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三维预血管化微组织中成纤维细胞促进内皮细胞出芽及迁移的研究

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中国修复重建外科杂志 2022年第7期36卷 881-888页

作者：唐珺谈金女叶朝阳周燕谭文松华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237

目的构建三维预血管化微组织,探索三维共培养体系中人成纤维细胞(human fibroblasts,HFs)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)出芽和迁移的促进作用。方法取HUVECs和HFs培养传代至3~5代进行实验。在... 详细信息

目的构建三维预血管化微组织,探索三维共培养体系中人成纤维细胞(human fibroblasts,HFs)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)出芽和迁移的促进作用。方法取HUVECs和HFs培养传代至3~5代进行实验。在二维共培养体系中,将HFs行PKH26染色且固定细胞密度后,与HUVECs以不同比例(1∶4、1∶1、4∶1)以及不同接种方式(两种细胞间隔48 h顺序接种、直接混合接种)共培养,荧光显微镜下观察血管网络形成情况。构建三维共培养体系,通过慢病毒转染分别用绿色和红色荧光蛋白标记HUVECs和HFs,将标记细胞接种于多孔微载体上,采用转瓶动态培养,分别制备HF微组织、HUVEC微组织、HF-EC微组织和HF&EC微组织;低渗结晶紫染色法观测微组织中细胞生长情况。将各微组织包埋于纤维蛋白凝胶中,激光共聚焦显微镜下观察HF微组织和HUVEC微组织中细胞生长贴附情况,4种微组织出芽情况以及HF-EC微组织、HF&EC微组织芽体细胞组成、出芽数量及芽体长度。制备HFs条件培养基,观察其对HUVEC微组织出芽的影响,以正常培养基培养作为对照。结果二维共培养时HFs预培养有助于血管网状结构形成与稳定,且当两种细胞比例为1∶1时效果最佳。三维共培养时各微组织上细胞生长良好,HUVEC微组织无出芽,HF微组织、HF-EC微组织、HF&EC微组织均能出芽,具备良好血管化能力。HF-EC微组织芽体长度及出芽数目均优于HF&EC微组织(P预血管化微组织,且在三维共培养中HFs能够引导和促进HUVECs出芽及迁移。

关键词：组织工程微组织预血管化转瓶动态培养三维共培养

氧化石墨烯预血管化组织工程室的构建及其肠壁缺损修复应用研究

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氧化石墨烯预血管化组织工程室的构建及其肠壁缺损修复应用研究

作者：沈琛涛华中科技大学

学位级别：硕士

背景:小肠作为消化和吸收营养物质的重要器官,常常会因为各种原因造成小肠吸收面积大部分减少而引起一系列症状,如外伤、炎性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)、肠系膜血管栓塞、小肠广泛切除等。对于小肠广泛缺损,传统的治疗方法... 详细信息

背景:小肠作为消化和吸收营养物质的重要器官,常常会因为各种原因造成小肠吸收面积大部分减少而引起一系列症状,如外伤、炎性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)、肠系膜血管栓塞、小肠广泛切除等。对于小肠广泛缺损,传统的治疗方法为全胃肠外营养支持(Total Parenteral Nutrition,TPN)及小肠移植。长期的TPN治疗容易导致感染、肝纤维化和电解质紊乱等并发症。小肠移植则面临着供体稀少、移植排斥及终身的免疫抑制治疗等困境。小肠组织工程能够通过自体细胞培养获得组织工程小肠,替换损伤、失去功能的小肠,增加吸收面积,从而对小肠大部缺损进行治疗,并降低小肠移植对供体的需求,避免术后排斥现象的出现及进行终身免疫抑制治疗。目的:成功的小肠组织工程需要生物材料支架来支持细胞粘附与细胞外基质的产生,以及血管网来提供营养、氧气和清除代谢废物。血管化组织工程室作为体内生物反应器,能够提供一个独立的血管化微环境,从而刺激组织再生。明胶(Gelatin,Gel)是胶原蛋白的衍生物,具有优异的生物降解性、非抗原性和成本效益等优点。氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)是石墨烯的含氧衍生物。凭借自身优越的特性,它能够提高生物材料的力学性能。因此,本研究假设利用GO和Gel能够制备一种具有良好的力学强度和生物相容性的生物支架,并用于构建小肠组织工程室。同时探讨预血管化组织工程室的构建以及肠壁缺损修复的有效应用,为开展更深入的小肠组织工程奠定基础。方法:本研究首先利用静电纺丝技术制备含有不同浓度GO(0.25、0.5、0.75%w/v)的明胶支架(GO-Gel),并鉴定其理化性质和体外生物相容性,从而筛选出最佳GO浓度用于构建具有良好机械强度和生物相容性的GO-Gel生物支架,并进行后续实验。在此基础之上,将GO-Gel生物支架移植于肠系膜血管上,经过4周的血管化培养,获得预血管化的GO-Gel组织工程室(Pre-Vascularized GO-Gel,V-GO-Gel)。最后,研究建立大鼠肠壁缺损模型并应用V-GO-Gel修复。本研究利用扫描电镜、拉曼光谱、弹性模量检测等对支架的理化性质进行表征。通过细胞在支架上的粘附、增殖和生长检测支架的体外生物相容性,根据免疫组化结果评价支架的体内血管程度。以非血管化的单纯Gel和GO-Gel支架为对照,研究V-GO-Gel的肠壁缺损修复效果。结果:通过上述方法,本研究成功制备了0.25%GO-Gel纳米支架。在10%形变范围内,该纳米支的弹性模量是单纯Gel支架的1.5倍,具有良好的机械强度。该支架培养的细胞粘附好、形态佳、增殖快,并能够成功构建具有丰富血管网络的组织工程室。在大鼠肠壁缺损修复模型中,V-GO-Gel组未出现死亡和并发症,且相较于单纯Gel组缺损修复更快,CD31染色结果提示血管生成更多,CD206染色结果提示更轻微的炎症反应。结论:具有良好的力学强度、生物相容性以及丰富血管网络的V-GO-Gel预血管化组织工程室,在大鼠肠壁缺损模型中能够促进肠壁缺损修复,因此为开展更深入的小肠组织工程奠定基础。

关键词：预血管化静电纺丝氧化石墨烯明胶肠壁缺损

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预血管化组织工程骨体外构建策略

医学综述 2022年第8期28卷 1474-1479页

作者：王建叶岑雪甄平樊博甘肃中医药大学第一临床医学院兰州730000 联勤保障部队第九四〇医院骨科中心兰州730050 中日友好医院重症医学科北京100029

临界尺寸骨缺损的修复具有极大的挑战性。骨组织工程作为骨缺损修复的一种新兴方法存在血管化不足的问题。传统组织工程骨移植物植入缺损后常由于缺乏快速充足的血液供应而坏死。因此,有必要预先在工程骨组织内部构建一个功能性微血管网... 详细信息

临界尺寸骨缺损的修复具有极大的挑战性。骨组织工程作为骨缺损修复的一种新兴方法存在血管化不足的问题。传统组织工程骨移植物植入缺损后常由于缺乏快速充足的血液供应而坏死。因此,有必要预先在工程骨组织内部构建一个功能性微血管网,该血管网可以在骨移植物植入后通过与宿主血管系统快速吻合来实现工程骨组织快速血液供应。细胞共培养、球体、细胞膜片以及3D打印是体外构建预血管化组织工程骨的常用方法。这些预血管化方法促进了组织工程骨植入后的成活率,为临界尺寸骨缺损的修复带来了新的思路。

关键词：骨组织工程预血管化共培养球体细胞膜片 3D打印

聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物网管支架体外预血管化及体内植入的实验研究

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中国修复重建外科杂志 2006年第2期20卷 181-184页

作者：吴仕和徐迎新宋旭华王金晶李荣解放军总医院普通外科研究所北京100853

目的研究预血管化对含网管的多孔可降解聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(polylacticl/glycolicacidcopolymer,PLGA)支架血管化的影响。方法将含网管的多孔可降解PLGA支架由小鼠微血管内皮细胞预血管化,分为体外预血管化组(A组)和单纯支架组(B组... 详细信息

目的研究预血管化对含网管的多孔可降解聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(polylacticl/glycolicacidcopolymer,PLGA)支架血管化的影响。方法将含网管的多孔可降解PLGA支架由小鼠微血管内皮细胞预血管化,分为体外预血管化组(A组)和单纯支架组(B组)。将两组支架植入12只雌性NIH小鼠肠系膜间,分别于术后2、4周取材,行组织学及免疫组织化学观察血管化情况,并应用图像分析软件计算支架血管化面积。结果支架体外预血管化后,其网管内可见微血管内皮细胞均匀贴壁。支架植入体内2周,切片血管化面积A组为2260.91±242.35μm2与B组823.64±81.29μm2比较,差异有统计学意义(P0.05)。植入2周支架切片肌动蛋白阳性染色面积A组为565.22±60.58μm2与B组205.91±16.25μm2比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论含网管的多孔可降解PLGA支架是一种良好的简易血管化支架模型;预血管化可以明显增强支架植入早期的血管化。

关键词：预血管化聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物支架血管化

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预血管化细胞膜片的构建

中国细胞生物学学报 2014年第3期36卷 338-342页

作者：任利玲刘斌马东洋冯玉霞陈佳兰州大学口腔医学院兰州730000 兰州军区兰州总医院口腔颌面外科兰州730052

为探索新的体外获得毛细血管样网络结构来解决工程化组织预血管化的问题,该研究将人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)以9×104/cm2细胞密度体外连续培养形成细胞膜片,将培养的脐静脉血内皮细胞(human umbilical ve... 详细信息

为探索新的体外获得毛细血管样网络结构来解决工程化组织预血管化的问题,该研究将人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)以9×104/cm2细胞密度体外连续培养形成细胞膜片,将培养的脐静脉血内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)以5×104/cm2细胞密度接种到上述间充质干细胞膜片上,并培养在内皮细胞培养介质中。在设计的时间点用倒置相差显微镜观察,发现内皮细胞在膜片上迁移,细胞重排,膜片上的基质蛋白也发生重排,导致微槽和空泡出现。CD31免疫荧光染色观察到进行性管腔形成的过程;CD90免疫荧光染色显示膜片上的hMSCs围绕着HUVECs周边排列,说明hMSCs作为周细胞支持了HUVECs的生长;在培养第10 d可见少量的α-SMA的表达,暗示着在此种培养模式下,hMSCs具有较低的向肌细胞分化的潜能。这些结果表明,将内皮细胞接种在未分化干细胞膜片上,可以在体外形成具有血管网络结构的预血管化膜片,为构建血管化工程化组织提供了新的思路。

关键词：预血管化内皮细胞骨髓间充质干细胞细胞膜片

预血管化组织工程神经修复周围神经缺损的研究

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中华手外科杂志 2014年第3期30卷 216-219页

作者：蒋良福陈鸥虞庆褚庭纲丁健李志杰温州医科大学附属第二医院手外科浙江省医学重点学科325027

目的评价预血管化去细胞神经整合自体定向分化脂肪间充质干细胞修复周围神经缺损的效果。方法取大鼠腹股沟脂肪组织分离间充质干细胞，同时将血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）纳米微囊显微注入化学去细胞... 详细信息

目的评价预血管化去细胞神经整合自体定向分化脂肪间充质干细胞修复周围神经缺损的效果。方法取大鼠腹股沟脂肪组织分离间充质干细胞，同时将血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）纳米微囊显微注入化学去细胞神经，植入取脂肪创口内预血管化。采用神经诱导剂将脂肪间充质干细胞定向诱导分化为类雪旺细胞，2周后植入预血管化的去细胞神经修复自体大鼠15mm坐骨神经缺损为A组（实验组）；去细胞神经植入体内预血管化移植自体诱导分化的脂肪间充质干细胞，但不加VEGF纳米微囊为B组（对照组）；化学去细胞神经移植自体诱导分化的脂肪干间充质细胞为C组；自体神经移植组为D组；VEGF纳米微囊预血管化组为E组。术后第7天取A、B、C组移植神经，检测微血管密度，并用TUNEL法检测细胞凋亡情况。术后12周测各组肌电图、小腿三头肌湿重恢复率以及轴突计数评价其修复周围神经缺损的效果。结果术后第7天C组大部分细胞凋亡，凋亡率最高，A组细胞凋亡率低于B组，微血管密度A组〉B组〉C组。术后12周，A组神经传导速度、动作电位波幅，小腿三头肌湿重恢复率以及有髓神经轴突数量高于B、C、E组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论去细胞神经预血管化能提高移植细胞存活率，具有明显的促进神经再生作用。

关键词：神经再生干细胞,间充质预血管化去细胞神经

基于兔BMSCs预血管化细胞膜片的体外构建

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中国修复重建外科杂志 2014年第10期28卷 1278-1283页

作者：冯玉霞汪洋李琴马东洋任利玲兰州大学口腔医学院口腔医院正畸科兰州730000 兰州军区兰州总医院口腔颌面外科

目的探讨构建预血管化细胞膜片新方法的可行性。方法取3周龄日本大耳白兔分离培养BMSCs,并在VEGF和bFGF作用下诱导其向血管内皮样细胞(endothelial like cells,ECs)分化(实验组),以未诱导细胞作为对照组,倒置显微镜下观察细胞形貌,并行... 详细信息

目的探讨构建预血管化细胞膜片新方法的可行性。方法取3周龄日本大耳白兔分离培养BMSCs,并在VEGF和bFGF作用下诱导其向血管内皮样细胞(endothelial like cells,ECs)分化(实验组),以未诱导细胞作为对照组,倒置显微镜下观察细胞形貌,并行血管性假血友病因子(von Willebrand factor,vWF)及CD31免疫荧光染色观察。将第2代BMSCs以9×104个/cm2密度体外培养14 d形成未分化细胞膜片,将BMSCs诱导14 d获得的ECs以5×104个/cm2密度接种在细胞膜片上(A组)培养3、7、14 d,以单纯未分化的兔BMSCs膜片为B组,BMSCs诱导14 d获得的ECs单独培养为C组。倒置显微镜下观察血管网络形成,并行CD31免疫荧光染色及组织学观察。结果原代BMSCs呈长梭形;诱导分化后细胞形态发生改变,呈"铺路石"样。实验组vWF及CD31免疫荧光染色均呈阳性,而对照组均呈阴性。A组BMSCs诱导14 d后的ECs接种至未分化的BMSCs膜片上3、7、14 d后,细胞形态发生改变,镜下可见空泡样、网状结构形成;CD31免疫荧光检测显示了进行性管腔形成过程;HE染色显示了微血管管腔的形成。B、C组未观察到类似改变。结论 BMSCs在合适条件下可诱导形成ECs;将由BMSCs诱导分化形成的ECs接种至未分化BMSCs膜片上,可在体外形成具有血管网络结构的预血管化膜片,为工程化血管组织构建提供了新方法。

关键词：细胞膜片预血管化 BMSCs 血管内皮样细胞兔

预血管化细胞膜片复合GelMA水凝胶伤口敷料的构建及其基础应用的研究

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预血管化细胞膜片复合GelMA水凝胶伤口敷料的构建及其基础应用的...

作者：李小安兰州大学

学位级别：硕士

目的:本实验采用细胞膜片技术以及甲基丙烯酸明胶(GelMA)构建预血管化伤口敷料,将其作用于裸鼠的皮肤缺损处,观察该敷料对伤口愈合的影响,为临床中皮肤损伤的修复提供一种新的治疗思路。方法:1)预血管化细胞膜片的构建及表征:提取兔骨... 详细信息

目的:本实验采用细胞膜片技术以及甲基丙烯酸明胶(GelMA)构建预血管化伤口敷料,将其作用于裸鼠的皮肤缺损处,观察该敷料对伤口愈合的影响,为临床中皮肤损伤的修复提供一种新的治疗思路。方法:1)预血管化细胞膜片的构建及表征:提取兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),传代培养至P2代备用;运用MTT法测定兔BMSCs的生长曲线;检测兔BMSCs的多向分化能力;培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs);高密度接种兔BMSCs到培养皿培养10天后,接种HUVECs共培养5天,免疫荧光染色观察预血管化的细胞膜片内I型胶原的形成情况。2)预血管化细胞膜片复合GelMA水凝胶敷料的构建:光交联制备甲基丙烯酸明胶并利用FTIR、XRD等对其理化性质进行表征,将预血管化细胞膜片进行折叠至三层并与GelMA水凝胶共培养构建预血管化伤口敷料。3)预血管化敷料运用于裸鼠伤口愈合的实验:构建裸鼠全层皮肤缺损模型,将构建的预血管化敷料作用于裸鼠伤口,分别在第1天、第7天、第14天观察伤口愈合情况,并提取伤口处组织样品进行组织学染色,研究此敷料对宿主伤口愈合的影响。结果:1)倒置光学显微镜下可观察到兔BMSCs呈长梭形,MTT实验结果示兔BMSCs的生长曲线成“S”形;多向分化实验结果示兔BMSCs具有向成脂、成骨、成软骨细胞分化的能力;免疫荧光染色发现BMSCs膜片中细胞含量较高,细胞外基质丰富,细胞与细胞之间连接存在,含有大量的I型胶原纤维;在预血管化细胞膜片上,HUVECs在水平、垂直方向上均发生迁移并在BMSCs上形成网络结构。结果表明,BMSCs膜片为HUVECs的生长和迁移提供了3D环境。2)FTIR结果表明甲基丙烯酸对明胶蛋白骨架结构没有显着影响,BMSCs在GelMA水凝胶的细胞相容性实验中表现出较高的成活率。3)裸鼠背部预血管化构建体移植成功,实验组愈合速度快于对照组;免疫组织化学染色进一步显示,在预血管化构建体中体外预先形成的微血管结构与宿主脉管系统发生吻合。结论:实验结果表明由预血管化干细胞膜片与GelMA水凝胶构建的新型皮肤敷料在免疫缺陷鼠的皮肤缺损修复再生实验中显示出具有促进伤口愈合的功能,但仍需大量的基础实验及临床研究进一步探究其促进伤口愈合的机制。

关键词：甲基丙烯酸明胶预血管化细胞膜片伤口愈合

β-TCP\HIF-1α缓释复合体对预血管化膜片内皮血管网形成的影响

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β-TCP\HIF-1α缓释复合体对预血管化膜片内皮血管网形成的影响

作者：张丹兰州大学

学位级别：硕士

本研究欲将不同浓度下的缺氧诱导因子-1α(hypoxia induced factor-1α,HIF-1α)和支架材料β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)复合形成缓释复合体。一方面,研究不同浓度下的β-TCP\HIF-1α缓释复合体对人脐静脉内皮细胞(huma... 详细信息

本研究欲将不同浓度下的缺氧诱导因子-1α(hypoxia induced factor-1α,HIF-1α)和支架材料β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)复合形成缓释复合体。一方面,研究不同浓度下的β-TCP\HIF-1α缓释复合体对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的招募和迁移作用;另一方面,基于预血管化的细胞膜片技术(cell sheet technology,CST),研究不同浓度下的β-TCP\HIF-1α缓释复合体对内皮血管网形成的作用和影响,以期为优化构建稳定而丰富的三维预血管化网络的工程骨组织提供进一步的理论指导。方法:(1)β-TCP\HIF-1α缓释复合体的构建:将HIF-1α配成浓度为50,100,200mg/L的溶液,无菌过滤分装。将高温高压烘干后的β-TCP支架材料放入HIF-1α溶液中浸泡备用(浸泡3天);HIF-ELISA试剂盒用于各实验组不同时间点缓释能力的检测。(2)HUVECs迁移实验和预血管化的fBMSCs膜片的构建:胎儿骨髓间充质干细胞(fetal bone marrow mesenchymal stem cell,fBMSCs)和HUVECs的培养扩增;Transwell迁移实验检测不同浓度梯度下的β-TCP\HIF-1α缓释复合体(0,50,100,200mg/L)和单纯100mg/L的HIF-1α对HUVECs的招募和迁移,经染色处理、显微拍照后软件计数,统计学分析各组差异性。将fBMSCs按9×104个/cm2的密度置于六孔板内进行成膜培养14天(fBMSCs膜片);HUVECs按5×104个/cm2的密度播种至fBMSCs膜片上进行体外预血管化的构建;大体观、显微镜观察获取膜片特征。(3)β-TCP\HIF-1α缓释复合体对预血管化的fBMSCs膜片内皮血管网形成的影响:将单纯的β-TCP支架组、β-TCP\HIF-1α缓释组(50,100,200mg/L)和100mg/L的单纯HIF-1α因子组,分别放入育有预血管化的fBMSCs膜片的六孔板中,分别在实验的第1,3,7,14天进行CD31免疫荧光染色检测,观察不同实验组中内皮血管网形成的情况。结果:(1)β-TCP\HIF-1α缓释复合体均在第三天缓释浓度达到高峰,后期逐渐降低;21天后,各组的累积释放率均>85%。(2)fBMSCs呈长梭形、HUVECs呈“铺路石”般卵圆形。fBMSCs经14天连续培养可形成一层完整而菲薄的fBMSCs膜片,边缘向内卷曲,可用镊子沿边缘提起。(3)Transwell实验证实HIF-1α具有体外招募和迁移HUVECs的作用,且以100mg/L HIF-1α组作用最为显著(P预血管化的fBMSCs膜片内皮血管网形成的影响结果显示,200mg/L的β-TCP\HIF-1α缓释复合体组(第7天)和100mg/L的HIF-1α组(第3天)形成的预血管化网络数量最多(P血管网的形成。

关键词：细胞膜片技术预血管化缺氧诱导因子-1α β-TCP 缓释