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华南农业大学学报 2024年第4期45卷 469-476页

作者：叶欣欧璇黄仪娟陆肖翁亚彪林瑞庆华南农业大学兽医学院广东广州510642 佛山市正典生物技术有限公司广东佛山528138

[目的]预测分析猪等孢球虫顶膜抗原蛋白AMA1的生物学特性、结构及功能,并构建AMA1基因的原核表达载体,表达、纯化AMA1蛋白。[方法]本研究从NCBI数据库中获得猪等孢球虫AMA1基因序列,使用相关生物信息学预测工具对AMA1基因编码的蛋白进... 详细信息

[目的]预测分析猪等孢球虫顶膜抗原蛋白AMA1的生物学特性、结构及功能,并构建AMA1基因的原核表达载体,表达、纯化AMA1蛋白。[方法]本研究从NCBI数据库中获得猪等孢球虫AMA1基因序列,使用相关生物信息学预测工具对AMA1基因编码的蛋白进行分析。构建原核表达载体pET23a-AMA1,并将其转入至大肠埃希菌表达菌株BL21 (DE3)中,对诱导时间、温度及IPTG浓度进行优化,确定最佳诱导表达条件。采用镍柱亲和层析法进行蛋白纯化,获得AMA1重组蛋白并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定分析。[结果]生物信息学预测显示,AMA1蛋白由317个氨基酸组成,蛋白分子式为C1 512H2 310N394O490S14,是不稳定的亲水性蛋白;其二级结构α螺旋占17.74%,β折叠占30.65%,转角占30.65%,无规则卷曲占20.96%;属于无信号肽的跨膜蛋白,具有5个B细胞抗原表位。成功构建pET23a-AMA1重组表达质粒,经诱导表达条件优化后,确定最佳诱导表达条件为0.2 mmol/L IPTG浓度下于28℃诱导12 h,主要以可溶性蛋白形式存在,蛋白相对分子质量约为25 800,纯化蛋白质量浓度为0.25 mg/mL。[结论]阐明了猪等孢球虫AMA1蛋白的结构特征,通过原核诱导表达获得了重组蛋白,为建立猪等孢球虫病的免疫学诊断方法奠定了基础,并为后续疫苗的研发提供了新的候选基因。

关键词：猪等孢球虫顶膜抗原 AMA1 原核表达生物信息学

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顶膜抗原在柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞中功能研究

顶膜抗原在柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞中功能研究

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作者：王青杰中国农业科学院

学位级别：硕士

鸡球虫病是由艾美耳属(Eimeria)球虫感染引起的一种肠道疾病,该病给全世界家禽业造成严重的经济损失。当前防治球虫病的主要方法是抗球虫药和疫苗的使用,但由于抗球虫药物耐药性的产生和疫苗生产成本高等问题,因此,需要制定新的控制策... 详细信息

鸡球虫病是由艾美耳属(Eimeria)球虫感染引起的一种肠道疾病,该病给全世界家禽业造成严重的经济损失。当前防治球虫病的主要方法是抗球虫药和疫苗的使用,但由于抗球虫药物耐药性的产生和疫苗生产成本高等问题,因此,需要制定新的控制策略。子孢子和裂殖子入侵宿主细胞是球虫建立感染的关键,阻断虫体入侵是防治球虫病的有效方法。顶膜抗原(Apical membrane antigens,AMAs)是顶复门原虫中一类高度保守的微线蛋白,在虫体入侵宿主细胞过程中发挥重要的功能。近年来研究发现,柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,Et)具有4个AMA同源分子(AMA1-4)。在前期研究中,我们发现柔嫩艾美耳球虫AMA1(EtAMA1)(ToxoDB登录号:ETH0007745)是子孢子入侵宿主的关键蛋白,能与柔嫩艾美耳球虫保守的假想蛋白(Hypothetical proein,conserved,EtCHP317)、棒状体颈部蛋白2(Rhoptry Neck Protein 2,EtRON2)发生互作,但具体机制尚不明确。本研究拟在此基础上,对EtAMA1的特性与功能做进一步的研究,同时,对EtAMA1的2个同源分子——EtAMA2(ETH00048600)和Et AMA3(ETH0017730)的特性和功能进行了初步研究,为阐明AMAs蛋白在球虫入侵过程中的功能与作用机制奠定基础。1.柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1特性与功能的进一步研究利用分泌试验、间接免疫荧光共定位、入侵试验以及iTRAQ分析等方法对柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1相关特性和功能做进一步的研究。结果显示,该蛋白是由微线体分泌的且受温度和胎牛血清(FCS)的调控。EtAMA1、EtCHP317和EtRON2三种蛋白在虫体中的分布基本相同。EtAMA1、EtCHP317和EtRON2抗体处理组的子孢子入侵抑制率分别为40.9%、33.1%、41.1%。而将EtAMA1与EtCHP317抗体、EtAMA1与抗EtRON2抗体以1:1比例混合后再处理子孢子,入侵抑制率仅为21%、21.3%。将重组质粒pcDNA3.1-(+)-flag-EtAMA1转染DF-1细胞后,入侵率显著高于空白对照组。iTRAQ共鉴定到163个差异蛋白,其中上调蛋白91个、下调蛋白72个。研究结果为阐明EtAMA1在球虫入侵宿主细胞中发挥重要作用的分子机制奠定基础。2.柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原2特性与功能初步分析利用间接免疫荧光试验、入侵抑制试验、实时荧光定量PCR、Western blotting以及分泌试验等方法研究了柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原2(EtAMA2)的分子特性与功能。结果发现EtAMA2是一种I型内在膜蛋白(type I integral membrane protein),具一个跨膜区和信号肽。Et AMA2与其他EtAMAs相比,在结构域DI和DII中半胱氨酸残基的数量相同(10个),在DIII中具有与EtAMA1相同的半胱氨酸残基数量(6个),其中5个位置相同,1个不同。EtAMA2在子孢子和第二代裂殖子中的转录水平明显高于未孢子化卵囊和孢子化卵囊,但蛋白仅在第二代裂殖子中被检测到;在游离的子孢子和第二代裂殖子中主要分布在胞质,在胞内的子孢子中主要分布在顶端。EtAMA2是一种微线体分泌蛋白,其分泌受到温度的调控。抗EtAMA2特异性抗体对子孢子入侵细胞没有明显抑制作用;将EtAMA2转染至DF-1细胞后,子孢子入侵率与空白对照组没有显著性差异。对第二代裂殖子入侵宿主细胞进行了筛选,结果发现其可入侵CEF和MDCK细胞。研究结果表明,EtAMA2是一种裂殖子阶段调控表达蛋白,对子孢子入侵宿主细胞无显著性影响,其在裂殖子中功能有待进一步研究。3.柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原3特性与功能初步分析利用间接免疫荧光试验、入侵抑制试验、实时荧光定量PCR、Western blotting以及分泌试验等方法研究了柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原3(EtAMA3)的分子特性与功能。结果发现EtAMA3是一种I型内在膜蛋白,具一个跨膜区和信号肽,与其他EtAMAs具有24.31%-38.45%的同源性。EtAMA3与其他EtAMAs相比,在结构域DI和DII中半胱氨酸残基的数量相同(10个),但在DIII中缺乏6个在EtAMA1中具有的半胱氨酸残基。EtAMA3在子孢子阶段转录水平最高,在未孢子化卵囊和第二代裂殖子阶段转录水平最低;蛋白只在孢子化卵囊和子孢子中被检测到;EtAMA3在游离的子孢子中主要分布在胞质,在胞内的子孢子中主要分布在顶端。EtAMA3是一种微线体分泌蛋白,其分泌受到FCS的调控。抗EtAMA3特异性抗体在浓度为300μg/mL时对子孢子入侵细胞有明显抑制作用;将EtAMA3转染至DF-1细胞后,子孢子入侵

关键词：柔嫩艾美耳球虫子孢子裂殖子顶膜抗原入侵

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猪等孢球虫顶膜抗原AMA1蛋白的生物信息学分析及原核表达

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华南农业大学学报 2024年

作者：叶欣欧璇黄仪娟陆肖翁亚彪林瑞庆华南农业大学兽医学院佛山市正典生物技术有限公司

【目的】预测分析猪等孢球虫AMA1蛋白的生物学特性、结构及功能，并构建AMA1基因的原核表达载体，表达、纯化AMA1蛋白。【方法】本研究从NCBI数据库中获得猪等孢球虫AMA1基因序列，使用相关生物信息学预测工具对AMA1基因编码的蛋白进行... 详细信息

【目的】预测分析猪等孢球虫AMA1蛋白的生物学特性、结构及功能，并构建AMA1基因的原核表达载体，表达、纯化AMA1蛋白。【方法】本研究从NCBI数据库中获得猪等孢球虫AMA1基因序列，使用相关生物信息学预测工具对AMA1基因编码的蛋白进行分析。构建原核表达载体pET23a-AMA1，将其转入至大肠埃希菌表达菌株BL21 (DE3)中，对诱导时间、温度及IPTG浓度进行优化，确定最佳诱导表达条件。采用镍柱亲和层析法进行蛋白纯化，获得AMA1重组蛋白并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定分析。【结果】生物信息学预测显示，AMA1蛋白由317个氨基酸组成，蛋白分子式为C1512H2310N394O490S14，是不稳定的亲水性蛋白；其二级结构α螺旋占17.74%，β折叠占30.65%，转角占30.65%，无规则卷曲占20.96%；属于无信号肽的跨膜蛋白，具有多个B细胞抗原表位。同时，成功构建pET23a-AMA1重组表达质粒，经诱导表达条件优化后，确定最佳诱导表达条件为0.2 mmol/L IPTG浓度下28 ℃诱导12 h，主要以可溶性蛋白形式存在，蛋白大小约为25 800，纯化出蛋白质量浓度为0.25 mg/mL。【结论】本研究结果阐明了猪等孢球虫AMA1蛋白的结构特征以及通过原核诱导表达获得了重组蛋白，为建立猪等孢球虫病的免疫学诊断方法奠定了基础，为后续疫苗的研发提供了新的候选基因。

关键词：猪等孢球虫顶膜抗原 AMA1 原核表达生物信息学

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柔嫩艾美耳球虫AMA1蛋白多克隆抗体的制备及在乳酸乳球菌中的表达

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中国兽医科学 2015年第11期45卷 1130-1135页

作者：王芬马春丽马德星张跃黄宇晨潘龙高铭扬洪琴杨贵君康健东北农业大学动物医学学院江苏南京210095 东北农业大学食品学院黑龙江哈尔滨150030 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

将柔嫩艾美耳球虫子孢子顶膜抗原AMA1胞外域基因片段(EtAMA1)克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组质粒pET-30a(+)-EtAMA1。质粒经鉴定正确后转化入大肠杆菌中筛选阳性菌,阳性菌经IPTG诱导后采用Western-blot检测目的蛋白的表达情... 详细信息

将柔嫩艾美耳球虫子孢子顶膜抗原AMA1胞外域基因片段(EtAMA1)克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组质粒pET-30a(+)-EtAMA1。质粒经鉴定正确后转化入大肠杆菌中筛选阳性菌,阳性菌经IPTG诱导后采用Western-blot检测目的蛋白的表达情况。用表达的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。应用间接ELISA测定抗体效价,并采用Western-blot检测抗体特异性。将EtAMA1克隆入乳酸菌表达载体pTX8048中构建阳性质粒pTX8048-EtAMA1,质粒电转化入宿主菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000中筛选阳性菌*** NZ9000。阳性菌经Nisin诱导后采用Western-blot检测目的蛋白的表达情况。结果表明,EtAMA1在大肠杆菌中以包涵体形式表达。多克隆抗体的效价为218。Western-blot检测证实,制备的抗体可与子孢子反应。重组菌*** NZ9000经Nisin诱导后,采用Western-blot检测到约61ku的目的蛋白。上述研究结果为基于EtAMA1的鸡球虫病乳酸菌口服疫苗的研制提供了重要参考。

关键词：柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原多克隆抗体乳酸乳球菌

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柔嫩艾美耳球虫EtRON2同源分子和EtAMA4特性与功能研究

柔嫩艾美耳球虫EtRON2同源分子和EtAMA4特性与功能研究

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作者：刘曼玉中国农业科学院

学位级别：硕士

由艾美耳属（Eimeria）球虫引起的鸡球虫病给家禽业带来严重的经济损失。顶膜抗原（apical membrane antigens,AMAs）和棒状体颈部蛋白2（Rhoptry neck protein2,RON2）在顶复门原虫中高度保守,相互作用形成复合物（AMA-RON2）,分布于... 详细信息

由艾美耳属（Eimeria）球虫引起的鸡球虫病给家禽业带来严重的经济损失。顶膜抗原（apical membrane antigens,AMAs）和棒状体颈部蛋白2（Rhoptry neck protein2,RON2）在顶复门原虫中高度保守,相互作用形成复合物（AMA-RON2）,分布于运动连接环（Moving junction,MJ）,在球虫入侵宿主细胞的过程中起了重要的作用。柔嫩艾美耳球虫（***,Et）在特定发育阶段调控表达4个AMA分子和4个RON2分子,前期研究表明,EtAMA1、EtAMA2、EtAMA3和EtRON2蛋白在球虫入侵宿主的过程中起了关键性的作用,而缺乏对其他同源分子的研究。本研究对EtRON2的3个同源分子—EtRON2、EtRON2、EtRON2以及1个EtAMA1同源分子—EtAMA4的特性和功能进行初步研究,为探究球虫入侵机制和寻找控制鸡球虫病的关键分子奠定基础。***2、EtRON2、EtRON2和EtAMA4基因的克隆、原核表达利用PCR扩增技术从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊中克隆了EtRON2、EtRON2、EtRON2和EtAMA4基因的序列片段,生物信息学显示,4个基因编码的蛋白分别是246个、630个、645个、667个氨基酸,预测分子量为27.0 k Da、69.3 k Da、70.95 k Da、73.37 k Da,均无信号肽和跨膜结构域。EtRON2、EtRON2、EtRON2氨基酸序列与常规EtRON2的同源性仅为23.46%-29.69%,EtAMA4氨基酸序列与常规EtAMA1之间无同源性。构建了原核表达质粒p GEX-4T-2-EtRON2、p Cold I-EtRON2、p Cold I-EtRON2、p GEX-4T-1-EtAMA4,并表达、纯化了重组蛋白,为后续的特性与功能研究奠定基础。***2、EtRON2、EtRON2和EtAMA4基因的特性与功能初步分析利用RT-PCR、IFA、免疫印迹和中和实验等方法对EtRON2、EtRON2、EtRON2和EtAMA4特性和功能进行初步研究。结果显示EtRON2、EtRON2、EtRON2、EtAMA4分别在孢子化卵囊、第二代裂殖子、第二代裂殖子、子孢子中的转录水平最高,而蛋白水平分别在子孢子、第二代裂殖子、子孢子和第二代裂殖子、第二代裂殖子中最高;定位发现,EtRON2、EtRON2、EtRON2蛋白在虫体中的分布基本相同,在游离的子孢子和第二代裂殖子中主要分布于胞质中,而在入侵细胞后子孢子中主要分布于虫体顶端表面,EtAMA4主要分布于游离子孢子的一端,游离第二代裂殖子的胞质,而在入侵细胞后子孢子中主要分布于虫体顶端。4种蛋白的抗体均可影响子孢子的入侵能力,其中50-400μg/m L r EtRON2、200-400μg/m L r EtRON2、100-400μg/m L r EtRON2、300-400μg/m L r EtAMA4抗体均可明显抑制子孢子的入侵。3.柔嫩艾美耳球虫EtRON2s与EtAMAs互作关系的验证为了验证EtAMAs与相应的EtRONs之间预测的互作关系,我们利用PCR扩增EtRON2、EtRON2、EtRON2、EtAMA3、EtAMA4基因,利用一步克隆法将PCR产物克隆至Bi FC的真核表达载体,构建了真核表达质粒p Bi FC-VC155-EtRON2、p Bi FC-VC155-EtRON2、p Bi FC-VC155-EtRON2、pBiFC-VN155-EtAMA4和pBiFC-VN155-EtAMA3。将质粒转染BHK细胞,经间接免疫荧光鉴定,均可在BHK细胞中成功表达。分别将p Bi FC-VC155-EtRON2和p Bi FC-VN155-EtAMA4、p Bi FC-VC155-EtRON2和p Bi FC-VN155-EtAMA4、p Bi FC-VC155-EtRON2和p Bi FC-VN155-EtAMA3共转染BHK细胞,同时设置阳性和阴性对照组,结果显示实验共转染组和阳性对照组的都产生了绿色荧光,而阴性对照组无荧光,表明EtRON2与EtAMA4、EtRON2与EtAMA4、EtRON2与EtAMA3之间存在相互作用关系。4.真核重组质粒pCAGGS-EtRON2和pCAGGS-EtRON2的免疫效果评价利用一步克隆法将EtRON2、EtRON2的PCR产物克隆至真核表达载体,构建了真核表达质粒p CAGGS-EtRON2和p CAGGS-EtRON2,将质粒转染BHK细胞,经间接免疫荧光鉴定,都可以在细胞中表达。分别用真核重组质粒p CAGGS-EtRON2和p CAGGS-EtRON2免疫雏鸡2次后,用剂量为1×10

关键词：球虫病柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白顶膜抗原蛋白互作

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