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颗粒酶a诱导Caspases非依赖性细胞死亡

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细胞生物学杂志 2004年第6期26卷 571-574页

作者：缪家文李芳秋南京军区南京总医院全军医学检验中心南京大学医学院临床学院南京210002

颗粒酶a(granzyme A,GzmA),是存在于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和天然杀伤细胞(NK细胞)的细胞毒颗粒中含量最多的一种丝氨酸蛋白酶,在穿孔素(perforin)协同作用下通过颗粒胞吐(granule exocytosis)释放进入在杀伤细胞和靶细胞之间形成的免... 详细信息

颗粒酶a(granzyme A,GzmA),是存在于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和天然杀伤细胞(NK细胞)的细胞毒颗粒中含量最多的一种丝氨酸蛋白酶,在穿孔素(perforin)协同作用下通过颗粒胞吐(granule exocytosis)释放进入在杀伤细胞和靶细胞之间形成的免疫突触(immunological synapse),然后进入靶细胞的细胞浆,并在细胞核聚集,诱导一种caspases非依赖性细胞死亡。GzmA靶向作用于一种与内质网结合的特殊的复合体——SET复合体,其包含3种GzmA底物:核小体装配蛋白SET、DNA结合蛋白HMG-2、具有碱基切除修复作用的核酸内切酶Apel。SET复合体还含有一种抑癌蛋白pp32和一种具有脱氧核糖核酸酶(DNase)活性的NM23-H1。当GzmA作用于SET复合体时释放出NM23-H1并激活其DNase活性,也阻断了Apel对DNA损伤的修复作用,在DNA上形成单链的缺刻。这是一种新发现的由GzmA诱导的细胞凋亡途径。

关键词：颗粒酶a Caspases非依赖性细胞死亡丝氨酸蛋白酶 SET复合体细胞凋亡免疫效应分子

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人颗粒酶a全长基因的克隆及原核表达

中国生物制品学杂志 2012年第2期25卷 168-170,175页

作者：杜佳妮陈磊龙凤英江文正华东师范大学生命科学学院上海200062

目的克隆人颗粒酶a(Granzyme A,GzmA)基因,在大肠杆菌中进行表达,并初步优化表达条件。方法通过RT-PCR扩增人GzmA基因,插入原核表达载体pET24a(+)中,构建重组表达质粒pET24a-GzmA,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAG... 详细信息

目的克隆人颗粒酶a(Granzyme A,GzmA)基因,在大肠杆菌中进行表达,并初步优化表达条件。方法通过RT-PCR扩增人GzmA基因,插入原核表达载体pET24a(+)中,构建重组表达质粒pET24a-GzmA,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,并对诱导温度、IPTG浓度、诱导时间和开始诱导时菌液A600值进行优化。结果重组表达质粒pET24a-GzmA经双酶切和测序,证实GzmA基因已正确插入载体中,且序列正确;表达的重组蛋白相对分子质量约29 000,且可与小鼠抗His单抗特异性结合;工程菌的最佳诱导温度为37℃,IPTG浓度、诱导时间和开始诱导时菌液A600值对重组蛋白的表达量影响较小。结论成功克隆了人GzmA基因,并在大肠杆菌中进行了表达。

关键词：颗粒酶a 克隆分子原核细胞基因表达

鸡颗粒酶、颗粒溶素的原核表达及生物学特性分析

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鸡颗粒酶、颗粒溶素的原核表达及生物学特性分析

作者：袁如意中国农业科学院

学位级别：硕士

颗粒溶素(Granulysin,GNLY)和颗粒酶(Granzyme,Gzm)都是由细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocypes,CTLs)和自然杀伤(nature killer,NK)细胞合成分泌的天然免疫分子。前者在人类具有9和15 kD两种形式,9 kD颗粒溶素可直接溶解病原菌... 详细信息

颗粒溶素(Granulysin,GNLY)和颗粒酶(Granzyme,Gzm)都是由细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocypes,CTLs)和自然杀伤(nature killer,NK)细胞合成分泌的天然免疫分子。前者在人类具有9和15 kD两种形式,9 kD颗粒溶素可直接溶解病原菌和多种寄生原虫及肿瘤细胞;后者是一类丝氨酸蛋白酶(Serine protease),可在GNLY和/或穿孔素(perforin)协同下进入被病原体感染的靶细胞和肿瘤细胞,诱导caspase非依赖性/依赖性的凋亡机制而杀死/清除被感染细胞和肿瘤细胞。基因组数据库分析表明,鸡具有编码GNLY和Gzms的基因。为研究二者在抗球虫天然免疫中的作用,本研究克隆和重组表达了鸡的颗粒溶素及颗粒酶a、K,并对颗粒溶素的活性分析方法、颗粒酶的酶动力学特征等进行了初步研究。主要研究内容和结果如下:1.PCR克隆得到了ChGzmA和ChGzm K基因的成熟编码序列,并通过生物信息软件对ChGzmA和ChGzmK序列进行了初步分析。测序结果显示克隆的ChGzmA基因长783 bp,编码260个氨基酸,分子量大小约为26 kD;克隆的ChGzmK基因长789 bp,编码262个氨基酸,分子量大小约为27 kD。构建了pET26b-ChGzmA和pET26b-ChGzmK原核表达载体,并将重组质粒转化入表达菌BL21(DE3)中,经由终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导后,成功获得了pET26b-ChGzmA和pET26b-ChGzmK融合蛋白的可溶性表达。纯化后进行酶动力学分析,结果表明ChGzmA可水解Suc-VANR-pNA,其K=0.0250±0.00086μM,V=122.96±8.49μM/min/μg;ChGzmK可水解Ac-YRFK-pNA,其K=0.0083±0.00061μM,V=22.225±5.3832μM/min/μg;ChGzmA和ChGzmK的活性均可被D-Phe-Pro-Arg-CMK抑制,IC值分别为16.62±1.0629μM和25.464±1.7731μM。2.采用实时定量PCR检测并以相对定量法计算GzmA、GzmK、GzmM和GzmG-like的mRNA在球虫感染后鸡盲肠扁桃体中不同时期转录量的差值,并选取鸡GAPDH作为内参基因。结果显示,未感染球虫组、一次感染球虫组和二次感染球虫组鸡盲肠扁桃体中4种颗粒酶的mRNA转录量没有显著差异。3.用SMART在线工具对鸡颗粒溶素编码基因进行结构域预测,PCR克隆得到了ChGNLY的成熟编码序列,并通过生物信息软件对ChGNLY序列进行了初步分析。测序结果显示克隆的ChGNLY基因长240 bp,编码79个氨基酸,分子量大小约为36 kD。构建pGEX-6p-1-ChGNLY原核表达载体,并将重组质粒转化入表达菌BL21中,经由终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导后,成功获得了ChGNLY融合蛋白的可溶性表达。纯化后利用CellTiter-Glo2.0 Assay检测ChGNLY的生物学活性,结果表明rChGNLY对MDBK细胞具有细胞毒性,且该细胞毒性呈剂量依赖性。这些初步结果为进一步研究颗粒酶的抗球虫杀伤机理奠定实验基础。

关键词：颗粒酶a 颗粒酶K 颗粒溶素蛋白表达活性

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颗粒酶a在肿瘤细胞中的表达分析

生物化工 2021年第2期7卷 113-116页

作者：张涛中国药科大学生命科学与技术学院江苏南京211198

颗粒酶a属于丝氨酸蛋白酶家族,主要表达于淋巴细胞,具有细胞毒性作用和促炎作用,部分肿瘤细胞中也微量表达颗粒酶。本文综合了多种颗粒酶在肿瘤细胞中的表达以及颗粒酶a的相关研究,主要讨论了颗粒酶a在肿瘤细胞表达的可能性以及其加工... 详细信息

颗粒酶a属于丝氨酸蛋白酶家族,主要表达于淋巴细胞,具有细胞毒性作用和促炎作用,部分肿瘤细胞中也微量表达颗粒酶。本文综合了多种颗粒酶在肿瘤细胞中的表达以及颗粒酶a的相关研究,主要讨论了颗粒酶a在肿瘤细胞表达的可能性以及其加工激活和抑制机制。另外,根据已知颗粒酶a的底物及其功能,对肿瘤细胞中表达的颗粒酶a的生理功能进行了合理的推测,并认为颗粒酶a在肿瘤细胞的微量表达可能影响肿瘤细胞的迁移、基因表达以及促进肿瘤逃逸等。

关键词：颗粒酶a 肿瘤细胞表达功能

颗粒酶a诱导一种新奇的caspases非依赖性细胞死亡

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颗粒酶A诱导一种新奇的caspases非依赖性细胞死亡

第6次全国微生物学与免疫学大会

作者：缪家文李芳秋南京大学医学院临床学院南京军区南京总医院全军医学检验中心

颗粒酶a(granzyme A,GzmA),是存在于细胞毒T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)细胞浆中的一种丝氨酸蛋白酶,在穿孔素协(perforin)同作用下通过颗粒胞吐(granule exocytosis)诱导一种caspases非依赖性细胞死亡。GzmA靶向作用于一种与内质... 详细信息

颗粒酶a(granzyme A,GzmA),是存在于细胞毒T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)细胞浆中的一种丝氨酸蛋白酶,在穿孔素协(perforin)同作用下通过颗粒胞吐(granule exocytosis)诱导一种caspases非依赖性细胞死亡。GzmA靶向作用于一种与内质网结合的特殊的复合体——SET复合体,其包含3种GzmA底物:核小体装配蛋白SET、DNA结合蛋白HMG-2、具有碱基切除修复作用的核酸内切酶Ape1。SET复合体还含有一种抑癌蛋白pp32和一种具有脱氧核糖核酸酶(DNase)活性的NM23-H1。当GzmA作用于SET复合体时释放出NM23-H1并激活其DNase活性,也阻断了Apel对DNA损伤的修复作用,在DNA上形成单链的缺刻。这是一种新发现的由GzmA诱导的细胞凋亡途径。活化的CTL和NK细胞在清除病毒感染细胞和肿瘤细胞中发挥关键作用。尽管CTL和NK细胞通过截然不同的机制识别靶细胞,它们最终都通过两种途径导致细胞死亡,一种是通过颗粒胞吐释放细胞毒颗粒的内容物;另一种是通过细胞表面死亡受体,如肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员,包括FAS (CD95)。细胞毒颗粒中包含穿孔素、颗粒溶素(granulysin)和具有丝氨酸蛋白酶活性的颗粒酶家族(granzymes,Gzm)。Gzm家族有多个成员,到目前为止,发现人类至少存在5种颗粒酶,包括Gzm A,Gzm B,Gzm H,Gzm M和Gzm K。其中Gzm A和Gzm B是CTL和NK细胞中最重要的颗粒酶,在穿孔素协同作用下通过颗粒胞吐进入靶细胞的细胞浆,在细胞核聚集,能够独立地或相互协同作用诱导细胞死亡。最近研究结果表明,Gzm A通过另外一种caspases非依赖性机制诱导细胞死亡,导致DNA形成单链缺刻损伤,不同于Gzm B导致的DNA双链寡核苷酸片段化。本文对Gzm A最新研究进展作一综述。

关键词：颗粒酶a SET复合体细胞死亡

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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颗粒酶a在肿瘤免疫中的功能研究

科学技术创新 2020年第9期 14-15页

作者：顾亚茹郭长缨中国药科大学生命科学与技术学院江苏南京211198

颗粒酶a(Granzyme A,Gzm A)是一类定位于活化淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞胞质的丝氨酸蛋白酶,是细胞毒性颗粒中表达丰度最高的蛋白酶之一。Gzm A能够特异性靶向人体很多重要的蛋白,如:组蛋白,维持核膜的核纤层蛋白和几种关键的DNA损伤... 详细信息

颗粒酶a(Granzyme A,Gzm A)是一类定位于活化淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞胞质的丝氨酸蛋白酶,是细胞毒性颗粒中表达丰度最高的蛋白酶之一。Gzm A能够特异性靶向人体很多重要的蛋白,如:组蛋白,维持核膜的核纤层蛋白和几种关键的DNA损伤修复蛋白(Ku70,PARP-1);激活白细胞介素-1,具有促炎活性。Gzm A激活了一种新的程序性细胞死亡途径,该途径始于线粒体,产生活性氧(ROS),导致单链DNA损伤,参与杀死敏感的靶细胞。此外,还可作为免疫检查点以及生物标志物。本文主要就Gzm A晶体结构、特异性结合蛋白种类以及在肿瘤免疫中发挥的重要功能进行综述。

关键词：颗粒酶a 促炎肿瘤免疫晶体结构

SET复合物在颗粒酶a触发的细胞凋亡中的作用

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口腔医学 2008年第9期28卷 494-495页

作者：杨菲陈万涛上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔医学院口腔颌面外科上海市口腔医学研究所.上海市口腔医学重点实验室上海200011

颗粒酶a(GranzymeA,GzmA)引发肿瘤细胞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific proteinases,cas-pase)非依赖的细胞凋亡,随着SET复合物(SET complex)组成的确定,该凋亡通路的分子机制研究得以不断深入,本文就SET复... 详细信息

关键词： SET复合物 NM23-H1 颗粒酶a caspase非依赖的细胞凋亡

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鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的免疫效力评价

鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的免疫效力评价

作者：崔健内蒙古农业大学

学位级别：硕士

目的:自2010年鸭坦布苏病毒病暴发以来,给水禽产业带来严重危害。该病主要侵害鸭和鹅的生殖和免疫器官,能引起产蛋鸭和鹅产蛋率迅速下降以及精神沉郁、共济失调、瘫痪等神经症状。该病不仅能通过蚊媒传播,也可通过气溶胶和粪口途径传播... 详细信息

目的:自2010年鸭坦布苏病毒病暴发以来,给水禽产业带来严重危害。该病主要侵害鸭和鹅的生殖和免疫器官,能引起产蛋鸭和鹅产蛋率迅速下降以及精神沉郁、共济失调、瘫痪等神经症状。该病不仅能通过蚊媒传播,也可通过气溶胶和粪口途径传播,其感染宿主范围广泛,防控难度大。目前公认最有效的防控鸭坦布苏病毒病的措施是疫苗免疫接种。本研究通过采用血清学、分子生物学、组织病理学等方法对鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的免疫效果进行多维度评价,为该疫苗防控鸭坦布苏病毒病提供数据支持。此外本研究旨在通过测定免疫组鸭与非免疫组鸭攻毒后外周血单个核细胞(PBMC)与脾脏细胞因子和颗粒酶a的相对表达量变化,从而筛选出可以潜在作为鸭坦布苏病毒病灭活疫苗免疫效力评价的免疫指标,为探索鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的免疫效力评价新方法的提供研究思路和参考数据。方法:将48只14日龄北京鸭以每组6只的分组方法随机分为8组,其中6组以0.3m L/只、0.15m L/只、0.1m L/只三种免疫剂量接种实验室自制F6、F10代鸭坦布苏病毒病灭活疫苗,另外两组为不接种疫苗的非免疫对照组与空白对照组。一次免疫后14d和二次免疫后29d采血测定各组鸭HI抗体效价;二次免疫后29d进行攻毒实验,采集各组鸭攻毒后2、3、5、7d血清、PBMC以及攻毒后5、7d鸭组织器官。取攻毒后2d鸭血清接种SPF鸡胚分离病毒并测定攻毒保护率;使用DTMUV荧光定量PCR检测方法测定攻毒后2、3、5、7d鸭血清和攻毒后5、7d免疫器官病毒载量;将采集的鸭组织脏器制成病理切片,通过HE和免疫组化染色分别观察组织病理变化和免疫器官病毒分布情况;使用荧光定量PCR相对定量法测定攻毒后鸭PBMC和脾脏中TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-α、颗粒酶a的相对表达量。结果:二次免疫后,A3免疫组抗体阳性率为66.7%,其余免疫组均为100%;二次免疫后A1～D组的HI抗体GMT值分别为1:56.57、1:40、1:15.87、1:80、1:63.50、1:56.57、颗粒,并且其脾脏在攻毒后7d仍有少量阳性抗原颗粒。免疫组鸭的免疫器官在攻毒后5、7d几乎未检测到阳性抗原颗粒;非免疫组鸭PBMC中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6的相对表达量在攻毒后2、5d显著高于免疫组(P颗粒酶a的表达量在5d时显著高于免疫组(P颗粒酶a的相对表达量在攻毒后5d显著高于免疫组(P0.05)。结论:接种两次鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的鸭可产生保护性抗体,在攻毒实验中能有效降低由DTMUV感染所引起的病毒血症和免疫器官中的病毒载量;免疫该灭活疫苗鸭的攻毒后临床症状与组织病理变化都明显轻于未免疫疫苗鸭,并且免疫器官中的病毒分布更少;该疫苗可保护鸭的正常免疫功能,能有效抵御病毒感染所引起的细胞因子风暴现象和细胞凋亡,降低因过度免疫反应而造成的机体损伤。此外,实验数据表明颗粒酶a具有作为鸭坦布苏病毒病灭活疫苗免疫效力评价指标的可行性。

关键词：鸭坦布苏病毒病灭活疫苗效力评价血清学病毒载量病理变化细胞因子颗粒酶a

GZMA-PIEZO1调控肠上皮细胞自噬对肠上皮屏障功能的影响

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GZMA-PIEZO1调控肠上皮细胞自噬对肠上皮屏障功能的影响

作者：牛荣威广州医科大学

学位级别：硕士

研究背景炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种病因不明的慢性非特异性肠道炎性疾病,主要包括克罗恩病(Crohn’s disease,CD)及溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)。近年来,我国儿童IBD的患者数量逐渐增加,已成为临床的... 详细信息

研究背景炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种病因不明的慢性非特异性肠道炎性疾病,主要包括克罗恩病(Crohn’s disease,CD)及溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)。近年来,我国儿童IBD的患者数量逐渐增加,已成为临床的常见疾病之一,但其发病机制尚不完全明了。目前的治疗方案未能从根本上解决药物治疗无效及并发症的问题,高额的治疗费也给家庭和社会带来沉重的经济和医疗负担。因此,研究IBD的发病机制,为IBD的治疗寻找新的靶点具有重要的现实意义。自噬是细胞在应激条件下发生的一种分解自身成分的代谢过程,以防止细胞损伤并促进生存,对维持细胞及机体的稳态具有重要作用。研究发现自噬参与IBD的发病过程,肠黏膜杯状细胞通过自噬调节黏液的合成和分泌,维持肠屏障功能。然而,在IBD发生发展中,肠黏膜杯状细胞的自噬作用是否参与IBD损伤修复及其调控机制尚有待研究。文献报道IBD患儿结肠颗粒酶a(Granzyme A,GZMA)表达下调,UC患者结肠GZMA表达水平与临床缓解及黏膜愈合呈正相关。课题组前期研究发现IBD患儿结肠黏膜CD8+CD39+T细胞高表达GZMA,杯状细胞高表达机械敏感离子通道1(PIEZO1)。PIEZO1通过Erk/Ca2+及ROCK1/2信号调控杯状细胞黏蛋白2(MUC2)及紧密连接蛋白Claudin-1的生成,以维持肠上皮屏障功能。因此,我们推测:IBD患儿结肠黏膜CD8+CD39+T细胞高表达GZMA,通过PIEZO1途径调控肠上皮细胞自噬,促进紧密连接蛋白的生成,维持肠上皮屏障功能。研究目的通过临床样本和体外实验,阐述肠黏膜表达GZMA,通过PIEZO1途径调控肠上皮细胞自噬,增加紧密连接蛋白产生,维持肠上皮屏障功能的作用和机制,为IBD的治疗寻找新的靶点。研究方法1、2019年6月1日至2020年12月31日于广州市妇女儿童医疗中心消化科住院治疗,排除肠道细菌、病毒、寄生虫感染,结核病和恶性肿瘤,内镜和病理学检查诊断为IBD的患儿为实验组;内镜以及病理学检查结果正常,或单个结直肠幼年息肉的患儿为对照组。经监护人签署知情同意书。2、收集IBD患儿及对照组儿童的临床资料、外周血和肠黏膜组织样本。酶联免疫吸附试验检测外周血和黏膜GZMA的表达水平;透射电镜观察肠黏膜中自噬小体表达;免疫荧光检测肠黏膜CD8、GZMA及自噬相关蛋白LC3表达;免疫荧光共定位检测结肠上皮细胞标记蛋白E-cadherin及自噬相关蛋白LC3表达。3、选择HT-29细胞和Ca CO2细胞,无血清饥饿24h后加入GZMA(500nmol/L)培养6h,免疫印迹法检测自噬相关蛋白表达;使用m RFP-GFP-LC3质粒转染肠上皮细胞,加入GZMA(500nmol/L)培养6h,荧光显微镜下观察细胞自噬流变化。4、使用慢病毒sh-PIEZO1及对照组慢病毒sh-CTL感染Ca CO2及HT-29细胞构建稳定表达株,使用免疫印迹法检测稳定表达株细胞自噬相关蛋白表达水平;将稳定表达株细胞无血清饥饿24h,加入GZMA(500nmol/L)培养6h,免疫印迹实验及q PCR检测自噬相关蛋白表达水平。5、选择HT-29细胞和Ca CO2细胞,细胞无血清饥饿6h,加入GZMA(500nmol/L)及自噬激动剂雷帕霉素培养48h,免疫荧光检测ZO-1表达。6、使用免疫印迹实验检测稳定表达株NF-κB p65表达水平;将稳定表达株无血清饥饿24 h,加入GZMA(500nmol/L)培养1h,免疫印迹实验检测NF-κB p65以及p-NF-κB p65表达水平;抑制稳定表达株细胞NF-κB p65的表达,加入GZMA(500nmol/L)培养6 h,免疫荧光及q PCR检测自噬相关蛋白表达变化。研究结果1、外周血检测结果提示,IBD患儿较对照组患儿血小板、白细胞总数明显升高,而白蛋白、血红蛋白明显降低。IBD患儿血清及肠黏膜GZMA,肠黏膜上皮细胞自噬小体及自噬相关蛋白LC3表达均显著低于对照组。2、体外实验中,加入GZMA后,肠上皮细胞自噬相关蛋白p62的表达下调,而LC3、ATG5、Beclin的表达增多;加入GZMA后,肠上皮细胞自噬小体及自噬溶酶体生成增多。3、抑制肠上皮细胞PIEZO1的表达后,自噬相关蛋白p62的表达上调,而LC3、ATG5、Beclin的表达下降;进一步加入GZMA后能够使肠上皮细胞自噬相关蛋白p62的表达降低,而LC3、ATG5、Beclin的表达增多。4、体外实验中,加入GZMA以及雷帕霉素后肠上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1表达增多。5、抑制肠上皮细胞PIEZO1的表达后NF-κB p65、p-NF-κB p65的表达增加,进一步加入GZMA刺激后可使NF-κB p65、p-NF-κB p65的表达减少。抑制肠上皮细胞NF-κB p65的表达后自噬相关蛋

关键词：颗粒酶a PIEZO1 自噬紧密连接蛋白炎症性肠病