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作者：姚雪娜江南大学

学位级别：硕士

顺式-3-羟基-L-脯氨酸(顺式-3-羟脯氨酸)能够用于合成很多抗癌药物,具有重要的商业价值,但其在自然界中含量极为稀少,各国研究者都在寻找一种经济有效的获取顺式-3-羟脯氨酸的方法。来源于链霉菌TH1的脯氨酸-3-羟化酶可以直接在游离的L... 详细信息

顺式-3-羟基-L-脯氨酸(顺式-3-羟脯氨酸)能够用于合成很多抗癌药物,具有重要的商业价值,但其在自然界中含量极为稀少,各国研究者都在寻找一种经济有效的获取顺式-3-羟脯氨酸的方法。来源于链霉菌TH1的脯氨酸-3-羟化酶可以直接在游离的L-脯氨酸第三位碳原子上加羟基,生成顺式-3-羟脯氨酸。本研究通过目的基因优化设计,重组大肠杆菌的构建,发酵优化等策略,使脯氨酸-3-羟化酶基因(P3H)在大肠杆菌中大量表达,实现L-脯氨酸高效转化为顺式-3-羟脯氨酸。脯氨酸-3-羟化酶基因的密码子偏好性与大肠杆菌相差较大,通过同义替换、m RNA二级结构优化和酶切位点设计进行基因优化。优化后的脯氨酸-3-羟化酶基因与优化前的相比,改变了187个碱基,GC含量由原来的64.83%降低到49.31%,密码子适用指数CAI值从最初的0.331变为0.998,更接近于最优值1,优化后的目的基因序列进行全基因合成,并整合至载体p ES上。为避免异源表达时诱导剂的使用,引入组成型启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2),构建重组质粒p ES-Ptrp2-P3H。为提高脯氨酸-3-羟化酶的表达量以及顺式-3-羟脯氨酸的产率,对宿主菌和质粒进行了优化,寻找最适合表达脯氨酸-3-羟化酶的组合,结果表明,重组大肠杆菌BL21(DE3)/p ET21a-Ptrp2-P3H的全细胞酶活最高,达到722.8 U/g,与Mori等的研究结果相比,酶活提高了约7倍。初步摇瓶结果显示,重组大肠杆菌BL21(DE3)/p ET21a-Ptrp2-P3H发酵24 h能够产生约0.4 g/L的顺式-3-羟脯氨酸。采用单因素实验和正交实验进行分析,重组大肠杆菌在最优的摇瓶发酵培养条件下(1.5%葡萄糖,0.125%甘油,1.6%胰蛋白胨,0.05%(NH4)2SO4,0.05%K2HPO4,0.2%Na Cl,0.5 m M Fe SO4,0.5%Mg SO4,0.015%Ca Cl2,0.1 m M L-抗坏血酸,p H7.5,30oC)能“一步法”原位合成顺式-3-羟脯氨酸,发酵24 h能够累积约0.8 g/L的顺式-3-羟脯氨酸,是优化前产量的2倍多,这为进一步开展顺-3-羟脯氨酸产业化放大提供了依据。为进一步降低生产成本,考虑在分子水平上引入底物L-脯氨酸代谢中的关键酶基因pro BA’,成功构建以葡萄糖为底物生产顺式-3-羟脯氨酸的重组大肠杆菌JM109/p ET21a-Ptrp2-pro BA’-Ptrp2-P3H和分别含pro BA’和P3H基因的双质粒共表达菌株JM109。在无外源L-脯氨酸的发酵培养基中,JM109/p ET21a-Ptrp2-pro BA’-Ptrp2-P3H能够产生约104.6 mg/L的顺式-3-羟脯氨酸,双质粒共表达菌株JM109能够产生约63.4 mg/L的顺式-3-羟脯氨酸。这也证实了利用微生物转化法以葡萄糖为底物生产顺式-3-羟脯氨酸的可行性。

关键词：脯氨酸-3-羟化酶顺式-3-羟脯氨酸密码子优化重组菌构建发酵优化

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产3-羟脯氨酸重组菌的构建及发酵优化

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食品与生物技术学报 2017年第3期36卷 243-251页

作者：姚雪娜张震宇孙付保陈昶黄建华沈松江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

顺式-3-羟基-L-脯氨酸(顺式-3-羟脯氨酸)可用于合成多种抗癌药物,具有重要的商业价值,目前大多通过添加IPTG来诱导表达脯氨酸-3-羟化酶,采用两步法生物合成顺式-3-羟脯氨酸。作者通过目的基因优化设计,引入强启动子色氨酸串联启动子(Ptr... 详细信息

顺式-3-羟基-L-脯氨酸(顺式-3-羟脯氨酸)可用于合成多种抗癌药物,具有重要的商业价值,目前大多通过添加IPTG来诱导表达脯氨酸-3-羟化酶,采用两步法生物合成顺式-3-羟脯氨酸。作者通过目的基因优化设计,引入强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)来避免异源表达时的诱导剂使用,构建重组质粒p ES-Ptrp2-P3H,成功构建了重组大肠杆菌BL21(DE3)/p ET21a-Ptrp2-P3H,优化后的脯氨酸-3-羟化酶基因(P3H)改变了168个碱基,GC含量由原来的64.83%降低到49.31%。该菌在初步优化培养基(葡萄糖1 g/d L,甘油0.125 g/d L,胰蛋白胨1.6 g/d L,(NH_4)_2SO_40.5 g/d L,K_2HPO_40.1 g/d L,NaCl 0.2 g/d L,FeSO_41 mmol/L,MgSO_40.5 g/d L,CaCl_20.015 g/d L,脯氨酸10 g/L,pH 7.5)上能一步法原位合成顺式-3-羟脯氨酸,摇瓶发酵24 h,产量0.8 g/L,比优化前提高一倍以上,为进一步开展顺-3-羟脯氨酸产业化提供了依据。

关键词：脯氨酸-3-羟化酶顺式-3-羟脯氨酸密码子优化重组菌构建发酵优化

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