Grb)的免疫亲和毒素,并鉴定其诱导靶细胞凋亡效应。于实验室前期已构建的Z_(HPV16-18E7)的N-端、中间、及C-端,偶联Grb构建不同融合形式的免疫亲和毒素,并在原核表达体系中制备与纯化;在线网站分析免疫亲和毒素基本理化性质和空间结构预测;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测免疫亲和毒素分别对靶蛋白HPV16E7、HPV18E7的特异性结合力;流式细胞分析术检测免疫亲和毒素分别诱导人宫颈癌细胞SiHa(HPV16阳性)、HeLa(HPV18阳性)的细胞凋亡效应。成功构建三种不同组合形式的免疫亲和毒素,各免疫亲和毒素空间结构符合理论预测,且理化特性趋于一致;融合于Z_(HPV16-18E7)中间和C-端的两种免疫亲和毒素组合形式可在原核表达体系中表达出预期目的蛋白;制备的免疫亲和毒素可特异性结合相应的靶蛋白,结合效价均可达到1∶5625与1∶78125之间,且可分别诱导靶细胞产生显著的细胞凋亡效应。本研究成功构建与制备了基于亲和体的免疫亲和毒素,为HPV感染宫颈癌靶向治疗研究提供了新思路。

关键词：人乳头瘤病毒 HPV16/18型 Affibody 颗粒酶B 双靶向细胞凋亡

颗粒酶B通过SRGN/NF-kappab信号通路调节类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞的增殖和炎症反应

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医学研究生学报 2022年第12期35卷 1244-1251页

作者：詹宇威林书典詹锋黄艳艳杨舟海南省人民医院(海南医学院附属海南医院)风湿免疫科海口570311

目的颗粒酶B(GZMb)在类风湿关节炎中发挥作用的机制尚不完全清楚。文章主要研究GZMb对类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞(RA-FLSs)的增殖和炎症的影响及其潜在的机制。方法采用RT-qPCR和Western blot检测RA-FLSs细胞中GZMb的表达,构建... 详细信息

目的颗粒酶B(GZMb)在类风湿关节炎中发挥作用的机制尚不完全清楚。文章主要研究GZMb对类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞(RA-FLSs)的增殖和炎症的影响及其潜在的机制。方法采用RT-qPCR和Western blot检测RA-FLSs细胞中GZMb的表达,构建GZMb以及丝甘蛋白聚糖(serglycin;SRGN)过表达载体(oe-GZMb;oe-SRGN)和GZMb干扰质粒(si-GZMb)并转染到RA-FLSs中,RT-qPCR和Western blot检测过表达和干扰效率。CCK-8实验以及EdU检测细胞增殖水平。使用ELISA试剂盒检测炎性因子IL-6、IL-8和IL-1β的表达水平。免疫共沉淀(CO-IP)实验检测GZMb和SRGN之间的相互作用。Western blot检测NF-kappab信号通路相关蛋白表达水平。结果与正常人的滑膜细胞(NC-FLSs)相比,GZMb在RA-FLSs细胞中表达上调(Pb能促进RA-FLSs的增殖和炎症反应(Pb则显著抑制RA-FLSs的增殖和炎症反应(Pblot检测显示,与NC-FLSs相比,SRGN在RA-FLSs细胞中高表达(Pb能够与SRGN结合(Pb敲除对RA-FLSs的增殖和炎症反应的抑制作用(Pb敲除对NF-kappab信号通路相关蛋白(GZMb、SRGN、P65、p-P65和P50)的抑制作用(Pb能促进RA-FLSs的增殖和炎症反应,此外,GZMb能和SRGN互相作用并通过NF-kappab信号通路调节RA-FLSs的增殖和炎症反应。

关键词：类风湿关节炎颗粒酶B 丝甘蛋白聚糖细胞增殖炎症反应

NK92细胞经非溶酶体途径快速生成并释放35kD颗粒酶B至靶细胞

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细胞与分子免疫学杂志 2016年第2期32卷 205-211页

作者：汪蕾江绍伟肖凌陈琳李安政郑芳湖北中医药大学检验学院湖北武汉430065 华中科技大学同济医学院免疫学系湖北武汉430030

目的探讨NK92细胞能否经非分泌型溶酶体途径分泌颗粒酶B(GZb)以及其可能的分泌机制。方法 NK92细胞作为细胞模型,经佛波酯(PMA)和离子霉素(ION)活化后4 h内,采用免疫荧光染色和胶体金标记免疫电镜技术检测NK92细胞胞质中蛋白合成功能被... 详细信息

目的探讨NK92细胞能否经非分泌型溶酶体途径分泌颗粒酶B(GZb)以及其可能的分泌机制。方法 NK92细胞作为细胞模型,经佛波酯(PMA)和离子霉素(ION)活化后4 h内,采用免疫荧光染色和胶体金标记免疫电镜技术检测NK92细胞胞质中蛋白合成功能被抑制前后相对分子质量(M_r)35 000和32 000 GZb的含量及其分布情况;采用Western blot法检测分离纯化分泌型溶酶体(SL)及不含溶酶体胞质中的GZb种类;通过EDTA抑制溶酶体的胞吐来阻断M_r32 000 GZb的释放,观察活化后NK92细胞上清中的M_r35 000 GZb含量;将活化的NK92细胞与K562细胞共培养,观察M_r35 000 GZb能否进入K562细胞;观察活化后NK92细胞的死亡率,并检测其分泌M_r35 000 GZb的酶活性。结果 NK92细胞PMA/ION刺激4 h后,在SL外的胞质中生成大量GZb,M_r为35 000区别于SL内GZb的M_r32 000。经免疫电镜和免疫荧光染色进一步显示,这些GZb位于溶酶体外的小囊泡内。同时,M_r35 000 GZb能被分泌至细胞外。进一步检测发现受到刺激的NK92细胞在SL外的胞质中同时出现GZb/丝氨酸蛋白酶抑制剂9(serpinb9)复合物以及M_r35 000 GZb,但死亡率未上升,与之相应的是SL内的GZb具有酶活性,SL外的M_r35 000 GZb为酶原形式,表明M_r35 000 GZb并非由SL漏出。结论人NK细胞内存在SL外无酶活性的M_r35 000 GZb,以非溶酶体途径快速生成方式分泌至细胞外,提供了部分细胞外的GZb。

关键词：颗粒酶B NK92细胞分泌型溶酶体细胞凋亡

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颗粒酶B在胃癌组织的表达及其临床意义

中华实验外科杂志 2023年第8期40卷 1597-1602页

作者：王灿铭于鹏程郑源思胡灿徐志远浙江省肿瘤医院病理科中国科学院杭州医学研究所杭州310022 浙江省金华市中心医院结直肠肛门外科金华321099 浙江省肿瘤医院胃外科中国科学院杭州医学研究所杭州310022

目的基于对研究组早期测序数据的分析, 通过免疫组织化学和苏木精-伊红(HE)染色观察颗粒酶B(Grb)在胃癌组织中的表达。探讨Grb的表达与免疫标志物的相关性。方法分析2013年1月至2017年12月在机构评审委员会批准的浙江省肿瘤医院确诊的15... 详细信息

目的基于对研究组早期测序数据的分析, 通过免疫组织化学和苏木精-伊红(HE)染色观察颗粒酶B(Grb)在胃癌组织中的表达。探讨Grb的表达与免疫标志物的相关性。方法分析2013年1月至2017年12月在机构评审委员会批准的浙江省肿瘤医院确诊的153例胃癌患者的临床和病理资料。使用SPSS 22.0(IbM)和GraphPad Prism 9进行统计和数据分析。生存资料的分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验。采用免疫组织化学和HE染色方法, 检测Grb在胃癌患者肿瘤组织和配对癌旁组织中的表达, 并进一步分析GC患者肿瘤组织中Grb表达水平与CD3、CD4、CD8的相关性。结果 153例患者中, 男108例, 女45例。诊断时的中位年龄为61岁(范围:28~86岁)。胃肿瘤以腺癌为主。Kaplan-Meier生存曲线显示, 5年生存率为46.1%。此外, 胃癌患者肿瘤组织中Grb高表达的5年生存率分别为51.7%和35.9%。胃癌患者癌旁组织中Grb高表达和低表达率分别为41.4%和49.0%。与癌旁组织比较, 肿瘤组织中Grb的表达明显增加, 差异有统计学意义(χ2=19.895, Pb高表达组和低表达组的表达差异有统计学意义(Z=2.622, Pb高表达组和低表达组的表达差异有统计学意义(Z=2.186, Pb可能在免疫细胞浸润中发挥重要作用。

关键词：胃癌颗粒酶B 预后免疫浸润

乳腺癌患者外周血中颗粒酶B和穿孔素的表达及意义

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实用医学杂志 2023年第22期39卷 2872-2877页

作者：庄赵为袁武梅任作东李上飞陈明贵曾妍石河子大学医学院新疆地方与民族高发病教育部重点实验室新疆石河子832002 广东医科大学附属湛江中心医院精准医学检验实验室广东湛江524037

目的分析乳腺癌患者外周血T淋巴细胞及NK细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达对乳腺癌的诊断价值,明确颗粒酶B和穿孔素的表达与乳腺癌分子分型、肿瘤分期等临床病理特征的相关性及其对乳腺癌治疗效果的评价。方法应用流式细胞术检测108例乳腺癌... 详细信息

目的分析乳腺癌患者外周血T淋巴细胞及NK细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达对乳腺癌的诊断价值,明确颗粒酶B和穿孔素的表达与乳腺癌分子分型、肿瘤分期等临床病理特征的相关性及其对乳腺癌治疗效果的评价。方法应用流式细胞术检测108例乳腺癌和70例乳腺良性疾病患者样本中CD3^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞及NK细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达;采用受试者工作特征(ROC)曲线评估各指标对乳腺癌的诊断效能,比较不同临床病理特征乳腺癌患者颗粒酶B和穿孔素的表达及治疗前后各指标的变化。结果乳腺癌患者T淋巴细胞亚群与NK细胞中颗粒酶B和穿孔素表达均高于对照组,差异均有统计学意义(P颗粒酶B和穿孔素阳性率的曲线下面积(AUC)大于0.5。CD3^(+)T细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达与乳腺癌肿瘤大小及临床分期呈正相关(P颗粒酶B也与乳腺癌肿瘤大小及临床分期呈正相关(P颗粒酶B和穿孔素表达明显高于无淋巴结转移组(P颗粒酶B和穿孔素表达高于治疗前(P颗粒酶B及穿孔素的表达对于诊断乳腺癌有一定的参考价值,且与肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期有关,可辅助临床上乳腺癌的早期筛查、诊断及治疗效果评价。

关键词：乳腺癌 T淋巴细胞 NK细胞颗粒酶B 穿孔素分子分型

分泌颗粒酶B的调节性b细胞在器官移植术后免疫调节作用的研究进展

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器官移植 2019年第6期10卷 724-726,734页

作者：刘子希李先亮贺强朱继巧首都医科大学附属北京朝阳医院肝胆胰脾外科

器官移植术后的排斥反应以及长期使用免疫抑制所致的代谢性疾病、肾功能不全、感染、肿瘤复发等并发症,严重影响着受者的长期生存和生活质量。因此,诱导器官移植术后免疫耐受是移植科医师所追求的最终目标。目前研究发现,调节性b细胞(br... 详细信息

器官移植术后的排斥反应以及长期使用免疫抑制所致的代谢性疾病、肾功能不全、感染、肿瘤复发等并发症,严重影响着受者的长期生存和生活质量。因此,诱导器官移植术后免疫耐受是移植科医师所追求的最终目标。目前研究发现,调节性b细胞(breg)在移植术后免疫耐受的形成中发挥了重要作用。本文主要从分泌颗粒酶B(Grb)的breg(Grb^+breg)的发现和特点、Grb发挥免疫调节作用的方式、Grb^+breg在器官移植术后的免疫调节作用以及常用免疫抑制剂对Grb^+breg的作用进行文献综述。

关键词：器官移植免疫耐受颗粒酶B 调节性b细胞调节性T细胞免疫调节围手术期管理免疫抑制剂病毒肿瘤

血清颗粒酶B预测中晚期肝细胞癌的靶向药物联合PD-1抑制剂疗效的研究

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血清颗粒酶B预测中晚期肝细胞癌的靶向药物联合PD-1抑制剂疗效的...

作者：徐尚尚右江民族医学院

学位级别：硕士

目的:探讨血清颗粒酶B在预测中晚期肝细胞癌的靶向药物联合程序性死亡受体1(programmed death-1,PD-1)抑制剂疗效的预测价值。方法:(1)通过对2020年12月1日至2022年12月3日广西壮族自治区人民医院肝胆胰脾外科收治的中晚期肝细胞癌患者... 详细信息

目的:探讨血清颗粒酶B在预测中晚期肝细胞癌的靶向药物联合程序性死亡受体1(programmed death-1,PD-1)抑制剂疗效的预测价值。方法:(1)通过对2020年12月1日至2022年12月3日广西壮族自治区人民医院肝胆胰脾外科收治的中晚期肝细胞癌患者共50例,经纳入标准及排除标准筛选后,共37例病例符合标准纳入研究,其中男性患者33例,女性患者4例,首次靶向药物联合PD-1抑制剂治疗后9-12周(相当于第3个疗程之后,第4个疗程之间)为观察终点,根据改良实体瘤疗效评估标准(modified response evaluation criteria in solid tumors,m RECIST),判定靶向药物联合PD-1抑制剂对中晚期肝细胞癌短期内的早期疗效。抽取患者用药前的血清,通过Elisa检测方法测定各病例的血清颗粒酶B浓度;(2)将中晚期肝细胞癌患者用药前外周血中血清颗粒酶B的水平、病人临床特征与疗效进行单因素分析及多因素相关分析;(3)采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)曲线分析用药前血清颗粒酶B在预测中晚期肝细胞癌的靶向药物联合PD-1抑制剂疗效的价值。结果:(1)此次研究共纳入37例患者,在首次靶向药物联合PD-1抑制剂治疗后9-12周(相当于第3个疗程之后,第4个疗程之间)后判定目标肿瘤治疗效果:疾病控制17例,疾病进展20例;总疾病控制率(disease control rate,DCR)为45.95%。分析患者用药前血清颗粒酶B浓度与治疗效果有相关性,结果显示:用药前患者外周血血清颗粒酶浓度越高,中晚期肝癌患者接受靶向药物联合PD-1抑制剂治疗获得缓解的可能性越大(P颗粒酶B浓度的最佳截断值为0.110pg/ml。此时曲线下面积为0.707,预测疗效的敏感性和特异度分别可达88.9%和78.9%;(2)将患者不同用药前血清颗粒酶B浓度分组进行单因素分析提示:血管侵犯及甲胎蛋白值是用药前的血清颗粒酶B浓度负向影响因素(P颗粒酶B浓度进行单因素分析提示:联合介入治疗、血管侵犯、用药前血清颗粒酶B浓度、甲胎蛋白是中晚期肝细胞癌的靶向药物联合PD-1抑制剂治疗效果的影响因素,将单因素分析中有意义的变量纳入二元Logistic回归分析提示:血管侵犯是中晚期肝细胞癌的靶向药物联合PD-1抑制剂治疗效果的独立危险因素;用药前血清颗粒酶B浓度是中晚期肝细胞癌的靶向药物联合PD-1抑制剂治疗效果的独立保护因素(P颗粒酶B浓度对中晚期肝细胞癌的靶向药物联合PD-1抑制剂治疗效果具有一定的预测价值,当用药前血清颗粒酶B浓度大于0.110pg/ml时,患者的预后可能更好;(2)本研究发现血管侵犯是中晚期肝细胞癌的靶向药物联合PD-1抑制剂治疗效果的独立危险因素,用药前血清颗粒酶B浓度是中晚期肝细胞癌的靶向药物联合PD-1抑制剂治疗效果的独立保护因素。

关键词：颗粒酶B 中晚期肝细胞癌靶向治疗免疫治疗治疗效果

ESAT-6及CFP-10刺激颗粒酶B在儿童结核诊断中的价值

同方学位论文库评论

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实用医学杂志 2021年第5期37卷 660-665页

作者：孙娜姚聪沈芯王军袁纯辉向贇华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院武汉430016 湖北中医药大学武汉430065

目的探究结核特异性抗原ESAT-6/CFP-10刺激外周血单个核细胞后颗粒酶B(Grb)水平对儿童活动性结核(ATb)的诊断价值。方法选取2019年1-8月武汉市金银潭医院和武汉儿童医院86例儿童,[ATb 26例、结核潜伏感染(LTbI)20例、非结核病对照(Non-T... 详细信息

目的探究结核特异性抗原ESAT-6/CFP-10刺激外周血单个核细胞后颗粒酶B(Grb)水平对儿童活动性结核(ATb)的诊断价值。方法选取2019年1-8月武汉市金银潭医院和武汉儿童医院86例儿童,[ATb 26例、结核潜伏感染(LTbI)20例、非结核病对照(Non-Tb)20例,健康对照(HC)20例],ELISA检测ESAT-6/CFP-10刺激外周血单个核细胞后Grb水平,流式细胞术检测表达Grb和干扰素-γ(IFN-γ)的CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞比例。结果ESAT-6/CFP-10刺激后结核组特异性Grb较对照组显著升高(PbI组显著高于ATb组(Pb。结论结核特异性Grb对儿童活动性结核的鉴别诊断可能具有重要价值。

关键词：颗粒酶B 活动性结核 ROC曲线 ESAT-6 CFP-10

颗粒酶B激活TGF-β1/Smad3通路促进博来霉素导致的肺纤维化

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中华肺部疾病杂志:电子版 2023年第5期16卷 630-634页

作者：陈向军顾兴王在强王光辉王莉方芳金发光王瑞璇西安市胸科医院重症医学二科西安710100 西安市胸科医院呼吸与危重症医学科西安710100 空军军医大学第二附属医院呼吸与危重症医学科西安710038

目的分析颗粒酶B在博来霉素导致大鼠肺纤维化中的作用。方法将21只SD大鼠随机分为三组:对照组、模型组、干预组,每组7只。模型组和干预组采用经气管内注入博来霉素(5 mg/kg)诱导大鼠肺纤维化动物模型。干预组在造模前1 h、造模第7天、... 详细信息

目的分析颗粒酶B在博来霉素导致大鼠肺纤维化中的作用。方法将21只SD大鼠随机分为三组:对照组、模型组、干预组,每组7只。模型组和干预组采用经气管内注入博来霉素(5 mg/kg)诱导大鼠肺纤维化动物模型。干预组在造模前1 h、造模第7天、第14天和第21天经尾静脉注射颗粒酶B抑制剂,其它两组经尾静脉注射等体积生理盐水,其余操作相同。28 d后处死大鼠取出肺脏,采用免疫荧光和Western blot检测颗粒酶B、胶原蛋白I、转化生长因子β1(transforming growth factorβ1)和Smad3蛋白表达情况,采用Masson染色检测肺组织纤维化情况。结果模型组较对照组大鼠肺组织胶原蛋白Ⅰ表达上调,胶原蛋白沉积增加,肺纤维化加重。干预组较模型组胶原蛋白Ⅰ表达下调,胶原蛋白沉积减少,肺纤维化减轻。模型组较对照组大鼠肺组织TGF-β1和Smad3蛋白表达增加,干预组较模型组TGF-β1和Smad3蛋白表达降低。结论颗粒酶B促进了博来霉素导致的大鼠肺纤维化,机制可能与激活TGF-β1/Smad3信号通路有关。

关键词：肺纤维化颗粒酶B 转化生长因子β1 Smad3